Synthese ADNc Construction banque ADNc graine Pisum sativum Medicago truncatula germination biochimej

Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Synthèse des ADNc

Le principe du système utilisé repose sur la méthode décrite par Okayama & Berg (1982) et les modifications apportées par Gubler & Hoffman (1983).

Voir un schéma synoptique du protocole suivi.

a. Synthèse du premier brin

Première étape : hybridation entre l'amorce oligo(dT) et la queue poly-A⁺ des ARN messagers (ARNm) avec un rapport optimal [amorces oligo(dT):ARNm] (volume:masse) de 0,5 µl par µg.

Le tableau suivant indique les volumes utilisés pour chaque matériel biologique :

Matériel biologique	Pisum sativum		Medicago truncatula
Temps d'imbibition	12 h	22 h	10 h	30 h
ARNm (µL)	13	13	10	10
ARNm (µg)	1	0,2	non quantifiable	1
amorce oligo(dT) (µL)	1	0,2	1	1
Eau - DEPC (µL)	1	1,8	4	4

Les ARNm et les amorces oligo(dT) (0,5 µg/µL) sont incubés 10 min à 70°C (linéarisation des acides nucléiques) puis le mélange est immédiatement mis à 0°C pour éviter tout repliement des ARNm.

Seconde étape : rétrotranscription des ARNm en ADN simple brin, catalysée par la réverse trancriptase à 42°C pendant 1 h. Au mélange [amorces oligo(dT):ARNm] sont ajoutés :

5 µL de tampon de synthèse du premier brin : Tris-HCl 250 mM, pH 8,3 ; KCl 250 mM ; MgCl₂ 50 mM ; DTT 50 mM ; spermidine 2,5 mM ; dATP - dCTP - dGTP - dTTP 5 mM chacun
Un inhibiteur de ribonucléases 40 U
2,5 µL pyrophosphate de Na 40 mM
AMV réverse trancriptase 30 U (AMV : Avian Myeloblastosis Virus)
Un volume d'eau - DEPC (diéthyl pyrocarbonate, inhibiteur des RNases) tel que le volume final soit de 25 µL

b. Synthèse du second brin

Elle s'effectue à 14°C pendant au moins 2 h (3 à 4 h pour des ADNc de taille supérieure à 3 kb). Au milieu de synthèse du premier brin sont ajoutés :

50 µl de tampon de synthèse du second brin (Tris-HCl 100 mM, pH 7,2 ; KCl 225 mM ; MgCl₂7,5 mM ; BSA 0,125 mg/ml ; DTT 7,5 mM)
ADN polymérase I 23 U et RNase H 0,8 U
Un volume d'eau - DEPC tel que le volume final soit de 125 µL

Un choc thermique de 10 min à 70°C arrête la réaction.

La synthèse du second brin est achevée à 37°C pendant 10 min par la T₄ DNA polymérase (2U par µg d'ARNm). Cette synthèse est arrêtée en ajoutant 10 µL EDTA 200 mM.

c. Purification des ADNc

Les ADNc sont purifiés par une extraction des enzymes au phénol:chloroforme:alcool isoamylique (125:24:1) suivie d'une centrifugation (12000 g, 2 min).

Les ADNc (phase aqueuse) sont précipités par addition de 0,5 volume d'acétate d'ammonium 7,5 M et de 2,5 volumes d'éthanol 96 % puis centrifugés (12000 g, 5 min). Le culot est lavé à l'éthanol 70 % puis centrifugé (12000 g, 5 min).

Enfin, le culot contenant les ADNc purifiés est repris dans 10 à 20 µL de Tris EDTA (TE) 10:1.

L'efficacité de synthèse des ADNc a été évaluée par une amplification RPC en utilisant différents couples d'amorces :

GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3)
EF1a : facteur de transcription
GS1a : isoforme 1 cytosolique de la glutamine synthétase de Medicago truncatula
GS : isoforme cytosolique de la glutamine synthétase de Pisum sativum
Voir les séquences des amorces

d. Bibliographie

Gubler, U. & Hoffman, B. J. (1983) "A simple and very efficient method for generating cDNA libraries" Gene 25, 263 - 269
Okayama, H. & Berg, P. (1982) "High-efficiency cloning of full-length cDNA" Mol. Cell. Biol. 2, 161 - 170