Synthèse des ADNc

(voir un schema synoptique)

Le principe du système utilisé repose sur la méthode décrite par Okayama & Berg (1982) et les modifications apportées par Gubler & Hoffman (1983).

a. Synthèse du premier brin

  • la première étape est l'hybridation entre l'amorce oligo(dT) et la queue Poly-A+ des ARNm avec un rapport optimal [amorces oligo(dT):ARNm] (volume:masse) de 0.5 痞 par 痢 ;
  • le tableau suivant indique les volumes utilisés pour chaque matériel biologique :

Matériel biologique

Pisum sativum

Medicago truncatula

Temps d'imbibition

12 h

22 h

10 h

30 h

ARNm (無)

13

13

10

10

ARNm (痢)

1

0,2

non quantifiable

1

amorce oligo(dT) (無)

1

0,2

1

1

Eau - DEPC (無)

1

1,8

4

4

  • les ARNm et les amorces oligo(dT) (0,5 痢/無) sont incubés 10 min à 70°C (linéarisation des acides nucléiques) puis le mélange est immédiatement mis à 0°C pour éviter tout repliement des ARNm ;
  • la seconde étape est la rétro - transcription des ARNm en ADN simple brin, catalysée par la réverse trancriptase à 42°C pendant 1 h. Au mélange [amorces oligo(dT):ARNm] sont ajoutés :
  1. 5 無 de tampon de synthèse du premier brin : Tris-HCl 250 mM, pH 8,3 ; KCl 250 mM ; MgCl2 50 mM ; DTT 50 mM ; spermidine 2,5 mM ; dATP - dCTP - dGTP - dTTP 5 mM chacun ;
  2. un inhibiteur de ribonucléases 40 U ;
  3. 2,5 無 pyrophosphate de Na 40 mM ;
  4. AMV réverse trancriptase 30 U (AMV : Avian Myeloblastosis Virus) ;
  5. un volume d'eau - DEPC tel que le volume final soit de 25 無.

b. Synthèse du second brin

  • elle s'effectue à 14°C pendant au moins 2 h (3 à 4 h pour des ADNc de taille supérieure à 3 kb). Au milieu de synthèse du premier brin sont ajoutés :
  1. 50 痞 de tampon de synthèse du second brin (Tris-HCl 100 mM, pH 7,2 ; KCl 225 mM ; MgCl2 7,5 mM ; BSA 0,125 mg/ml ; DTT 7,5 mM) ;
  2. ADN polymérase I 23 U ; RNase H 0,8 U) ;
  3. un volume d'eau - DEPC tel que le volume final soit de 125 無.
  • un choc thermique de 10 min à 70°C arrête la réaction. La synthèse du second brin est achevée à 37°C pendant 10 min par la T4 DNA polymérase (2U par 痢 d'ARNm). La réaction est arrêtée en ajoutant 10 無 EDTA 200 mM.

c. Purification des ADNc

  • les ADNc sont purifiés par une extraction des enzymes au phénol:chloroforme:AIA (125:24:1) suivie d'une centrifugation (12000 g, 2 min) ;
  • les ADNc (phase aqueuse) sont précipités par addition de 0,5 volume d'acétate d'ammonium 7,5 M et de 2,5 volumes d'éthanol 96 % puis centrifugés (12000 g, 5 min). Le culot est lavé à l'éthanol 70 % puis centrifugé (12000 g, 5 min) ;
  • enfin, le culot contenant les ADNc purifiés est repris dans 10 à 20 無 de TE 10:1.

L'efficacité de synthèse des ADNc a été évaluée par une amplification RPC en utilisant différents couples d'amorces :

  • GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3)
  • EF1a : facteur de transcription
  • GS1a : isoforme 1 cytosolique de la glutamine synthétase de Medicago truncatula
  • GS : isoforme cytosolique de la glutamine synthétase de Pisum sativum
  • Voir les séquences des amorces

d. Bibliographie

  • Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) "A simple and very efficient method for generating cDNA libraries" Gene 25, 263 - 269
  • Okayama, H. & Berg, P. (1982) "High-efficiency cloning of full-length cDNA" Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170