I. Conditions de culture et d'expression de l'HSP22 recombinante chez Escherichia coli

II. Effet des additifs (cuivre OU calcium ET/OU sorbitol)

II-A. Sur la croissance de E. coli B834(DE3)pLysS et la concentration des protéines totales
II-B. Sur le taux d'HSP22 recombinante surexprimée

1. La souche B834(DE3)pLysS a été cultivée, à 37°C, dans différentes conditions de milieu de culture, avec ou sans induction de l'expression de l'HSP22 recombinante par addition d'IPTG 0,4 mM.

Un schéma synoptique du protocole détaille la procédure suivie.

Le tableau I ci-dessous résume les différentes conditions de culture :

2. Pour chaque condition, deux aliquotes (1 mL) du milieu de culture ont été prélevés à différents temps de culture. Le témoin 0 heure est un échantillon prélevé juste avant d'induire ou non l'expression : voir le traitement des échantillons.

3. Sur chaque échantillon, les mesures suivantes ont été effectuées :

• la mesure de l'absorbance à 600 nm
• la détermination de la concentration en protéines par la méthode de Bradford (1976)
• la séparation des protéines sur gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes (Laemmli, 1970)

• la souche E. coli B834(DE3)pLysS
• les caractéristiques de l'ADNc cloné et du vecteur d'expression
• celles de la l'HSP22

II. Effet des additifs (cuivre OU calcium ET/OU sorbitol)

II-A. Croissance de E. coli B834(DE3)pLysS et la concentration des protéines totales

1. Les courbes de croissance de E. coli B834(DE3)pLysS pour chacune des 12 conditions décrites dans le tableau I sont présentées dans la Figure 1.

2. La concentration en protéines totales a été mesurée pour chaque échantillon par la méthode de Bradford (Figure 2). Les valeurs reportées sur cette figure sont la moyenne de duplicate ou de triplicate (selon l'échantillon), après des cycles de congélation/décongélation.

3. Cependant, ni l'absorbance à 600 nm ni la concentration en protéines totales ne sont des paramètres significatifs en soit dans cette étude. En effet :

• La présence de sorbitol ralentit la cinétique de croissance des bactéries (Figure 1).
• Dans les figures 1A & 1B, l'absorbance au bout de 8 heures de culture est plus élevée car l'ensemencement a été effectué avec un plus grand nombre de bactéries (A600 plus élevée à t = 0).
• Les prélèvements étant effectués aux mêmes temps de culture, le nombre de bactéries diffère donc d'un échantillon à l'autre.

4. Pour tenir compte de ces différences, nous avons normalisé la concentration en protéines totales en la divisant par la valeur d'absorbance à 600 nm mesurée pour chaque échantillon au moment du prélèvement, soit le paramètre : [P] / A₆₀₀.

Les résultats sont présentés dans la Figure 3.

II-B. Taux d'HSP22 recombinante surexprimée

Ce taux a été analysé avec des gesl d'électrophorèse sur polyacrylamide (11%) en conditions dénaturantes (après coloration au bleu de Coomassie). Les dépôts sur gel ont été de volume identique (15 µL) pour tous les échantillons.

Pour toutes les expériences, nous avons considéré que la bande de masse molaire (M. M.) apparente = 21,5 kDa correspond à la forme mature de l'HSP22 recombinante parce que :

• Cette M. M. apparente est proche de la masse prédite 19, 5 kDa : pas d'explication de cette différence de migration.
• Cette bande n'apparaît que lorsqu'il y a induction de l'expression (argument est nuancé ci-après) et son intensité augmente avec le temps d'induction.
• En regard de l'intensité relative de toutes les bandes (donc les protéines de E. coli), celle-ci est sans conteste la plus intense (logique pour une protéine sur-exprimée).

Pour chaque piste des gels, l'intensité de toutes les bandes et celle de la bande correspondant à la forme mature de l'HSP22 recombinante ont été déterminées avec le logiciel de densitomètrie NIH Image 1.59 (voir ci-dessous).