Purification de la glutamate deshydrogénase EC 1.4.1.4 de la semence de Pisum sativum - Marie-Hélène Guilleux - 2004 Présentation du stage |
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Voir un ensemble de cours de biochimie. Voir un ensemble d'exercices pour travaux pratiques de Biochimie (item 21). |
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1. Etude du métabolisme de l'azote et de son implication dans les processus de germination a. Amélioration de la qualité des semences La germination est la phase qui est induite par l'imbibition des graines et qui s'achève par l'émergence de la radicule. La phase qui lui succède est appelée croissance post-germinative. Au champ, ce qui est primordial pour l'agriculteur, c'est d'atteindre un taux de germination (encore appelé pouvoir germinatif), un taux de levée et un taux d'installation des plantules les plus élevés possible. La levée doit être homogène et l'installation des plantules doit correspondre à un peuplement régulier et occuper un maximum de place. Ces paramètres attendus de manière optimale par l'agriculteur dépendent directement de la qualité de la semence, c'est-à-dire non seulement de son porte-graine et de ses conditions de conservation, mais également de la qualité intrinsèque exprimée par son génotype. Il faut également préciser que les graines de protéagineux comme le pois Pisum sativum sont très riches en protéines de réserve qui représentent la seule source azotée dans la graine. Ces graines sont, par conséquent, très riches en azote. b. Acquisition de connaissances biochimiques pour répondre à des besoins agronomiques L'induction de la germination par l'imbibition des graines entraîne une reprise des activités respiratoires et métaboliques qui déclenche la mobilisation des réserves. Chez le pois Pisum sativum, la nature des réserves est principalement protidique, pouvant atteindre 40% (Lafon et al, 1988). Dans un premier temps, il a été démontré chez Medicago truncatula (une autre légumineuse) qu'un flux massif d'azote est libéré dans la graine lors de la germination. Les fortes concentrations en azote (sous forme ammonium libre) sont toxiques pour les cellules qui doivent en être débarrassées. L'azote est alors assimilé pour former des acides aminés : c'est la détoxication. En effet, dans un deuxième temps, il est également proposé qu'un métabolisme d'acides aminés est très actif au cours de la germination. Il contribuerait non seulement à une synthèse protéique, mais également à fournir des nutriments pour la croissance des nouveaux tissus et à la synthèse de sucres dans la graine. L'intérêt s'est porté sur les enzymes du métabolisme de deux acides aminés (glutamate et glutamine), reconnus pour jouer un rôle central dans le métabolisme azoté. La glutamine synthase (GS) et la glutamate synthase (GOGAT) sont les enzymes directement impliquées dans ce métabolisme. Mais il existe une autre enzyme, la glutamate déshydrogénase (GDH), dont le rôle a été largement remis en question depuis la découverte du cycle GS/GOGAT. Elle est proposée pour catalyser la réaction de dégradation du glutamate (Glu) pour générer de l'α-cétoglutarate (α-KG) et du NADH (désamination). Il est également accepté qu'en cas de situation de stress, comme un fort taux d'azote dans la graine, elle pourrait contribuer à la détoxication de l'ammonium en l'assimilant pour faire du Glu (amination). Chez Medicago truncatula, il est démontré que le taux de cette enzyme augmente pendant la germination, et que son activité est davantage aminante in vitro. Ceci confirmerait son rôle de détoxication de l'azote lors de stress.
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2. But du stage On peut considérer la première réaction d'assimilation de l'azote (sous forme d'ammoniac) par la glutamate déshydrogénase (GDH) comme point d'entrée dans ce métabolisme. L'atome d'azote est à l'origine de la fonction α-aminée des acides aminés. Il existe trois isoformes de GDH :
La GDH est une enzyme allostérique, une déshydrogénase qui n'est active qu'en présence de NAD(P)H/NAD(P)+. Les études réalisées sur des matériels biologiques différents, montrent que :
La GDH est une enzyme ubiquitaire. Cependant, il existe une distribution cellulaire selon l'isoforme considérée. Chez le soja, comme chez de nombreux autres individus, l'isoforme NADH-dépendante [EC 1.4.1.2] se trouve principalement dans les mitochondries, alors que l'isoforme NADPH-dépendante [EC 1.4.1.4] est présente dans les chloroplastes (Bhadula & Shargool, 1991). On suppose que la GDH aurait un rôle dans l'assimilation de l'ammonium sous des conditions de stress tels que l'obscurité prolongée, les températures élevées, la salinité, la pollution atmosphérique, la senescence, ou encore le flux d'azote toxique lors de la germination, et donc contribuerait à la détoxication des cellules. De plus, sans situation de stress, la GDH aurait un rôle dans l'oxydation du glutamate pour fournir des squelettes carbonés utilisés dans le cycle de Krebs (Robinson et al., 1991). Il est intéressant de purifier l'iso-enzyme GDH [EC 1.4.1.4] . |
