1. L'ion calcium et la calmoduline

2. Séquences nucléotidiques et polypeptidiques (primaires) de la calmoduline

3. Structures de la calmoduline

a. Caratéristiques générales de la structure tridimensionnelle

b. Le motif "EF - hand"

c. Structure de l'apo-calmoduline ou calmoduline non liée au calcium

d. Structure pleinement étendue de la calmoduline liée au calcium

e. Structure compacte de la calmoduline liée au calcium

4. Mécanismes de changement de conformation de la calmoduline

a. Mécanisme lors de la fixation coopérative du calcium

b. Mécanisme lors de l'interaction avec les protéines cibles

5. Protéines fixant le calcium

a. Exemples de complexes [calmoduline-protéine cible] et leurs rôles physiologiques

b. Les super-familles de protéines qui fixent le calcium

c. Calmoduline et protéines fixant la calmoduline chez les plantes

6. Mécanisme d'activation des pompes Ca²⁺-ATPases par la calmoduline

7. Liens Internet et références bibliographiques

1. L'ion calcium et la calmoduline

L'ion calcium (Ca²⁺) est le métal le plus abondant dans le corps humain (2 % du poids total).

Le calcium :

• joue un rôle important dans la coagulation du sang, la contraction musculaire, le relarguage de neurotransmetteurs, la mobilité du cytosquelette, ...
• est essentiel pour la formation des os, des dents, ...

Le rayon ionique du calcium est plus important que celui d'autres ions métalliques trouvés dans les organismes (Na⁺, K⁺, Mg²⁺).

Son enveloppe électronique lui permet d'établir 6 à 8 liaisons de coordination avec les protéines avec un bon degré de fléxibilité. Il se fixe donc fréquemment dans des "poches" constituées d'acides aminés acides ou polaires (Asp et Glu, Asn), ce qui ne contraint pas ou peu la conformation du squelette carboné.

Dans une cellule au repos, la concentration du calcium libre et d'environ 50 à 100 nM. Un stimulus externe peut induire une augmentation de la concentration à 10 µM.

L'ion calcium est un messager intracellulaire trés important.

• il intervient dans de nombresuses voies de transduction du signal et joue un rôle clé dans la régulation du métabolisme en contrôlant, directement ou indirectement, l'activité biologique de nombreuses protéines
• il se fixe à certaines protéines et cette fixation induit un changement de conformation de ces protéines

La calmoduline a été découverte par Wai Yiu Cheung en 1970, puis par Shiro Kakiuchi et ses collègues plus tard la même année :

• Cheung a montré que la 3',5'-nucléotide cyclique phosphodiestérase purifiée existe sous une forme en grande partie inactive à moins qu'on ne lui ajoute un activateur inconnu.
• L'équipe de Kakiuchi a détecté la présence de ce facteur d'activation de la phosphodiestérase dans des extraits de cerveau et a constaté que l'activité de la phosphodiestérase est stimulée par le calcium.
• Le mécanisme par lequel cet activateur, le complexe calcium - calmoduline, modifie l'activité de la phosphodiestérase a été découvert par Tian Seng Teo et Jerry Hsueh-Ching Wang, en 1972.

Cette découverte a contribué à la compréhension du mécanisme d'action du calcium :

• en effet, cette protéine régulatrice intervient comme médiateur de la régulation par le calcium dans de trés nombreux systèmes animaux et végétaux
• comme sa fixation au CALcium MODULe l'activité de nombreuses protéines, cette protéine régulatrice a été baptisée calmoduline ou CaM (Means & Dedman, 1980)
• elle possède (dans la plupart des cas) quatre sites de fixation du calcium
• quand la calmoduline a fixé 4 ions calcium, elle adopte une nouvelle conformation qui lui permet d'interagir avec ses protéines cibles afin de les activer

2. Séquences nucléotidiques et polypeptidiques de la calmoduline

L'alignement de séquences de la CaM révèle des résultats surprenants.

a. Séquences nucléotidiques

Séquence consensus codant la CaM issue de 44 séquences de CaM de plantes (E. Jaspard - non publié)

ATGGC.GAtc agCTcAccGA cGA.CAGAtc tc.GAgTTcA AgGAgGCcTT caGCcT.TTc GAcAAgGA.G GcGAtGGtTG cATcAC.ACc AAGGAgcTtG GaACtGTgAT GcG.TCacTg GG.CAgAAcC CaACtGAgGC tGAgCT.CAg GAcATGATcA AtGAaGTtGA TGCtGATGG. AAtGGaACcA TtGAcTTcCC .GAGTTccT. AAccTgATGG C.cG.AAgAT GAAgGAcACt GAtTCtGAGG AgGAgCTcAA gGAgGCtTTC ag.GTgTTtG AcAAgGAtCA gAAtGG.TTc ATcTCtGCtG CtGAgcT.CG cCAtGT.ATG AC.AAcCT.G G.GAgAAgCT .AC.ga.ga. ..aGAgGTtG AtGAGATGAT ccg.GAgGCt GAtgT.GAtG GtGATGG.CA gaTcAAcTAt GAgGAgTTtG TcAAggTcAT GATGGCcAAG TGA 453

• les nucléotides en majuscule sont trouvés à la position indiquée dans toutes les séquences : c'est-à-dire un taux d'identité remarquable de 66%, puiqu'il s'agit de séquences nucléotidiques (il faut tenir compte de la dégénérescence du code génétique)
• minuscule : 1 seule séquence ne présente pas le nucléotide à cette position
• point : au moins 2 séquences ont un nucléotide qui diffère de la séquence consensus
• chez les végétaux, le codon initiateur ATG est inclu dans une région riche en AT, contenant des séquences consensus TATA box et CAAT box ; chez les animaux, cette région est dépourvue de TATA box et elle est riche en GC
• la séquence codante est composée de 2 exons séparés par 1 intron de 1,5 à 2,7 kilo paires de bases situé au niveau du 26è codon (glycine)

Il existe plusieurs gènes codant la CaM (exemple : 8 gènes chez la pomme de terre) :

• ceci est liée à la necessité d'un contrôle transcriptionnel trés fin de cette protéine du fait de son implication majeure dans la transduction de signaux, notamment lors de la prolifération et de la différenciation cellulaire
• celà constitue aussi une protection contre toutes mutations de la CaM qui s'avèrerait léthale s'il n'existait qu'une copie du gène
• enfin, l'existence d'isoformes (6 chez Arabidopsis thaliana) augmente l'éventail de conformations que la CaM peut adopter et donc de protéines avec lesquelles elle peut interagir

La CaM est une protéine constituée d'une chaîne polypeptidique de 148 - 149 acides aminés (de masse molaire d'environ 16.700 Dalton).

Séquence primaire consensus de la CaM issue de 39 séquences de CaM de plantes (E. Jaspard - non publié)

A..L...Q.. ..KEAF.LFD KDGDGCIT.. E..TV.RSL. QNPTE.ELQD MI.E.D.D.N GTI.F.E.L. LMA.K.K.TD .EE.LKEAF. VFDKDQ.G.I SA...RHVM. NLGEKL... EV..MI.EAD .DGDGQ.N.. EFV..M... 149

• là encore, les acides aminés en majuscule sont trouvés à la position indiquée dans toutes les séquences, soit un taux d'identité trés élevé (65%)
• point : au moins deux séquences ont un acide aminé qui diffère de la séquence consensus

3. Structures de la calmoduline

a. Caratéristiques générales de la structure tridimensionnelle

La CaM est l'une des protéines dont on connait le mieux la structure : près de 200 structures ont été obtenues par différentes méthodes.

On distingue 3 domaines dans la CaM : le domaine N-terminal / une hélice centrale de 7 tours / le domaine C-terminal.

Source : K. Hines - Aldrich lab

Le domaine N-terminal et le domaine C-terminal possèdent chacun 2 sites de fixation du calcium :

• ces sites ont un motif particulier appelé "EF-hand" (EF)
• le motif "EF-hand" est un motif super-secondaire hélice - boucle - hélice
• le terme "EF-hand" a été inventé par R. H. Kretsinger il y a plus de 30 ans pour décrire le motif hélice-boucle-hélice découvert dans la structure de la parvalbumine (protéine du muscle qui fixe le calcium)

b. Le motif "EF - hand"

Ce motif est composé de 30 acides aminés et contient 2 hélices α (E et F - figurées respectivement par l'index et le pouce d'une main - figure ci-dessous), reliées par une boucle.

Source : PFAM : PF00036

Lors de la fixation du calcium, l'hélice F passe d'une conformation "fermée" (apo-CaM) à une conformation "ouverte" (holo-CaM).

Dans la CaM, les 4 boucles de liaison au calcium inclues dans ces motifs ont des séquences homologues chargées négativement et fortement polaires :

[D,N] - x - D - [G,N] - [D,N] - G - [Q,T,Y] - x - x - x - x - E

7 atomes d'oxygène constitue le réseau de coordination du calcium :

• 5 atomes d'oxygène proviennent des chaînes latérales d'Asp et de Glu
• le 6ème atome provient du groupement carbonyle de la liaison peptidique impliquant une Gln
• le 7ème atome provient d'une molécule d'eau

Géomètrie des ligands du calcium dans un motif "EF - hand":

Source : Lewit-Bentley & Réty (2000)

c. Structure de l'apo-calmoduline ou calmoduline non liée au calcium

• Saccharomyces cerevisiae : 1lkj
• Xenopus laevis : 1cfc et 1cfd
• Rattus norvegicus : 1qx5

La structure de l'apo-CaM a été obtenue par différentes expériences de RMN, le marquage réverse de résidus Phe* et la mesure de couplage de liaison ³J (3 liaisons séparent 2 noyaux).

Les acides aminés Met76 à Ser81, qui forment le lien flexible entre le domaine N-terminal et le domaine C-terminal, sont sous forme hélicoïdale dans la structure de l'apo-CaM, mais pas dans la structure de la CaM liée au calcium.

Cette conclusion est corroborée par l'hydrolyse (par des protéases) de cette région de la CaM liée au calcium mais pas de l'apo-CaM, ce qui signifie que cette région est protégée dans l'état non liée au calcium.

Ces résultats suggèrent que lorsque le calcium se fixe aux domaines de fixation du calcium, un changement de conformation modifie la structure hélicoïdale de la CaM : ce changement de conformation crée des poches hydrophobes à la surface des domaines de fixation du calcium qui ne se trouvaient pas dans l'état apo-CaM.

*Marquage réverse : des bactéries sont cultivées sur un milieu supplémenté en ¹⁵NH₄Cl, en glucose marqué au ¹³C et en acides aminés non marqués (ces acides aminés ne sont donc pas marqués ultèrieurement). Seuls les acides aminés qui sont synthétisés par les bactéries en utilisant le ¹³C-glucose comme source de carbone sont marqués.

d. Structure pleinement étendue de la calmoduline liée au calcium de Homo sapiens à une résolution de 1,7 Å

Code PDB : 1CLL

Acides aminés des 4 motifs "EF - hand" :

• EF1 : X = D20 (OD2); Y = D22 (OD1); Z = D24 (OD2); -X = H2O; -Y = T26 (O); -Z1 = E31 (OE1); -Z2 = E31 (OE2)
• EF2 : X = D56; Y = D58; Z = N60; -X = H2O; -Y = T62; -Z1 = E67; -Z2 = E67
• EF3 : X = D93; Y = D95; Z = D97; -X = H2O; -Y = Y99; -Z1 = E104; -Z2 = E104
• EF4 : X = D129; Y = D131; Z = D133; -X = H2O; -Y = Q135; -Z1 = E140; -Z2 = E140

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

La CaM possède des propriétés de régulation de la fonction des protéines très particulières puisqu'elle interagit avec environ 100 cibles protéiques (enzymes et protéines) distinctes.

Comment, sur la base d'une variabilité maximale de seulement 35% des séquences d'acides aminés qui la composent, la calmoduline adopte-t-elle une telle diversité de conformations lui permettant d'interagir avec autant de protéines cibles, c'est-à-dire avec autant de structures tridimensionnelles différentes ?

e. Structure compacte de la calmoduline liée au calcium

La CaM a été traitée par l'EGTA pour chélater les atomes de calcium liés. Puis la CaM a été dialysée de manière exhaustive, afin d'éliminer tout ligand endogène lié. Elle a ensuite été re-ligandée au calcium avant cristallisation.

La structure ci-contre (code PDB : 1PRW) correspond à une autre structure native que la CaM pourrait adopter in vivo.

• cette structure adopte une conformation compacte ellipsoïdale (globulaire) : les interactions inter-domaines correspondent, entre autres, à 16 liaisons hydrogènes < 3.4 Å et 24 contacts de type van der Waals < 4Å
• l'hélice centrale est fortement incurvée : elle adopte la conformation d'un tour β de type 1 impliquant les acides aminés Asp78, Thr79, Asp80 et Ser81
• le domaine N-terminal (notamment l'acéto-alanine N-terminale et les acides aminés Asp2, Gln3 et Leu4) est plus compact que dans la conformation native étendue
• les hélices I et II du domaine N-terminal et les hélices V et VII du domaine C-terminal sont très rapprochées
• la cavité interne entre les deux domaines semble contenir deux groupes de trois molécules d'eau

Cette conformation compacte globulaire offre une moindre surface exposée au solvant. Si cette conformation est adoptée in vivo, elle présente des avantages :

• une moindre action des protéases
• une reconnaissance de cibles de type kinase : cette reconnaissance s'appuyant sur une conformation préalable [domaines liés au calcium et à proximité l'un de l'autre] de la CaM
• une reconnaissance de médicaments à base de petites molécules organiques qui pourraient accéder à la cavité centrale

Certaines cibles protéiques liées à la CaM sont sous une forme partiellement étendues (exemples : "anthrax adenylyl cyclase exotoxin", "gating domain of Ca2+-activated K+-channel").

En conséquence :

• la forme étendue de la CaM est peut-être une conformation "terminale" d'un large éventail de structures possibles adoptées par la CaM en solution
• de la même manière, la forme compacte globulaire de la CaM est peut-être une conformation "terminale" d'un ensemble de structures plus fermées de la CaM liée au calcium

Source : Haiech et al. (2011)

4. Mécanisme de changement de conformation de la calmoduline

La fixation des atomes de calcium induit un changement de conformation de la CaM.

En particulier, elle modifie la longue hélice centrale.

On peut schématiser le changement de conformation qui s'opère sous forme d'une "haltère" (en haut) qui se replie sur elle-même ("pince"- en bas) .

a. Mécanisme lors de la fixation coopérative du calcium

apo-CaM (sans calcium) <---> holo-CaM (4 atomes de calcium)

La CaM fixe 4 atomes de calcium de manière séquentielle : il y a un effet coopératif (figure ci-dessous) dans la fixation des 4 atomes de calcium (voir le cours sur les protéines à régulation allostérique).

• Les 4 sites de fixation lient le calcium avec une trés grande affinité mais avec des constantes de dissociation différentes : K_D = 5 10^-7 M à 5 10^-6 M.
• Les sites du domaine C-terminal ont une affinité plus grande que ceux du site N-terminal.

Voir un film sur la transition apo-CaM à holo-CaM. Ce film prend un certain temps à être chargé.

Divers modèles mathématiques décrivant la fixation coopérative du calcium par la calmoduline ont été développés.

Source : Stefan et al. (2008)

• Seuls les équilibres de fixation du 1er et du 4ème atome de calcium sont décrits.
• Les 4 sites de fixation du calcium sont désignés A et B (domaine N-ter), C et D (domaine C-ter).
• La constante L décrit l'équilibre entre les 2 conformations sans calcium : L = [T₀] / [R₀]
• Les constantes c_i traduisent le rapport des constantes de dissociation des états R et T de chaque site : c_i = K_i^R / K_i^T
• Tg : "target". Exemple : CaM-kinase II.

La CaM adopte alors une conformation activante : c'est dans cette conformation qu'elle interagit avec ses protéines cibles pour en moduler l'activité.

La CaM saturée en calcium s'enroule autour de régions spécifiques de la protéine cible.

Voir l'étude des fluctuations conformationnelles de la CaM lors de son repliement : Stigler et al. (2011).

Les équilibres ci-dessous décrivent :

CaM_haltère + Ca²⁺ <-> Ca²⁺-CaM <-> (Ca²⁺)₄-CaM_pince

EnzCible_inactive + (Ca²⁺)₄-CaM_pince <-> [EnzCib)(Ca²⁺)₄-CaM)]_active

• la fixation du calcium à la CaM
• la fixation de la CaM à la protéine cible
• les changements de conformations qui les accompagnent

Bien d'autres modèles théoriques ont été développés pour analyser la spécificité et la sélectivité de la fixation des protéines cibles sur la CaM (voir : Valeyev et al., 2008). Ils ont aussi été développés pour décrypter différents paramètres de l'interaction [CaM - calcium - protéine cible], tels que :

• fixation du Ca²⁺ toujours coopérative ou non
• influence de la nature de la protéine cible sur la constante de dissociation du Ca²⁺ de la CaM
• effets de la fixation coopérative sur la constante de dissociation du Ca²⁺ de la CaM
• nombre d'ions Ca²⁺ requis pour fixer et activer les protéines cibles
• ...

5. Protéines fixant le calcium

a. Exemples de complexes [calmoduline-protéine cible] et leurs rôles physiologiques

Plusieurs dizaines de types de protéines sont recensées comme interagissant avec la CaM.

Source : EBI - Interpro

• voir une liste (avec les liens vers des données sur ces protéines)
• voir des structures de complexes

Figure ci-dessous, illustration des interactions de la CaM dans différents compartiments sub-cellulaires : la mitochondrie / le réticulum endoplasmique / le noyau / le cytosquelette

Source : J. Yang Laboratory

avec des :

• protéines membranaires : canaux ioniques, pompes, jonctions gap, ...
• protéines de différentes voies de signalisation via les RCPG : adénylate cyclase, phospholipase, ...
• avec des enzymes cytoplasmiques : CaM-kinases, glycogène synthase, ...

b. Les super-familles de protéines qui fixent le calcium

Arbre phylogénétique de la super-famille de protéines fixant le calcium via un domaine structural "EF-hand".

Source : PFAM : PF00036

La super-famille des protéines qui possèdent un motif "EF-hand" contient plus de 66 sous-familles subdivisées en deux groupes principaux:

« Canonical EF-hands » dont l'exemple typique est la CaM.

« Pseudo EF-hands » : trouvées exclusivement dans le domaine N-terminal des protéines S100 et S100-like. Les 14 acides aminés de ce type de motif fixe le calcium principalement via les groupes carbonyles du squelette carboné.

c. Calmoduline et protéines fixant la calmoduline chez les plantes

Figure ci-dessous, illustration des interactions de la CaM et autres protéines contenant un ou plusieurs motif "EF-hand" chez les végétaux :

Source : Perochon et al. (2011)

• CMLs ("calmodulin-like proteins") : protéines similaires à la CaM
• CBLs ("calcineurinB-like proteins") : protéines de type calcineurine B
• CDPKs ("Ca²⁺-dependent protein kinases") : protéines kinases calcium dépendantes

CMLs, CBLs et CDPKs ne sont quasi exclusivement trouvées que chez les plantes et quelques protistes.

La superfamille des protéines contenant un ou plusieurs motif "EF-hand" contient environ 250 membres chez le riz (5 gènes CaM et 32 gènes CML) et 250 membres chez Arabidopsis thaliana (7 gènes CaM et 50 gènes CML).

Par comparaison, on en dénombre actuellement environ 80 chez l'homme et 130 chez la drosophile.

6. Mécanisme d'activation des pompes Ca²⁺-ATPases par la calmoduline

Les ions calcium sont des messagers secondaires de nombreuses voies de transduction du signal.

Les cellules investissent beaucoup d'énergie dans le contrôle et le maintien d'un gradient entre la concentration intra-cellulaire (≈ 0.1 μM) et extra-cellulaire (≈ 2 mM) de calcium.

La famille des pompes à calcium activées par la calmoduline, à laquelle appartiennent les Ca²⁺-ATPases de la membrane plasmique ("Plasma-Membrane Ca2+-ATPase"), sont des régulateurs clé de la concentration intra-cellulaire de calcium chez les eucaryotes.

Contrairement aux autres ATPases de type P, les Ca²⁺-ATPases contiennent un domaine N-terminal (chez les plantes) ou C-terminal (chez les mammifères) responsable de l'auto-inhibition.

Le domaine N-terminal auto-inhibiteur contient plusieurs acides aminés basiques conservés capitaux pour l'auto-inhibition : Arg58, Arg61, Lys67 et Lys68.

Figure ci-dessous : Structure de la Ca²⁺-ATPase de Arabidopsis thaliana.

Source : Tidow et al. (2012)

• A : domaine activateur
• N : domaine de fixation du nucléotide
• P : domaine de phosphorylation
• En vert : domaine auto-inhibiteur (acides aminés 40 à 95) qui forme une longue hélice α

1er temps : quand la concentration en calcium augmente, le complexe Ca²⁺-CaM se fixe d'abord au premier site de fixation à haute affinité (CaMBS1 - "CaM Binding Site 1").

Cette fixation déplace ce site dans la région entre les domaines A et N et permet les mouvements des domaines cytoplasmiques nécessaires au pompage des ions quand la concentration du calcium est basale.

Figure ci-dessous : Mécanisme proposé pour l'activation de la Ca²⁺-ATPase de Arabidopsis thaliana par la CaM.

Source : Tidow et al. (2012)

La fixation de deux molécules de CaM complexée au calcium déplace l'hélice auto-inhibitrice du coeur catalytique, ce qui active la Ca²⁺-ATPase.

2ème temps : un accroissement supplémentaire de la concentration en calcium déplace le second site CaMBS2 du coeur catalytique : la pompe est alors pleinement activée.

Ce mécanisme en 2 temps explique la régulation médiée par la calmoduline sur une telle gamme de concentration de calcium (4 ordres de grandeur).

L'analyse des séquences indiquent que l'existence de 2 sites de fixation de la CaM n'est pas propre à Arabidopsis thaliana mais est trouvé chez de nombreuses plantes.