Etude de toxines - ponts disulfure Sommaire

"ExPASy Proteomics tools" : ensemble d'applications pour l'analyse de séquences peptidiques.

"Sequence Manipulation Suite" : ensemble d'applications Java pour l'analyse de séquences d'ADN et de protéines.

1. Analyse de la kappa - bungarotoxine de Bungarus multicinctus

Aller au NCBI. Rechercher les données pour "multicinctus mRNA kappa-bungarotoxin" dans "All databases".

Combien de fichiers de nucléotides et de protéines obtient-on ?
Choisir "Nucleotide" puis "Y11768".
Quelle est la longueur en nucléotides de la séquence codante ("CDS") ?
Quel codon stop est employé ?
nucléotides : 3 / 2 protéines : 2
(332 - 277) + (1496 - 1397) + 2143 - 2033) = 264 nucléotides
TAA
Faire un schéma du gène ("TATA box", introns et exons avec leur position) sur la base des données de ce fichier.
Quelle est la séquence du signal "TATA" ?
Quels sont les mots clés de l'ontologie associés à cette molécule ?
schéma
ontologie
QuickGO
Voir un rappel sur l'ontologie.

Revenir à la page de résultats de "Nucleotide"et cliquer sur le lien "Y08721". Décrire les informations contenues dans ce fichier.

Cliquer sur le lien "FASTA". De quoi s'agit-il ? FASTA : format de fichier
FASTA : programme d'alignement

Copier / coller et enregistrer la séquence "FASTA" dans un éditeur de texte.

1mRNA


Aller au site "ExPASy Proteomics Server".

Cliquer sur le lien "Proteomics". Dans le menu de droite, choisir "Translate". Coller la séquence FASTA dans la fenêtre et lancer l'application.

  • Que fait ce programme ?
  • Que signifie "5'3' Frame 1", "5'3' Frame 2", ... ?
  • Quelle traduction vous semble correcte ?

Attention : si les traductions semblent peu plausibles, revenir à la fenêtre de soumission, supprimer tout le texte qui n'est pas la séquence proprement dite (">gi|1620372|em...") et refaire la traduction.

Aller au NCBI.

Rechercher les données pour "2NBT" dans "All databases".

Qu'obtient-on et pourquoi ?
Cliquer sur le lien "Structure: three-dimensional macromolecular structures" puis sur le lien "Neuronal Bungarotoxin, Nmr, 10 Structures". A quelle base de données accède-t-on ?

Dans le cadre "Molecules and interactions", cliquer sur "Show annotation".

Cliquer sur la barre rouge intitulée "snake_toxin".

Décrire le mode d'action de ce genre de toxine.
Décrire les particularités structurales.
Repérer des motifs conservés dans l'alignement proposé.

Revenir à la page précédente. Cliquer sur le lien "PDB ID: 2NBT" (petit cadre en haut à droite).

A quelle base de données accède-t-on ?
Par quelle méthode la structure de la toxine a-t-elle été résolue ?

Dans le menu "Display file" à côté de "2NBT" ouvrir le fichier "PDB format".

Rechercher la position des cystéines impliquées dans un pont disulfure ("SSBOND").

Noter les positions des ponts disulfure et les chaînes impliquées.

Revenir à la page précédente. Visualiser la molécule avec l'applet "Jmol" (si Java est installé sur la machine).
Quels sont les termes de l'ontologie (cadre "External Domain Annotations") associés à cette protéine ?

GO Terms

Revenir à la page précédente. Ouvir l'onglet bleu "Seq. Similarity" (ensemble d'onglets en haut de la page).

Choisir 40% dans "Cluster Sequence Similarity Cutoff" : Cluster 40%

Sélectionner les boutons radio 1TGX (GAMMA-CARDIOTOXIN) et de 2NBT (NEURONAL BUNGAROTOXIN).

Menu en haut "Select Comparison method" : choisir la méthode de comparaison "jFATCAT - rigid" qui lance l'applet "Jmol".

Commentez les résultats obtenus.


Revenir à la page d'accueil du NCBI.

Cliquer sur le lien "BLAST" (menu à droite).

A quelles applications servent les différents programme ?

Cliquer sur le lien "protein blast".

Coller la séquence FASTA "Chain A, Neuronal Bungarotoxin, Nmr, 10 Structures" (appelée aussi "2NBTA").

Dans la partie "Algorithm parameters" (en bas), modifier les paramètres du programme.

Lancer le programme.

Interpréter les résultats.

Choisir (en cochant les boutons radio) une dizaine de protéines avec des "E-value" les plus différentes possible.

Récupérer les séquences FASTA en cliquant sur "Get selected sequences".

Voir une description des programmes d'alignement BLAST

Voir la signification des paramètres : "E-value" et "P-value"


2. Alignements de séquences avec "ClustalW" : Voir une description simplifiée du principe de ClustalW

a. Illustration de la démarche de "ClustalW".

Aller au NCBI. Rechercher et enregistrer au format FASTA dans un fichier texte les séquences :

NP_001078901 NP_001157490 NP_000508 P02185 P02208 P02240

Fichier Séquences

De quelles protéines s'agit-il ?

De quels organismes sont-elles issues ?

Aller aux différents services proposés par EBI et choisir "ClustalW2".

Copier/coller les séquences précédentes au format FASTA dans la fenêtre. Garder les paramètres de base et lancer l'application ("Submit").

Cliquer sur l'onglet " Result summary" et lancer l'application "JalView ".

Menu : "Calculate", choisir "Calculate tree" et l'une des méthodes proposées.

Comparer avec l'illustration ci-contre.

Si l'application "JalView " n'est pas disponible voir l'arbre avec l'onglet "Guide tree".

Exemple de dendogramme

Refaire l'alignement en choisissant n'importe quelle matrice et en prenant des valeurs de paramètres pour les "gaps" fantaisistes par rapport aux valeurs par défaut (tableau ci-dessous) ?

Paramètre MATRIX Gap open End Gap Gap Ext Gap Dist
Valeur par défaut (protéines) Gonnet 10.0 -1 0.2 4

Quelle incidence celà a-t-il sur le résultat de l'alignement et pourquoi ?

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b. Application à la bungarotoxine

Faire l'alignement des séquences de bungarotoxine avec "ClustalW". Quelle conclusion tirez-vous ?
Avec "JalView ", décrire certaines des propriétés des acides aminés de la bungarotoxine.

2NBT-fasta

Quelle information n'avez-vous pas par rapport à la figure ci-contre ?

Celà a-t-il un sens de refaire l'alignement en modifiant les paramètres ?

Schema des ponts disulfure de la bungarotoxine de serpent

Ouvrez le fichier contenant la séquence FASTA de la toxine de Naja oxiana.

Refaire l'alignement de la séquence 2NBTA avec celle du Naja avec les paramètres par défaut de ClustalW.

Modifier les paramètres afin d'optimiser l'alignement si celà est possible. Pour celà, comparer aussi la valeur du score de l'alignement avec le lien "Tool Output" (fichier qui finit en ".output") dans "Result Summary".


c. Visualisation de la bungarotoxine (homodimère) - RMN - 10 structures

Code PDB : 2NBT

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

3. Analyse du précurseur de la bungarotoxine de Bungarus multicinctus

Aller à BLAST proposé par EBI.

Coller la séquence "Chain A, Neuronal Bungarotoxin, Nmr, 10 Structures" (appelée aussi "2NBTA") dans la fenêtre et lancer BLAST avec les autres valeurs par défaut.

  • Interpréter les premières lignes du tableau de résultats : "SP:NXL1_BUNMU... 5.0e-35"
  • Visualiser l'alignement en cliquant sur le bouton "Show Alignments".
  • Le choix de la matrice vous semble-t-il judicieux ?
  • La "E-value" est-elle modifiée avec la matrive PAM70 ?
Cliquer sur le lien "SP:NXL1_BUNMU".
  • Quelle est cette protéine ?
  • A quoi correspondent les 21 premiers acides aminés N-terminaux ?
  • Quelle est le contenu en structures secondaires ?
  • Y a-t-il des ponts disulfures ? Si oui, quelles sont les positions des Cys impliquées ?

Aller au NCBI. Rechercher les données pour "P01398". Enregistrer la séquence FASTA.
Aller au "SignalP 3.0 Server". Coller la séquence ou charger le fichier, lancer l'application.
Lire les informations "Output format".

Que recherche l'application "SignalP 3.0 Server" ?
Décrire les informations obtenues.
Le résultat obtenu confirme-t-il certaines conclusions précédentes ?

Refaire cette recherche avec l'application "Signal-BLAST".

Les résultats son-ils semblables ? Pourquoi ?

Refaire cette recherche avec l'application "PeptideCutter". Analyser les résultats.

Que recherche cette application ?


4. Recherche de motif spécifique des toxines

Aller à PROSITE Scan. Coller la séquence du précurseur de la toxine dans la fenêtre et lancer l'application.

Que recherche cette application ?
Un motif des toxines de serpent ressort-il ?

Aller à : "PDOC00245". Quel est le motif "signature" des toxines de serpents ?

Enregistrer le motif obtenu.

Snake toxins signature : G-C-x(1,3)-C-P-x(8,10)-C-C-x(2)-[PDEN]
Quel acide aminé particulier en fait partie ? Pourquoi ?


Aller à PHI-Blast ("Pattern Hit Initiated BLAST").

Ce programme prend en entrée une séquence requête protéique et un motif défini par une expression régulière. La syntaxe du motif est décrite à : "Rules for pattern syntax for PHI-BLAST".

PHI-Blast est adapté à la recherche de séquences protéiques qui contiennent un motif spécifié par l'utilisateur (fenêtre "PHI pattern" de la section "Algorithm") ET sont similaires à la séquence requête (fenêtre "Search") dans le voisinage proche du motif.

  • Coller la séquence du précurseur de la toxine dans la fenêtre "Enter accession number, gi, or FASTA sequence".
  • Dans la partie "Program Selection", choisir "PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated BLAST)" et coller le motif détecté pour les toxines de serpent selon la syntaxe de PROSITE.
  • Eventuellement, modifier les parmètres de l'algorithme "Algorithm parameters".
  • Lancer BLAST.

Dans la page des résultats :

Cliquer sur l'un des triangles rouges (ou sur le lien "snake_toxin", on obtient un grand nombre d'information).

Développer ([+]) les menus "List of domain hits" - lien "Snake_toxin".


Ouvrir ce fichier. Déterminer la nature de chaque protéine.

Faire le meilleur alignement possible avec "P01398" et mettre en évidence un acide aminé particulier probablement important pour la structure.

Chercher quelques séquences de toxines de plantes : crambine (Crambe hispanica) / thionine (Arabidopsis thaliana)

Retrouve-t-on le même genre de résultats ?


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