La protéomique

Sommaire
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1. Introduction

2. L'extraction des protéines

3. L'électrophorèse sur gel bi-dimensionnel

  • a. Principe
  • b. Les méthodes de révélation des protéines
  • c. L'hydrolyse des protéines par la trypsine

4. La spectrométrie de masse

  • a. Principe
  • b. Description d'un spectromètre de masse

5. Principe de l'analyse protéomique par spectrométrie de masse

  • a. La carte peptidique massique par spectrométrie de masse : MALDI-TOF/MS
  • b. Le séquençage par spectromètrie de masse en tandem : ESI-MS/MS ou ESI-Q-TOF
  • c. Autres types de spectromètres de masse
 

6. Quelques données pour l'interprétation des spectres de masse de peptides

  • a. Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectrométrie de masse en tandem
  • b. Valeurs de masses monoisotopiques et moyennes des résidus d'acides aminés

7. Identification des protéines par des méthodes bioinformatiques

  • a. Approche "directe"
  • b. Approche "indirecte"
  • c. "PepLine" : annotation des génomes par l'analyse MS/MS

8. Protéomique quantitative

  • a. La technique ICAT
  • b. La technique 2D-DIGE
  • c. Protéomique "en vrac" ("MudPIT")

9. Exemples d'application

10. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction

La protéomique a pour but d'identifier (et de quantifier) l'ensemble des protéines synthétisées ou protéome, à un moment donné et dans des conditions données au sein d'un tissu, d'une cellule ou d'un compartiment cellulaire.

Le protéome est extrêmemement complexe à plusieurs titres :

  • compte-tenu de l'épissage alternatif des transcrits primaires (plusieurs ARNm pour un gène) et compte-tenu des modifications post-traductionnelles des protéines, on peut estimer à plusieurs dizaines de milliers les formes des protéines synthétisées dans les différents tissus humains par exemple.
  • pour chaque condition environnementale (condition physiologique normale vs. conditions de stress) une cellule est caractérisée par un protéome adapté à cette condition alors qu'elle a toujours le même génome. Le cas des plantes est un exemple flagrant compte-tenu de leur nécessité de s'adapter tant aux variations de la lumière qu'aux effets de stress biotiques ou abiotiques.
  • outre les modifications post-traductionnelles, les protéines subissent des transformations une fois synthétisées : clivage du peptide signal d'adressage, activation de la forme native à partir d'un précurseur (zymogène), assemblage en complexes oligomèriques, association à des cofacteurs.
  • il existe une grande dynamique de la synthèse des protéines : le rapport entre les protéines les moins abondantes et les plus abondantes dans une cellule dépasse 106 pour atteindre 1012 dans le sérum.
  • les protéines ont des demi-vies trés variables : ornithine décarboxylase 11 min - tryptophanne oxygénase 2 h - myosine 30 j.

La transcriptomique analyse l'ensemble des transcrits (produits d'expression des gènes). La protéomique et la transcriptomique sont donc des approches complémentaires trés puissantes qui peuvent être utilisées pour des études fondamentales ou appliquées en biologie, en médecine, en agriculture.

En effet, dans les deux cas, les infomations recueillies permettent d'aborder l'ensemble des réponses cellulaires dans leur globalité et non plus de manière partielle.

La protéomique apporte des réponses auxquelles la transcriptomique ne peut répondre :

  • compléments d'informations sur les modalités d'expression des gènes pour les organismes dont le génome n'a pas encore été séquencé ou pour lesquels les programmes de prédiction de séquences codantes sont moins fiables. Un exemple est l'aide au repérage des bordures d'exons ce qui permet en retour une meilleure annotation des génomes.
  • estimation quantitative des concentrations des protéines synthétisées (méthode de marqueurs d'affinité contenant un isotope d'identification : ICAT).
  • obtention de données sur la fonction des protéines et les interactions entre protéines ou entre protéines et autres molécules biologiques (approche double-hybride ou approche "tandem affinity purification by tag" - TAP/TAG).

Les études de protéomique sont de plus en plus spécialisées :

Le taux de croissance annuel composé du marché mondial de la protéomique* est estimé à 14,2 % pour atteindre 17,2 milliards de dollars en 2017.

*Technologies liées à la protéomique : puces à protéines ("protein microarray"), spectrométrie de masse et spectroscopie RMN, fractionnement des protéines, chromatographie, électrophorèse, "Surface Plasmon Resonance", crystallographie et diffraction des rayons X, immuno-essais ...


Génome et protéome de l'homme
Analyse du génome de l'homme aboutie 2012 "The ENCODE Project Consortium" : 20 687 gènes codant des protéines
Nature 489, 57-74 (2012)
Protéome de l'homme 2014

Kim et al. (2014) "A draft map of the human proteome" Nature 509, 575-581
Bases de données : Human Proteome Map et ProteomicsDB


Schématiquement, les étapes de l'analyse protéomique sont les suivantes :

  • extraction des protéines (cas particulier des protéines membranaires)
  • séparation des protéines par électrophorèse sur gel bi-dimensionnel (cas particulier des protéines membranaires) ou par des techniques de chromatographie (protéomique en vrac ou étude de petides particuliers)
  • révélation des protéines dans les gels puis l'analyse d'image des gels
  • récupération des spots de protéines et la digestion par des protéases
  • le cas échéant, la détermination de la séquence N-terminale par la dégradation d'Edman dans le but de rechercher des candidats dans les banques de données
  • obtention de cartes peptidiques massiques par des techniques de spectromètrie de masse
  • détermination de la séquence complète des protéines par des techniques de spectromètrie de masse dites en tandem
  • analyse bioinformatique (identification des protéines, annotation des protéines et des gènes, recherche de motifs structuraux, analyse des structures, ...)

Figure adaptée de Peng & Gygi (2001)

etapes de l'analyse proteomique

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2. L'extraction des protéines

C'est une étape cruciale car elle peut entraîner une dégradation des protéines et compromettre leur identification.

Pour la solubilisation des protéines hydrosolubles, on utilise :

Les protéines membranaires, constituées de beaucoup d'acides aminés hydrophobes, sont plus difficiles à solubiliser. Leur extraction peut être améliorée en utilisant :

  • de puissants réducteurs comme la tributyl phosphine
  • des agents chaotropes comme la thio-urée
  • des surfactants à caractère zwitterionique comme la sulfobétaine dont le groupe carboxyamide augmente la tolérance à l'urée
  • des extractions dans des solvants organiques (mélange chloroforme / méthanol par exemple) permettent de solubiliser davantage ces protéines

L'analyse du protéome, non plus de la cellule entière, mais de compartiments cellulaires permet d'étudier des protéines trés spécifiques ou en faible quantité du fait d'un faible taux de synthèse. Exemple : l'analyse protéomique de la mitochondrie du pois (Bardel et al., 2002).

C'est ainsi qu'une équipe de l'Université d'Angers (IRHS) a été la première à isoler et à caractériser une protéine LEA mitochondriale (Grelet et al., 2005).

Voir la base de données "Late Embryogenesis Abundant Proteins Database" (Hunault, Châtelain & Jaspard)

3. L'électrophorèse sur gel bi-dimensionnel (SWISS-2DPAGE)

a. Principe

La stratégie la plus courante est de séparer dans un premier temps les protéines par électrophorèse bidimensionnelle sur un gel de polyacrylamide (ou 2D - PAGE - "two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis").

Du fait de leur composition en acides aminés, les protéines diffèrent les unes des autres par leur masse molaire et leur charge nette à un pH donné. La charge nette est caractérisée par le point isoélectrique ou pI.

Les protéines ont :

  • des pI qui s'échelonnent de 2 (glucose-1-phospho-D-mannosylglycoprotéine phosphodiestérase) à 12 (cathepsine G)
  • des masses molaires de 5 kDa à 590 kDa : calossine - 5322 acides aminés
  • Remarque : il existe un fichier Uniprot pour "Parallel beta-helix repeat" : 36.805 acides aminés - 3740 kDa

L'une des difficultés majeures de la séparation est de trouver des conditions d'électrophorèse qui couvrent de telles gammes de propriétés physico-chimiques.

La séparation se fait en deux temps.

1ère dimension : une isoélectrofocalisation (IEF) où les polypeptides migrent jusqu'à un pH égal à leur pl.

La séparation selon la charge utilisait auparavant des ampholytes pour obtenir un gradient de pH. Mais ce procédé n'était pas assez reproductible pour la comparaison de gels par superposition.

On utilise maintenant des gradients de pH immobilisés (IPG), formés avec des immobilines.

Les immobilines sont des dérivés de l'acrylamide et leur structure générale est décrite dans la figure ci-contre.

acrylamide 

R correspond à un groupement carboxyle (acide) ou à une amine tertiaire (base) qui forment une série de molécules tampon avec différentes valeurs de pKa d'ionisation (exemples : 3,6 - 4,4 - 4,6 - 6,2 - 7,0 - 8,5 - 9,3).

Les immobilines co-polymérisent avec les molécules d'acrylamide (voir figure ci-dessus) dans le gel d'IEF.

Ainsi, les groupes chargés portés par les immobilines qui forment le gradient de pH sont covalamment attachés (via une liaison vinyle) à la matrice de polyacrylamide et donc immobilisés.

Cette technique permet d'obtenir des gradients de pH reproductibles et très étroits : une pente de 0.01 unité pH / cm peut séparer un mélange de protéines avec une différence de pI de 0.001 unité pH !

2ème dimension : une séparation selon la masse molaire sur un gel d'électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes (sodium dodécyl sulfate ou SDS et réduction des ponts disulfure).

Source : Piercenet

polyacrylamide 

Ces deux électrophorèses sont effectuées de manière perpendiculaire l'une par rapport à l'autre.

Comme les paramètres de la séparation sont indépendants, cette technique est particulièrement résolutive : plusieurs centaines de chaînes polypeptidiques peuvent être séparées sous forme de taches de protéines (appelées aussi spots) sur un gel.

Voir des exemples de gels bi-dimensionnels.

Gel bidimensionnel

Source : Humboldt - Universität Berlin

b. Les méthodes de révélation des protéines

Coloration des gels pour la révélation des protéines (100 ng à 0,1 ng de protéine par spot) :

  • Bleu de coomassie : 30 - 50 ng, faible sensibilité
  • bleu colloïdal : 5 à 10 fois plus sensible
  • nitrate d'argent : forte sensibilité (0,1 ng) (photo de droite ci-contre)
  • fluorophore "Sypro Ruby" : forte sensibilité (1 à 10 ng) (photo de gauche ci-contre)

Les logiciels d'analyse d'image des gels repèrent les spots et calculent leur coordonnées et leur intensité.

La sélection des spots à prélever est transmise au couteau à gel. Les morceaux de gels sont déposés dans les puits de plaques à 96 puits.

Coloration des gels

Source : Sigma-Aldrich

Exemple d'appareillage :

  • électrophorèse 1ère dimension : "Protean IEF Cell" (BioRad)
  • électrophorèse 2ème dimension : "Ettan DALTsix Large Vertical System" (Amersham Biosciences)
  • logiciel : "ImageMaster 2D" (Amersham Biosciences)
  • couteau à gel : "Spot cutter" (BioRad)

c. L'hydrolyse des protéines par la trypsine

La ou les protéines contenue(s) dans un spots de l'électrophorèse bi-dimensionnelles est (sont) hydrolysée(s) en fragments peptidiques par une protéase à sérine (essentiellement endopeptidase).

En général, on utilise la trypsine (EC 3.4.21.4), la LysC, la chymotrypsine.

La trypsine hydrolyse la liaison peptidique après (côté C-terminal) les acides aminés lysine et arginine sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline. Cependant elle peut avoir une spécificité plus complexe.

Ces peptides ont des masses différentes car leur séquence en acides aminés sont différentes .

Hydrolyse par la trypsine

1. Voir le logiciel "PeptideCutter" - Expasy

2. Aller à la page "MS-Digest" du logiciel "Prospector". Cliquer sur "perform digest" pour avoir un aperçu d'un résultat d'hydrolyse in silico d'une protéine.

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4. La spectrométrie de masse

a. Principe

L'ionisation électronique (souvent appelée impact électronique) et l'ionisation chimique sont les principales méthodes d'ionisation.

Dans le cas de l'ionisation électronique, l'échantillon est introduit dans une enceinte sous vide, il y est vaporisé puis soumis au bombardement d'un canon à électrons de grande énergies.

Un électron est arraché aux molécules et on obtient une espèce qui est à la fois un cation (ion positif) et un radical libre (nombre impair d'électrons), que l'on appelle ion moléculaire, M+.:

M + e- (énergie 70 eV) <==>M+. + 2 e-

L'énergie du faisceau ionisant fragmente l'ion moléculaire par rupture des liaisons les plus faibles avant les liaisons les plus fortes et donne naissance à des ions positifs de masses plus faibles, qui pourront être fragmentés à nouveau (exemple : spectrométrie de masse dite en tandem - MS/MS).

Ces ions sont ensuite accélérés dans un champ électrique et/ou magnétique, puis dirigés entre les pôles d'un aimant selon une trajectoire circulaire qui dépend de leur rapport masse/charge [m/z].

En faisant varier le champ électrique, on fait varier la vitesse des ions moléculaires et on peut les faire ainsi parvenir au détecteur par ordre croissant de rapport [m/z].

Le tri des ions s'effectue :

  • soit par temps de vol : les ions arrivent à des temps différents en fonction de [m/z]
  • soit par courbure de trajectoire : le point d'impact des ions dépend de [m/z]

Remarque : z étant pratiquement toujours égal à 1, on obtient une mesure de la masse de tous les fragments et de la molécule initiale [M+H]+.

On obtient un grand nombre de pics, tous de masse inférieure à celle de l'ion moléculaire.

Cet ensemble constitue un diagramme de fragmentation.

Les groupements fonctionnels possèdent un diagramme de fragmentation qui leur sont propres.

Dans un spectre de masse, la hauteur relative des pics indique l'abondance relative des espèces.

diagramme de fragmentation

Source : "Ion source"

b. Description d'un spectromètre de masse

Un spectromètre de masse est constitué de cinq parties principales (figure ci-dessous) :

1. Le système qui introduit l'échantillon dans le spectromètre de masse. Par exemple un système de chromatographie en phase gazeuse ("gaz chromatography" - GC).

2. La source où à lieu l'ionisation des molécules et la fragmentation des ions.

Il existe plusieurs méthodes d'ionisation, le choix de celle-ci est directement lié à la nature de l'échantillon et au type d'analyse souhaitée :

  • l'impact électronique
  • l'ionisation chimique
  • l'ionisation par plasma ("Inductively coupled plasma mass spectrometry" - ICP-MS)
  • le bombardement atomique rapide ("Fast Atomic Bombardement" - FAB)

 

Schema spectrometre de masse

Source : IUT Lannion

Pour l'analyse des protéines, deux méthodes sont principalement utilisées : la désorption par effet de champ ou MALDI et l'électrospray ou ESI.

3. Le système dispersif ou analyseur qui sépare et trie les ions suivant leur rapport [m/z]. Cette partie diffère d'un appareil à l'autre car il existe plusieurs modes d'ionisation selon les applications.

4. Le détecteur qui collecte les ions (fragments) qui arrivent à des temps différents en fonction du rapport [m/z] et qui amplifie le signal associé aux ions. Pour l'analyse des protéines, les détecteurs sont : la trappe à ions (IT), le temps de vol (TOF), le quadripôle (MS ou Q).

5. L'ensemble informatique de traitement des données qui permet de transformer les informations reçues par le détecteur en spectre de masse.

Les spectromètres de masse actuels permettent d'enregistrer automatiquent plusieurs milliers de spectres MS/MS en quelques heures. L'interprétation de ces spectres est le facteur limitant.

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5. Principe de l'analyse protéomique par spectrométrie de masse

Synoptique de l'analyse par spectromètrie de masse

Synoptique de l'analyse par spectrometrie de masse

Carte peptidique massique

Source : Vandenbrouck et al. (2005)

a. La carte peptidique massique par spectromètrie de masse : MALDI-TOF

Le type de spectromètrie de masse utilisé est l'ionisation par désorption au laser d'une matrice - temps de vol ("Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Fligh" - MALDI-TOF).

Karas & Hillenkamp (1988) "Laser desorption ionization of proteins with molecular mass exceeding 10 000 Daltons" Anal. Chem. 60, 2299 - 2301

Le phénomène d'ionisation utilise une matrice cristallisée. Exemple : un mélange acide sinapinique / acétonitrile / H2O (50:50:0,1).

Les propriétés de ce mélange sont :

  • un caractère acide donc une source de proton pour l'ionisation des peptides
  • une forte absorption optique dans les UV pour absorber rapidement et efficacement l'irradiation du laser
  • la présence de groupements polaires pour une utilisation en solution aqueuse

La protéine est donc hydrolysée par la trypsine et les peptides qui en résultent sont vaporisées puis dispersées dans la matrice.

Sous l'effet d'un laser UV (337 nm), la matrice irradiée subit une désorption entraînant une ionisation des peptides qu'elle contient par transfert de proton.

desorption au laser d'une matrice

bleu : matrice - rouge : échantillon

Source : Wikipédia

Dans les réflecteurs à temps de vol ("Time of Fligh" -TOF), les ions acquièrent une grande énergie cinétique et sont séparés en fonction de leur vitesse.

Le temps de vol est fonction du rapport [m/z] de chaque peptide.

Cette technique de spectrométrie de masse permet d'établir la carte peptidique massique de la protéine ou empreinte ("peptide mass fingerprint - PMF").

Henzel et al. (2003) "Protein identification: the origins of peptide mass fingerprinting" J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 14, 931 - 942

temps de vol

Source : "Introduction à la spectromètrie de masse" - P. Dubreuil

b. Le séquençage par spectromètrie de masse en tandem : ESI-MS/MS ou ESI-Q-TOF

Quand on a un mélange de protéines trop complexe au sein d'un spot, l'identification d'une protéine en particulier est impossible car plusieurs empreintes se superposent dans la carte peptidique massique expérimentale issue de l'analyse par MALDI-TOF.

Il faut alors séquencer les fragments peptidiques provenant de l'hydrolyse par la trypsine.

On emploie la spectrométrie de masse en tandem ou MS/MS, où chacun des peptides issus de la première fragmentation est lui-même fragmenté.

Les produits de fragmentation sont alors des acides aminés ou des sous-peptides trés courts. La séquence complète de la protéine est reconstituée par chevauchement des séquences des différents peptides.

spectrometrie de masse en tandem ou MS/MS

Source : Li & Assmann (2000)

Le type de spectromètrie de masse le plus couramment utilisé pour le séquençage est l'ionisation par électronébuliseur ("ElectroSpray Ionisation" - ESI-MS/MS).

Les fragments peptidiques issus de l'hydrolyse par la trypsine sont en solution aqueuse volatile (mélange méthanol-eau 1:1).

Cette solution est introduite dans la source par un capillaire trés fin chargé et en métal (figure ci-contre).

L'ionisation des molécules a lieu dans des conditions douces (pression atmosphérique et température ambiante) : sous l'effet d'un gaz nébuliseur (N2) et d'un champ électrique, les gouttes "explosent" (la fission Coulombique) en un brouillard de gouttelettes chargée (un électrospray).

Des ions multi-chargés comme [M + 2H]2+ sont souvent observés.

La technique ESI-MS/MS :

  • peut-être modifié en système "nanospray" (débit < 1 mL/min)
  • est trés sensible : recquière moins d'une picomole de matériel
  • est fortement affectée par les sels et détergents

ionisation par electronebuliseur

Source : Cech & Enke (2002)

Caractéristiques communes aux techniques d'ionisation MALDI (à partir d'une phase solide) et ESI (à partir d'une phase liquide) :

  • génèration de molécules protonées
  • les ions formés sont triés en fonction de leur rapport [m/z] dans un analyseur
  • couplage à différents types d'analyseurs : à temps de vol, quadripôle, secteurs magnétiques/électriques, à trappe ionique ...
  • détermination précise de la masse moléculaire jusqu'à plusieurs centaines de kDa
  • limites de détection de l'ordre de la picomole
  • analyse de mélanges complexes
  • mode de mesure en ion positif [M + H]+ pour les protéines qui ont des groupements qui captent des H+ (amide et amine)
  • mode de mesure en ion négatif [M - H]- pour l'ADN qui a des groupements qui cèdent des H+ (acide et hydroxyle)

Exemple d'appareillage :

  • spectromètre de masse MALDI-TOF : STR Applied Biosystems
  • spectromètre de masse nanoESI-Q/TOF: Q-TOF II Micromass
  • séquenceur automatique par dégradation d'Edman: Procise 494 Applied Biosystems

c. Autres types de spectromètres de masse

1. Dans les réflecteurs TOF/TOF (figure ci-dessous), une cellule de collision est située entre les les deux sections TOF. Les ions caractérisés par un certain rapport [m/z] sont séléctionnés dans la première section TOF puis fragmentés dans la cellule de collision. Les fragments sont séparés dans la seconde section TOF.

2. Une combinaison fréquemment rencontrée est de type [source électrospray - triple analyseur quadripôle] (figure ci-contre) :

  • les spectromètres de masse à quadripôles sélectionnent les ions en faisant varier un champs électrique, ce qui confère une trajectoire stable aux seul ions caractérisés par un certain rapport [m/z] choisi.
  • là aussi, les ions caractérisés par un certain rapport [m/z] sont séléctionnés par le premier quadripôle (Q1), fragmentés dans la cellule de collision (q2), et les fragments sont séparés par le troisième quadripôle (Q3).
  • dans le piège à ion linéaire ("linear ion trap" - QSTAR), les ions sont capturés par le troisième quadripôle (point rouge en Q3). Ils y sont excités par un champs électrique. Les ions en résonance sont ainsi sélectionnés et analysés (spectre de masse en tandem).

Autres spectrometres

3. Les spectromètres de masse à quadripôles/TOF combinent le premier quadripôle (Q1), la cellule de collision (q2) et un réflecteur TOF (figure ci-contre).

4. Le piège à ion 3D capture les ions comme dans le cas du piège à ion linéaire et il fragmente les ions caractérisés par un certain rapport [m/z]. Puis les fragments sont analysés (spectre de masse en tandem).

5. Les spectromètres de masse à transformée de Fourier ("Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer" - FT-ICR/MS) capturent les ions mais à l'aide d'un fort champs magnétique (5 à 10 Tesla). La figure montre la combinaison avec un piège à ions linéaire pour une plus grande efficacité d'isolement, de fragmentation et de détection des fragments.

Spectrometre quadripole

Source des figures ci-dessus : Aebersold & Mann (2003) "Mass spectrometry-based proteomics" Nature 422, 198 - 207

La protéomique ciblée ("Targeted mass spectrometry")

Elle repose sur une technique de spectrométrie de masse appelée "suivi de réaction sélectionnée" ("selected reaction monitoring" - SRM).

Principe : à l'aide d'un spectre de référence, un analyte peut être identifié sur la base de quelques ions pré-sélectionnés sans nécessiter l'intégralité complexe du spectre de fragmentation MS/MS complet. Les données de SRM sont obtenues en réglant les deux analyseurs de masse d'un spectromètre de masse à triple quadripôle de façon qu'ils ne stabilisent que les trajectoires d'ions avec des valeurs m/z prédéfinies.

Le filtrage des masses à 2 niveaux augmente la sélectivité et cette technique permet d'obtenir un rapport signal/bruit élevé pour les analytes cibles.

Des peptides de synthèse contenant des étiquettes avec des isotopes stables servent de standard internes (quantités connues d'isotopes) et permettent une quantification précise d'un analyte.

Un spectromètre de masse à triple quadripôle est constitué :

  • d'un spectromètre de masse à quadripôle Q1 : il sélectionne les ions
  • un quadripôle Q2 à radiofréquence seulement (sans analyseur de masse) : il sert de chambre de collisions
  • d'un spectromètre de masse à quadripôle Q3 : il sélectionne les ions fragmentés

Spectrometre quadripole

Source : Gillette & Carr (2013)

Le quadripôle Q1 est réglé pour sélectionner un ion de masse connue, qui est fragmenté dans le quadripôle Q2. Le quadripôle Q3 est réglé pour balayer la gamme entière de m/z, donnant des informations sur les tailles des fragments générés.

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6. Quelques données pour l'interprétation des spectres de masse de peptides

a. Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectromètrie de masse en tandem

  • Voir la nomenclature "Mascot"
  • Voir l'interprétation du spectre de masse du 2-pentanol (P. Dubreuil)
  • Roepstorff & Fohlman (1984) "Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides" Biomed. Mass Spectrom. 11, 601

Les ions (sous-peptides ou acides aminés) qui résultent de la fragmentation des peptides par ionisation / collision sont notés de la manière suivante :

1. si la fragmentation a lieu au niveau de la liaison peptidique :

  • ion b : il contient la partie N-terminale du peptide fragmenté
  • ion y : il contient la partie C-terminale du peptide fragmenté

2. si la fragmentation a lieu au niveau d'une autre liaison :

  • ion a ou c : il contient la partie N-terminale du peptide fragmenté
  • ion x ou z : il contient la partie C-terminale du peptide fragmenté

3. ion immonium : ion composé d'un fragment interne d'un seul résidu d'acide aminé (clivage mixte de type a et de type y).

Le chiffre qui accompagne la lettre indique le nombre d'acides aminés dans le fragment.

Nomenclature des fragments peptidiques

Source : Khatun et al. (2007)

Nomenclature des ions

Figure ci-contre : Exemple de diagramme de fragmentation (en haut) et séquence qui en est déduite.

Les valeurs de masses des ions b ou y sont celles indiquées sur le diagramme.

Source : Suh et al. (2011)

Diagramme fragmentation mass spectrometry MS spectra

Sequence deduite diagramme fragmentation MS

Ci-dessous : spectre de masse et ions générés pour le peptide VLDLAAYYATQPK (Branca et al., 2007).

Exemples de spectre de masse

Interprétation spectre masse

b. Valeurs de masses monoisotopiques et moyennes des résidus d'acides aminés

Acide aminé (code une lettre) Valeurs de masse monoisotopique Moyenne   Acide aminé (code une lettre) Valeurs de masse monoisotopique Moyenne
Alanine (A) 71.03711 71.0788   Leucine (L) 113.08406 113.1594
Arginine (R) 156.10111 156.1875   Lysine (K) 128.09496 128.1741
Asparagine (N) 114.04293 114.1038   Methionine (M) 131.04049 131.1926
Acide aspartique (D) 115.02694 115.0886   Phénylalanine (F) 147.06841 147.1766
Cystéine (C) 103.00919 103.1388   Proline (P) 97.05276 97.1167
Acide glutamique (E) 129.04259 129.1155   Serine (S) 87.03203 87.0782
Glutamine (Q) 128.05858 128.1307   Thréonine (T) 101.04768 101.1051
Glycine (G) 57.02146 57.0519   Tryptophan (W) 186.07931 186.2132
Histidine (H) 137.05891 137.1411   Tyrosine (Y) 163.06333 163.1760
Isoleucine (I) 113.08406 113.1594   Valine (V) 99.06841 99.1326

Voir le tableau qui permet de connaitre la différence de masse induite par une substitution (valeurs de masse monoisotopique)

(ExPASy - "Protein Identification Tools")


Modification post-traductionnelle

Différence de masse

(monoisotopique / moyenne)

  Modification post-traductionnelle

Différence de masse

(monoisotopique / moyenne)

Acétylation 42.0106 / 42.0373   Méthylation 14.0157 / 14.0269
ADP-ribosylation 541.0610 / 541.30   Myristoylation 210.1984 / 210.3598
Amidation -0.9840 / -0.9847   Palmitoylation 238.2297 / 238.4136
Biotinylation 226.0776 / 226.2934   Phosphorylation 79.9663 / 79.9799
Hydroxylation 15.9949 / 15.9994   Sulfatation 79.9568 / 80.0642

Pour calculer la masse d'un peptide :

  • on fait la somme des masses monoisotopiques des résidus d'acides aminés du peptide.
  • la masse monoisotopique est elle-même la somme des masses exactes de chaque isotope stable le plus léger de chaque atome d'une molécule (d'un résidu d'acide aminé en l'occurence).
  • on ajoute la masse de H2O (18.01056)
  • on ajoute celle du proton (1.00785) pour obtenir [M+H]+
  • si les méthionines sont oxydées on ajoute 15.99491
  • si les cystéines portent des résidus d'acrylamide on ajoute 71.0371
  • si les cystéines sont iodoacétylées on ajoute 58.0071
  • on ajoute la masse liée à une éventuelle modification post-traductionnelle

Pour un cours plus détaillé sur l'interprétation des spectres de masse en protéomique, aller à "De Novo Peptide Sequencing Tutorial" - "IonSource.Com".

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7. Identification des protéines par des méthodes bioinformatiques

La bioinformatique permet d'analyser les spectres MS/MS pour identifier les protéines d'un échantillon complexe.

Deux voies d'identification se distinguent par le type de banque utilisée pour le criblage : banque de séquences protéiques vs. banque de séquences génomiques.

Dans le cas des banques de séquences protéiques, on distingue deux approches dites "directe" et "indirecte".

a. Approche "directe"

Elle correspond à l'identification automatique des protéines par une analyse MS/MS virtuelle à partir de toutes les séquences protéiques d'une banque de données.

Les séquences des protéines d'une banque de données sont hydrolysées in silico puis pour chaque peptide résultant, un spectre MS/MS théorique est calculé : on obtient une empreinte ou PMF théorique.

identification automatique des protéines par une analyse MS/MS virtuelle

Voir : Chamrad et al. (2004)

Exemple de logiciel : "Prospector", "Mascot", "Profound"

Ensuite, le spectre de la protéine inconnue est comparé à l'ensemble de ces spectres théoriques.

L'approche directe est basée sur l'information de masse des peptides : elle est donc rapide.

 

Comparaison de masses

L'approche directe a deux limites :

  • l'identification d'une protéine n'est possible que si elle est déjà répertoriée dans les banques utilisées.
  • les séquences expérimentales et celles obtenues in silico doivent coïncider exactement : en effet, la substitution d'un acide aminé peut induire un déplacement des masses des ions qui rend les deux spectres trés différents.

Remarque : La tolérance massique ("mass tolerance") est un paramètre important des logiciels (100 ppm = 1000.0 ± 0.1 Da).

b. Approche "indirecte"

L'identification de la protéine étudiée en passe par une étape intermédiaire : l'interprétation du spectre MS/MS qui consiste à le convertir en une ou plusieurs séquence(s) peptidique(s) possible(s). C'est ce que l'on appelle le séquençage "de novo".

Cette ou ces séquence(s) potentielle(s) est/sont ensuite comparée(s) à celles des banques de données comme SwissProt par exemple.

L'approche indirecte s'appuient donc sur des logiciels qui recherchent les similarités entre séquences. Or ces logiciels sont conçus pour accepter des variations (substitution, insertion ou délétion d'acides aminés).

Ainsi, l'approche indirecte (contrairement à l'approche directe) permet de repérer dans les banques de données des séquences en acides aminés non totalement identiques mais présentant des analogies avec la séquence déduite du décryptage du spectre MS/MS.

La limitation de l'approche indirecte réside dans l'interprétation du spectre MS/MS qui est coûteuse en temps et essentiellement "manuelle".

L'approche indirecte et indirecte

Source : Vandenbrouck et al. (2005)

Comme certaines régions des spectres MS/MS sont difficiles à interpréter, Matthias Mann et Matthias Wilm ont préconisé de restreindre l'interprétation de ces spectres à la détermination d'une sous-séquence que l'on appelle étiquette peptidique ("Peptide Sequence Tags" - PST).

Une PST est donc (figure ci-contre) :

  • une courte séquence de 3 à 5 acides aminés qui correspond à une zone interprétable du spectre MS/MS. On l'appelle la partie syntaxique du PST
  • cette séquence est encadrée par deux valeurs de masse (en dalton - Da) des parties N- et C-terminales du fragment peptidique. Ces masses correspondent aux zones non interprétées du spectre MS/MS

Ces étiquettes sont utilisées pour cribler les banques de données.

etiquette peptidique

Source : "Bioinformatique en protéomique"

c. PepLine : annotation des génomes par l'analyse MS/MS

Les logiciels "Taggor", "PMMatch" et "PMClust" (création Rhône-Alpes-Génopole / "Helix" - INRIA Rhône-Alpes / Genome Express) constituent la suite logiciel "PepLine" qui permet une annotation automatisée des génomes à partir des données de spectromètrie de masse MS/MS.

1. Etape de conversion / interprétation des spectres MS/MS

Le module "Taggor" génère toutes les étiquettes (séquence de 3 acides aminés) possibles à partir d'un spectre MS/MS et leur attribue un score.

Les 10 (en général) meilleures PST sont retenues.

spectrometrie masse mass spectrometry proteomics

Source : CEA

2. Etape de localisation (figure ci-dessous)

Le module "PMMatch" localise les PST fournis par le module "Taggor" sur les séquences des banques (protéines ou ADN génomique).

Etape de localisation spectrometrie masse mass spectrometry proteomics

Source : Vandenbrouck et al. (2005)

  • la localisation d'une PST sur une séquence des banques est validée ("hit complet") quand la partie syntaxique du PST et la séquence correspondent exactement et que les deux masses du PST sont compatibles avec les séquences adjacentes.
  • une PST peut correspondre à plusieurs emplacements sur les séquences.
  • pour la localisation sur un génome, les PST sont positionnés sur les produits de traduction dans les six phases de l'ADN génomique.
  • des hits partiels peuvent également être générés quand une seule des deux masses du PST est compatible avec les séquences adjacentes. Dans le cas de génome d'organismes eucaryotes, les hits partiels révèlent potentiellement les frontières intron / exon des gènes.

3. Etape de regroupement (figure ci-dessous)

Le module "PMClust" regroupe ("cluster") les hits trouvés.

spectrometrie masse mass spectrometry proteomics

Source : Vandenbrouck et al. (2005)

Le regroupement des hits permet d'associer les PST à une protéine ou à un gène. La validité statistique du regroupement est évaluée par un score.

  • protéines : les hits sont regroupés sur la base de leur appartenance à une même protéine.
  • génomes d'organismes eucaryotes : les hits localisés sur un même brin sont regroupés par une méthode de regroupement par voisinage basée sur une distance seuil (exemple : d = 1500 nucléotides).
  • génomes d'organismes procaryotes : la méthode de regroupement utilise les codons STOP et non la distance.

Quelques programmes

pour l'analyse bioinformatique

en protéomique

Recherche dans les bases de données Mascot
SEQUEST
InSpecT
PEAKS
Tandem
Sipros
séquençage "de novo" PEAKS
PepNovo
Lutefisk
Recherche d'homologie d'étiquettes ("Tag homology search") CIDentify
SPIDER
MS-BLAST
FASTA
MS-Homology
GutenTag
Séquençage de protéines CHAMPS
CSPS
"Cross-linked peptides" xQuest / xProphet
pLink

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8. Protéomique quantitative

a. La technique ICAT

La technique de marqueurs d'affinité contenant un isotope d'identification ("Isotope Coded Affinity Tags" - ICAT) permet de comparer l'abondance relative des protéines entre 2 échantillons (exemple : conditions normale vs. pathologique).

Elle est plus rapide (séparation par chromatographie) et automatisable que les gels bi-dimensionnels.

Le groupement thiol -SH des cystéines des protéines réagit avec l'iodoacétamide des réactifs ICAT.

Les réactifs ICAT possèdent 8 atomes d 'hydrogène portés par un bras espaceur (figure ci-contre) :

  • soit légers : X = hydrogène, réactif d0-ICAT
  • soit lourds : X = deutérium, réactif d8-ICAT

reactifs ICAT

Source : Gygi et al. (1999)

Chaque échantillon est marqué par un seul type de réactif.

Les 2 échantillons sont mélangés et les protéines de ce mélange sont hydrolysées par la trypsine.

Les peptides sont séparés par chromatographie d'affinité sur avidine par l'intermédiaire du groupement biotine porté par les réactifs.

Les peptides identiques sont élués ensemble puisqu'ils ne différent que par la présence de l'isotope.

Les peptides identiques sont analysés ensemble par spectromètrie de masse, ce qui permet de quantifier leur abondance relative et d'identifier les protéines.

Source : Gygi et al. (2000)

ICAT traitement echantillons

ICAT abondance relative

b. La technique 2D-DIGE ("two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis")

Unlu et al. (1997) "Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts" Electrophoresis 18, 2071 - 2077

Cette technique est basée sur le marquage direct des lysines (réaction du groupement ε-aminé avec le groupement ester du pigment) des protéines de 3 échantillons distincts par des pigments fluorophore cyanine :

  • l'échantillon en condition témoin : cyanine 3 (Cy3™)
  • l'échantillon traité : cyanine 5 (Cy5™)
  • un standard interne : cyanine 2 (Cy2™)

cyanine 2 et 5

Source : GE Healthcare

cyanine l émission fluorescence couleur
Cy2™ 506 nm vert
Cy3™ 570 nm orange
Cy5™ 670 nm rouge

Les 3 échantillons sont mélangés et une électrophorèse bi-dimensionnelle est effectuée sur un même gel.

La technique 2D-DIGE

Source : MedicalProteomics

A la différence de la technique ICAT, la quantification repose sur l'analyse d'images (exemple : "Typhoon™") et non sur une comparaison des quantités relatives de protéines entre les échantillons

Celà souligne l'importance d'un standard interne pour les étapes ultérieures de normalisation (exemple : logiciel "DeCyder™").

c. Protéomique "en vrac" ("Shotgun Proteomics")

α. "Multidimensional Protein Identification Technology" - MudPIT - Washburn et al. (2001)

Principe de MudPIT :

  • Un mélange de protéines est digéré par la trypsine.
  • Le mélange de peptides qui en résulte est séparé par un système composé de deux gels de chromatographie successifs (en tandem), relié à un spectromètre de masse (MS/MS) en tandem : le premier gel est un échangeur de cations, le deuxième gel est une phase reverse.
  • Une concentration de sel donnée permet l'élution de certains peptides de l'échangeur de cations vers la phase reverse.
  • Les peptides qui se fixent sur la phase reverse sont élués par un gradient d'éthanol et analysés par spectrométrie de masse en tandem.
  • Une fois l'élution de la phase reverse terminée, une concentration de sel plus importante est appliquée à l'échangeur de cations pour éluer d'autres peptides vers la phase reverse.
  • Une vingtaine de ces cycles peuvent ainsi être réalisés.
  • l'assignation des peptides à des protéines est effectuée par des algoritmes spécifiques comme SEQUEST.

La technologie MudPIT est un processus hautement automatisé qui permet la caractérisation de milliers de protéines et, en particulier, de protéines :

  • de valeurs de pI extrême
  • faiblement abondantes
  • membranaires

C'est cependant une démarche trés onéreuse et trés gourmande en moyen d'analyse informatique.

Par ailleurs, le problème majeur de cette approche "en vrac" est l'ambiguité pour assigner des peptides communs à différentes protéines, à l'inverse de l'approche par gel bi-dimensionnel où les protéines sont séparées au préalable.

β. Les techniques de chromatographies pour l'étude de peptides spécifiques

De nombreuses études de protéomique focalisent sur des familles spécifiques de peptides. Les peptides issus de l'hydrolyse enzymatique des protéines de l'échantillon sont séparés et enrichis par des techniques de chromatographie liquide à haute performance ("high Performance Liquid Chromatography" - HPLC) avant l'analyse par spectromètrie de masse.

Cette approche est fréquemment utilisée pour l'étude de profils d'expression quantitatifs car elle est supposée introduire un biais quantitatif moindre dans l'échantillon biologique.

Chromatographie des phospho-peptides: un moyen pour enrichir le contenu en peptides phosphorylés d'un échantillon est la chromatographie d'affinité sur métaux immobilisés ("Immobilized Metal Affinity Chromatography" - IMAC). Un ion métallique (fer ou gallium) est fixé à une résine d'acide imino-diacétique. Ce complexe de cation trivalent fixent les phospho-peptides (et les peptides fortement acides) par chélation.

Hydrophobicité: c'est un paramètre physico-chimique très important de certains peptides utilisé en chromatographie d'hydrophobicité ("Ion-pairing Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography" - RP-HPLC).

La chromatographie d'affinité : des protéines ou des complexes protéiques spécifiques, des protéines de la surface cellulaire sont sélectivement capturés par un ligand immobilisé sur la résine. Par exemple, des anticorps pour l'immunoprécipitation, des petites molécules pour le marquage des sites actifs, le complexe [lectine/hydrazide] pour la capture de protéines glycosylées, ...
A l'inverse, la chromatographie d'affinité peut être utilisée pour éliminer des protéines abondantes qui ne font pas l'objet de l'étude de protéomique.

L'isolement des peptides N-terminaux par la technique COFRADIC ("COmbined FRActional DIagonal Chromatography") : 2 séparations chromatographiques consécutives identiques avec une étape de modification chimique entre les 2 séparations qui permet de cibler le sous-ensemble des peptides N-terminaux.

La chromatographie d'échange d'ions : des techniques combinées de chromatographie d'échange d'anions puis de cations permettent d'analyser des peptides de faible abondance (Zhou et al., 2010).

γ. Depôts publics de données, consortium, bases de données en protéomique

consortium "ProteomeXchange"
PRIDE ("The PRoteomics IDEntifications")
NextProt
"Protein Ontology"
MIAPE ("Minimum Information about a Proteomics Experiment")
QARIP ("Quantitative Analysis of Regulated Intramembrane Proteolysis")
HUPO ("Human Proteome Organization") : vise à recenser tous les protéines possibles et peptide dans le plasma humain
Phosphorylation, ubiquitylation, acétylation et N-glycosylation
Human Protein Reference Database PhosphoMotif Finder
PhosphoSitePlus

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9. Exemples d'application

a. Le protéome membranaire de la levure

Les assemblages macromoléculaires impliquant des protéines membranaires ont des rôles biologiques vitaux et sont des cibles privilégiées de médicaments.

Une étude protéomique a été effectuée pour purifier à grande échelle ("large-scale affinity purification") puis caractériser le plus grand nombre de complexes [protéines - protéines membranaires] de Saccharomyces cerevisiae. Ces complexes ont été solubilisés à partir des divers types de membranes des organites par l'utilisation de détergents non-dénaturants.

Des complexes impliquant 1.144 protéines membranaires intégrales (intrinsèques), 400 protéines membranaires périphériques (extrinsèques) et 46 protéines membranaires ancrées dans la membrane via des lipides ont ainsi été isolées.

L'identité des protéines co-purifiées a été déterminée par spectromètrie de masse en tandem et une annotation en fonction des compartiments cellulaires (Gene Ontology).

Cette étude a permis d'établir une carte très précise de 1.726 interactions physiques entre [protéines co-purifiées et protéines membranaires] et de mettre en évidence 501 complexes hétéromèriques associés aux divers systèmes membranaires.

  • MIPS : "Munich Information Center for Protein Sequences"
  • BioGRID : "Biological General Repository for Interaction Datasets"

Figure a : Nombre de protéines membranaires que les auteurs ont essayé de purifier par compartiment de la levure.

Figure b : Fraction des protéines membranaires marquées et purifiées selon l'annotation en fonction des compartiments cellulaires (Gene Ontology).

Source : Babu et al. (2012)

proteome membrane levure saccharomyces

b. Le protéome de la matrice mitochondriale de l'homme

Les méthodes traditionnelles pour les études protéomiques d'organites se traduisent souvent par une spécificité limitée des protéines étudiées, la perte de matériel biologique et d'éventuelles contaminations du fait des étapes d'isolement des organites et de purification de leur contenu en protéines.

Une méthode récente permet de minimiser ces inconvénients : elle utilise un marquage spécifique des protéines de la matrice de la mitochondrie par la biotine, tandis que la cellule est vivante, avec toutes ses membranes et ses complexes protéiques intacts et que les relations spatiales entre les protéines sont préservées.

La méthode utilise une enzyme, l'ascorbate peroxidase (APEX), modifiée par ingénierie. L'APEX est spécifiquement adressée à la matrice mitochondriale par fusion à un peptide d'adressage de 24 acides aminés. Une fois dans la matrice mitochondriale, l'APEX marque par biotinylation (liaison covalente) les protéines voisines (mais pas les protéines lointaines) dans les cellules vivantes.

L'APEX est active dans tous les compartiments cellulaires et elle oxyde de nombreux dérivés du phénol en radicaux phénoxyl.

Ces radicaux :

  • ont une durée de vie courte (< 1 ms)
  • un petit rayon de marquage (< 20 nm)
  • peuvent former des liaisons covalentes avec les acides aminés riches en électron comme Tyr, Trp, His et Cys
  • ont une propriété capitale : ils ne traversent pas la membrane mitochondriale. Ils ne marquent donc que les protéines de la matrice ou les régions exposées vers la matrice des protéines de la membrane interne.

Le marquage covalent est fait par l'addition de [biotine (B) - phénol] et de H2O2. Les cellules sont ensuite lysées et les protéines biotinylées sont récupérées avec des billes sur lesquelles est fixée la streptavidine. Les protéines sont ensuite éluées, séparées sur gel et identifiées par spectromètrie de masse.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin

Source : Rhee et al. (2013)

Cette étude a permis :

  • d'identifier 495 protéines de la matrice mitochondriale dont 464 étaient déjà annotées "mitochondrie". Ainsi 31 protéines qui n'étaient pas annotées sont désormais associées à la mitochondrie ou à la matrice mitochondriale.
  • d'améliorer l'annotation de 240 protéines en spécifiant leur localisation sub-mitochondriale matricielle.
  • d'associer à la matrice mitochondriale 6 protéines dont on pensait qu'elles étaient localisées dans la membrane externe ou dans l'espace intermembranaire.

proteome matrice mitochondriale inner outer matrix mitochondria biotin

Source : Rhee et al. (2013)

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10. Liens Internet et références bibliographiques

SWISS-2DPAGE Two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis database (ExPASy)

ExPASy Proteomics tools

Vandenbrouck et al. (2005) "Protéomique : analyse des données issues des spectromètres de masse" Biofutur 252, 29 -31

Swiss 2D-PAGE

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"Mt PROTEOMICS : a site dedicated to the symbiotic proteomics of Medicago truncatula root" (INRA - CNRS - Université de Bourgogne)

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"Arabidopsis thaliana Seed Proteome" (CNRS - INRA - Bayer)

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"La bioinformatique en protéomique : analyse des spectres de masse" - F. Rechenmann & I. Quinkal

Site "Ion source" : spectromètrie de masse. Contient aussi des cours et exercices appliqués à la protéomique à faire en ligne.

Master Protéomique - Université Lille

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Ion source

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