Purification de la glutamate deshydrogénase EC 1.4.1.4 de la semence de Pisum sativum - Marie-Hélène Guilleux - 2004 Etudes préliminaires à la purification de la glutamate déshydrogénase (GDH) |
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Voir un cours sur le effets des paramètres physico-chimiques sur l'activité enzymatique. Voir un ensemble d'exercices pour travaux pratiques de Biochimie (item 21). |
L'isoforme de glutamate déshydrogénase étudiée est celle qui catalyse essentiellement la réaction de synthèse du glutamate, soit l'isoforme EC 1.4.1.4. Matériel biologique : semences de pois Pisum sativum imbibées pendant 12 et 22 heures. |
| 1. Choix du tampon d'extraction | ||
| Hepes (pKa = 7.55) | 50 mM pH7.5 | Le Tris-HCl augmente la vitesse de la réaction désamination chez Trypanosoma cruzi |
| EDTA | 2 mM | Inhibiteur des métallo-protéases |
| β -mercaptoéthanol | 1 mM | Anti-oxydant |
| PMSF | 1 mM | Inhibiteur des protéases à sérine |
2. Rapport masse de semences/volume tampon d'extraction Plusieurs rapports ont été testés pour optimiser le volume de tampon d'extraction par rapport à la masse de semence à broyer (1g/4mL, 1g/5mL, 1g/10mL, 1g/20mL, 1g/30mL).
Il faut donc retenir le rapport où peu de protéines totales sont extraites mais où une bonne activité GDH est conservée, soit le rapport 1g/4mL.
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| 3.
La
précipitation au sulfate d'ammonium
Après broyage des semences dans du tampon d'extraction, une centrifugation (30 min, 27000 g, 4°C) est effectuée et le surnageant est récupéré. C'est l'extrait brut. L'extrait brut est précipité au sulfate d'ammonium à 70% de saturation. Après centrifugation (30 min, 27000 g, 4°C), le culot est récupéré dans du tampon d'extraction auquel est ajouté du sulfate d'ammonium 20% de saturation. Pour ôter la grande quantité de sel qui donne une trop grande force ionique et qui pourrait dénaturer les protéines, l'échantillon est dialysé contre 5L de tampon d'extraction toute une nuit à 4°C. Ce dialysat va ensuite subir plusieurs étapes de chromatographies. |
| 4.
Mesure de l'activité
enzymatique
a) Concentrations en substrats et coenzyme Il faut déterminer les concentrations optimales en substrats et en coenzyme pour lesquelles l'enzyme a une activité maximale. L'activité enzymatique se mesure en présence d'une concentration en substrats et en coenzyme environ 10 fois supérieures au Km le plus élevé de la littérature : [α-cétoglutarate] = 20 mM; [NH4Cl] = 50 mM; [NADPH] = 0.2 mM. b. Température La vitesse de catalyse des enzymes dépend de la température. Une température de 30°C est choisie. Le spectrophotomètre qui permet le dosage de la GDH est thermostaté à cette température. c. Effet du pH Le pH a une forte influence sur l'activité des enzymes. Pour cette raison, il est essentiel de déterminer le pH optimum pour lequel l'activité enzymatique est maximale. Dans cette étude, le pH pour lequel l'activité GDH est maximale est de 6.8.
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