Applications de la fluorescence à l'étude des biomolécules

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a. Principe de la fluorescence

b. Le 4',6-diamidino-2-phenylindole ou DAPI®

c. La technique du FISH

d. La technique du FRET

e. La technique GFP

 

a. Principe de la fluorescence

Pour qu'une molécule passe de l'état fondamental à un état excité, il faut qu'il reçoive une quantité d'énergie équivalente à la différence entre ces deux niveaux.

Pour une molécule complexe comme une protéine, les niveaux S0 et S'1 sont multiples, et il y a des pertes au sein de la molécule lors du retour d'un état excité S1' à un état excité S1 (exemple ci-contre).

En conséquence, l'énergie d'émission est toujours plus faible que l'énergie d'excitation.

Ce qui se traduit par : Eemission = h/λem < Eexcitation = h/λexc

La longueur d'onde de la lumiére d'émission est toujours plus élevée que celle de la lumiére d'excitation.

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie

b. Le 4',6-diamidino-2-phenylindole ou DAPI®

Spectre d'émission de fluorescence du 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI®) dissout dans le diméthyl sulfoxyde (DMSO).

La longueur d'onde d'excitation est 310 nm.

Le DAPI® est utilisé en cytochimie car il marque l'ADN qui fluoresce en bleu.

Voir une application : au cours de la mitose l'ADN (chromatine) est essentiellement localisé dans les noyaux.

Bibliographie : Du et al. (1998) "PhotochemCAD: A computer-aided design and research tool in photochemistry" Photochem. Photobiol. 68, 141 - 142

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie

Source : "Oregon Medical Laser Center"

c. La technique du FISH ("Fluorescence In Situ Hybridization") : hybridation in situ avec des sondes fluorescentes

La technique du FISH sert à marquer des séquences d'un gène ou d'une partie du génome par appariement d'une sonde nucléotidique avec sa séquence homologue sur le chromosome.

Elle est utilisée pour déceler les anomalies chromosomiques (recombinaison chromosomique) et faire de la cartographie des génes.

Voir un développement de cette technique et de ses applications.

 

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie In Situ Hybridization

Source : "Access Excellence @ the national health museum"

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d. La technique du FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer") : transfert d'énergie de résonnance de fluorescence

La molécule "donneur" porte un fluorochrome dont la longueur d'onde d'émission correspond à la longueur d'onde d'excitation du fluorochrome placé sur la molécule " accepteur".

La molécule "donneur" présente un domaine susceptible de se lier spécifiquement à un domaine de la molécule "accepteur".

Lorsque les conditions biologiques sont favorables, ces deux molécules interagissent, permettant le rapprochement des deux fluorochromes.

Le transfert de l'énergie n'est observable que lorsque la molécule "donneur" de photons est suffisamment proche de la molécule "accepteur", de 10 à 70 Å selon la géométrie des molécules et du système d'observation.

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie Fluorescence Resonance Energy Transfer

Source : Trugnan et al. (2004) M/S : médecine sciences 20, 1027 - 1034

Dans l'image ci-contre, on observe dans toute la cellule et, en particulier, dans les corps d'inclusion formés par les aggrégats protéiques, un phénomène de FRET entre :

  • l'anticorps anti-synucléine marqué à la fluorescéine
  • et l'anticorps anti-HSP ("heat shock protein"), marqué à la cyanine 3 (fluorescence verte)

En revanche, il y a peu de FRET dans le noyau.

Source : Zeiss - Auteur : B. Bacskai (Massachusetts General Hospital)

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie Fluorescence Resonance Energy Transfer

Autres techniques dérivées - (Source : L'atelier calcium - CNRS)

Le PbFRET ("photobleaching FRET") consiste à éteindre la fluorescence d'un des deux fluorophores par une illumination intense appropriée et à lire les variations du signal de fluorescence du fluorophore restant qui en résultent.

Le BRET ("Bioluminescence Resonance Energy Transfert") met en jeu une protéine bioluminescente, la luciférase, comme donneur et la YFP ("Yellow Fluorescent Protein") comme molécule acceptrice. La bioluminescence est émise à la suite d'une complexation de la luciférase avec un cofacteur, la coelentarazine.

Outre le fait que les molécules fluorescentes sont synthétisées dans la cellule, l'intérêt de cette approche réside dans l'obtention d'un bon rapport signal/bruit. En effet le transfert d'énergie se faisant en l'absence de toute excitation lumineuse, la fluorescence de base est extrêmement faible.

L'HTRF ("Homeogeneous Time Resolved Fluorescence") est basée sur des mesures d'intensité de fluorescence en temps résolu. Elle met à profit la dé-activation extrêmement lente de certains fluorophores tels que les terres rares (Europium, Terbium) pour séparer la fluorescence des molécules engagées dans un FRET de celles qui ne le sont pas.

Cette approche offre un bon rapport signal/bruit et est adaptée pour réaliser des tests en condition homogène.

e. La technique GFP ("Green Fluorescent Protein" - 238 acides aminés) : protéine fluorecente verte

La GFP est utilisée en hybridation in situ pour l'étude de l'expression des génes, la localisation de protéines dans les cellules ...

  • longeur d'onde d'excitation de fluorescence : 395 nm
  • longeur d'onde d'émission de fluorescence : 508 nm

Voir le "GFP site".

Bibliographie : Tsien R. Y. (1998) "The Green Fluorescent Protein" Annu. Rev. Biochem. 67, 509 - 544

Fluorescence FRET DAPI electron energy energie Green Fluorescent Protein

 

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