Voir la thématique générale.

Voir un cours sur la chromatographie.

Voir un ensemble d'exercices pour travaux pratiques de Biochimie (item 21).

1ère partie : purification 

a. Extrait brut et précipitation au sulfate d'ammonium

La première étape de purification ne permet d'obtenir qu'un facteur de purification proche de 1. Suite à la précipitation au sulfate d'ammonium, 64% des protéines totales sont récupérées, cette étape a donc contribué à éliminer des protéines.

Cependant, seulement 59% de l'activité totale aminante GDH est récupérée. Cette perte d'activité enzymatique peut s'expliquer par l'inactivation de la GDH suite au traitement au sulfate d'ammonium. L'importante force ionique induite par le sel peut provoquer la dénaturation de l'enzyme.

L'activité désaminante de la GDH est de 14181 nmol.min^-1 dans l'extrait brut et de 8448 nmol.min^-1 dans l'échantillon après précipitation au (NH₄)₂SO₄. Donc il y autant d'activité aminante que d'activité désaminante. Plusieurs hypothèses peuvent expliquer ces résultats :

• Soit il y a autant de GDH [EC 1.4.1.2] qui catalyse préférentiellement la désamination que de GDH [EC 1.4.1.4] qui catalyse préférentiellement l'amination.
• Soit il n'y a que l'isoforme GDH [EC 1.4.1.3] qui catalyse autant la désamination que l'amination.

b. Chromatographie échangeuse d'anions DEAE-cellulose

Voir les résultats.

N'ayant pas de données concernant l'enzyme étudiée, nous ne savions pas si l'enzyme allait se fixer ou non sur les groupements diéthylaminoéthyle (DEAE) du gel. 49% de l'activité totale aminante de la GDH est retrouvée après élution avec NaCl. Donc, 83% de l'activité aminante est retrouvée par rapport à l'étape précédente.

La protéine s'est accrochée, ce qui signifie qu'à pH 7.5, la NADPH-GDH a une charge globale électrique négative.

Cette expérience nous donne une information supplémentaire. Le pKa de la DEAE est de 9.5, c'est-à-dire qu'à pH 9.5, la DEAE a une charge globale électrique nulle. A pH 7.5 (soit pKa-2), la charge électrique globale de la DEAE est positive.

Pour s'accrocher, l'enzyme doit avoir une charge globale électrique négative à pH 7.5. Ainsi, on en déduit que le point isoélectrique de l'enzyme est aux environs de 5.5, c'est-à-dire qu'à pH 5.5, l'enzyme porte autant de charges positives que de charges négatives.

Cette donnée est importante car elle caractérise l'enzyme. Cependant, la valeur devra être précisée sur la NADPH-GDH pure.

Cette étape de purification permet un rendement en activité totale aminante GDH de 49% et 43% des protéines totales sont récupérées. Le facteur de purification augmente et atteint 1.76, tout comme l'activité spécifique de la GDH (6.7 nmol.min^-1.mg^-1).

De plus, sur le profil d'élution, deux pics sont observés. Ces deux pics sont semblables tant au niveau de l'activité totale, de l'activité spécifique, du facteur de purification, de la quantité de protéines totales, qu'au niveau du rendement. Ces deux pics peuvent s'expliquer par l'existence de plusieurs isoformes de GDH.

En ce qui concerne l'activité désaminante, elle n'est retrouvée que dans le POOL 1 à raison de 704 nmol.min^-1.

Différentes interprétations des résultats du POOL 1 peuvent être faites :

• Il peut s'agir de l'activité désaminante de l'isoforme [EC 1.4.1.2]. Dans ce cas, cette étape de purification aurait permis de séparer partiellement l'isoforme [EC 1.4.1.4] de l'isoforme [EC 1.4.1.2] car 44% de l'activité aminante est retrouvée dans le POOL 1 contre 8% de l'activité désaminante, par rapport à l'étape de précipitation au sulfate d'ammonium.
• Il peut s'agir de l'activité désaminante que l'isoforme [EC 1.4.1.4] est capable d'avoir de façon non préférentielle, qui représenterait 19% de l'activité aminante. Dans ce cas, il n'y aurait que de la GDH [EC 1.4.1.4] présente dans ce pool.

Aucune activité désaminante n'est retrouvée dans le POOL 2. A nouveau, ceci peut s'expliquer par :

• Il peut s'agir de l'isoforme [EC 1.4.1.4] qui a été éluée plus tard que le premier pool. Ce phénomène peut être dû au traitement au sulfate d'ammonium qui a pu altérer la structure tertiaire et donc implique une différence de comportement.
• Il peut s'agir de l'isoforme [EC 1.4.1.3] qui réagit de cette façon dans les conditions (pH...) choisies.

Pour chacun des deux pools, il peut également s'agir d'un mélange d'isoformes.

c. Chromatographie d'affinité pigments

Voir les résultats.

Le gel Pigments est constitué d'une résine verte sur laquelle sont liés de façon covalente des ligands qui ont une structure semblable à celle du NAD(P). Les enzymes dépendantes des cofacteurs NAD(P) vont pouvoir s'y fixer. En effet, la majorité de l'activité totale aminante GDH est récupérée après élution au NaCl (33% par rapport à l'étape de purification précédente).

Beaucoup de protéines totales sont éliminées à la suite de cette étape (il ne reste que 2.4% de protéines totales par rapport à l'étape précédente), ce qui permet d'atteindre un facteur de purification de 23.89. L'activité spécifique augmente aussi et atteint 90.8 nmol.min^-1.mg^-1, ce qui est une preuve de l'efficacité de la purification.

De plus, chaque pool issu de la chromatographie DEAE-cellulose donne lieu à deux pools après élution au NaCl sur gel Pigments. Le POOL A ne contenant que très peu d'activité totale NADPH-GDH et le POOL C ayant été perdu, les travaux suivants sont réalisés sur le POOL B et le POOL D.

Le POOL B est le pool qui contient la plus forte activité totale aminante GDH et c'est celui où une activité désaminante est retrouvée. Cette dernière représente 20% de l'activité aminante. Il n'y a pas d'activité désaminante dans le POOL D. Ces résultats sont cohérents avec les résultats trouvés après la chromatographie DEAE-cellulose. Les conclusions sont donc identiques à celles faites lors de la précédente étape.

d. Chromatographie d'affinité NAD/ATP

Voir les résultats.

Cette chromatographie permet de séparer les protéines NAD-dépendantes qui vont s'accrocher au gel, des protéines NADP-dépendantes qui seront éluées. Ainsi, s'il y a de la GDH NAD-dépendante, soit l'isoforme [EC 1.4.1.2], alors il faut espérer qu'elle sera totalement séparer de l'isoforme [EC 1.4.1.4].

Dans le POOL B, l'activité totale aminante est de 1733 nmol.min^-1, soit un rendement de 94% par rapport au POOL B de la chromatographie précédente. La quantité de protéines totales est de 14.83 mg soit un peu plus que dans l'étape précédente. Cette valeur est sans doute surestimée. Cette chromatographie montre qu'il n'y a pas eu purification par rapport à la chromatographie pigments.

L'activité désaminante est de 340 nmol.min^-1, soit 90% de l'activité désaminante de l'étape précédente. L'activité désaminante représente à nouveau 20% de l'activité aminante. Or, avec ce type de chromatographie, les enzymes spécifiques du NAD restent accrochées au gel.

Ainsi, ces résultats confirmeraient l'hypothèse que l'activité désaminante mesurée est bien celle de la GDH [EC 1.4.1.4] qu'elle catalyse de façon non préférentielle, et par conséquent, la GDH [EC 1.4.1.4] serait bien séparée de la GDH [EC 1.4.1.2].

En ce qui concerne le POOL D, l'activité totale aminante diminue et le rendement n'est que de 1% (soit 32% récupérés par rapport à l'étape précédente). La quantité de protéines totales diminue aussi mais le facteur de purification augmente et atteint 20.12, ainsi que l'activité spécifique qui est égale à 76.47 nmol.min^-1.mg^-1. Pour ce pool, il y a eu purification.

2ème partie : Poids moleculaire de l'enzyme native et de ses sous-unités

a. Chromatographie d'exclusion sterique Superdex G200 

Voir les résultats.

Dans le POOL B, on retrouve une protéine d'un PM d'environ 360 kDa, ce qui pourrait correspondre au PM de la GDH [EC 1.4.1.4]. En effet, dans la littérature, il est proposé que les GDH [EC 1.4.1.4] soient des hexamères de 300 kDa. La valeur peut être également un peu surestimée, ceci dû aux manipulations. Les autres protéines éluées ont un PM plus faible et ne semblent pas correspondre à de la GDH.

Dans le POOL D, il y a des protéines de 158 kDa. Peut-être correspondent-elles à des GDH [EC 1.4.1.4] clivées en deux à cause des traitements appliqués.

Les mesures des activités totales aminantes et désaminantes n'ayant pas été réalisées, il est difficile de conclure précisément sur la nature des protéines composant les différents pics.

b. Electrophorèse SDS-PAGE 

De plus, si on prend en compte les résultats de l'électrophorèse SDS-PAGE, il y a des protéines dont les sous-unités ont un PM de 45 kDa dans le POOL B et de 48 kDa dans le POOL D à l'issue de la chromatographie Pigments. Or, la littérature suggère que les GDH [EC 1.4.1.4] ont des sous-unités de 50 kDa. Les PM des sous-unités du POOL B et D se rapprocheraient de cette valeur.

Les conclusions restent difficiles étant donné qu'aucune électrophorèse n'a été réalisée sur les derniers échantillons

3. Conclusions et Perspectives

En regard de l'ensemble des résultats, plusieurs hypothèses peuvent être émises. A l'issue des trois premières chromatographies DEAE-cellulose, Pigments, NAD/ATP, une forte activité aminante de la GDH est présente dans le POOL 1 et dans le POOL B (qui provient lui-même du POOL 1).

Une activité désaminante est également mesurée à chacune des étapes de chromatographie, et elle représente à chaque fois 20% de l'activité aminante. Ce qui nous laisse penser qu'il s'agit de l'activité de l'isoforme [EC 1.4.1.4] qui catalyse préférentiellement la réaction d'amination.

De plus, les résultats de la chromatographie gel-filtration montrent la présence d'une protéine de 360 kDa. Cette valeur de masse molaire se rapproche des valeurs de GDH [EC 1.4.1.4] de la littérature.

D'après le profil électrophorétique du POOL B sur pigments, des sous-unités protéiques de 45 kDa sont retrouvées et correspondent quasiment aux valeurs de sous-unités (50 kDa) de GDH [EC 1.4.1.4] de la littérature. On peut donc supposer avoir partiellement isoler la GDH [EC 1.4.1.4] de Pisum sativum à l'issue des manipulations.

En ce qui concerne le POOL D issu du POOL 2 de DEAE-cellulose, les conclusions sont plus difficiles. Il n'y a que de l'activité aminante mesurée à chaque étape de chromatographie.

• Peut-être est-ce une autre des isoformes de GDH, ce qui confirmerait l'existence de plusieurs pools.
• Peut-être est-ce la GDH [EC 1.4.1.4] qui est dénaturée ou altérée à cause des traitements appliqués. L'altération peut faire perdre la structure tertiaire et quaternaire, ce qui expliquerait les différences de comportement ionique, d'affinité ou encore de poids moléculaire, par rapport à la protéine native.
• En effet, il pourrait s'agir de la GDH [EC 1.4.1.4] clivée en deux car on retrouve des protéines de 158 kDa et des sous-unités de 48 kDa dans ce pool.

Le protocole de purification doit être terminé pour conclure.

A l'issue de la chromatographie Superdex G200, différents pics de protéines sont détectés. Il faut à présent mesurer les activités aminante et désaminante sur chacun des pics des POOLS B et D. Puis une électrophorèse SDS-PAGE doit être réalisée sur ces échantillons.

Ainsi, les protéines des pools présentant une forte activité aminante pourront être séquencées. Par comparaison avec les séquences des GDH [EC 1.4.1.4] d'autres organismes, on pourra savoir si la protéine purifiée est bien la GDH [EC 1.4.1.4] de semences de pois.

Si l'enzyme purifiée est la GDH [EC 1.4.1.4], une première caractéristique a été déterminée. En effet, le pI de cette enzyme semble être aux alentours de 5.5 d'après les résultats de la chromatographie échangeuse d'anions DEAE-cellulose. Il pourra être précisé sur de la GDH pure.

Du point de vue enzymatique, il sera alors possible de déterminer les propriétés cinétiques de l'enzyme (Km, Vmax, inhibiteurs...) ainsi que sa structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire.

Enfin, il sera intéressant d'isoler le ou les gènes régulant cette iso-enzyme et il sera également possible de synthétiser des anticorps anti-GDH [EC 1.4.1.4] de pois afin de réaliser des dosages rapides de l'enzyme chez différents lots de semences.