L'ADN peut être quantifié à l'aide du colorant fluorescent Hoechst® 33258 qui s'y lie spécifiquement. L'excitation est effectuée à 360 nm et l'émission de fluorescence est mesurée à 405 nm.

La concentration en ADN de l'échantillon est calculée par comparaison avec des étalons d'ADN de concentration connue (Haq et al. (1997) J. Mol. Biol. 271, 244 -257).

250 ng d'ADNc sont ligués à 10 pmoles d'adaptateurs EcoRI, pendant une nuit à 15°C dans un milieu contenant :

• T₄ DNA ligase 2,5 U
• 3 µl de BSA acétylée
• 3 µl de tampon de ligase (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 ; MgCl₂ 100 mM ; DTT 100 mM ; dATP 5 mM)
• de l'eau - DEPC (diéthyl pyrocarbonate, inhibiteur des RNases) tel que le volume final soit de 30 µl.

Le vecteur λ gt11 - EcoRI  est déphosphorylé. Il est donc nécessaire de phosphoryler l'extrémité cohésive des adaptateurs.

Au milieu de ligation sont ajoutés :

• T₄ polynucléotide kinase 10 U
• 2 µl de dATP 100 mM
• 4 µl de tampon de kinase (Tris-HCl 700 mM, pH 7,6 ; MgCl₂ 100 mM ; DTT 50 mM)
• de l'eau - DEPC tel que le volume final soit de 40 µl
• le milieu réactionnel est incubé à 37°C pendant 30 min

Les ADNc sont ensuite purifiés par une extraction des enzymes au phénol:chloroforme (24:1) saturé en TE, pH 8, suivie d'une centrifugation (12000 g, 2 min).

La phase aqueuse contient les ADNc ligués aux adaptateurs EcoRI phosphorylés à l'extrémité cohésive.

c. Elimination de l'excès d'adaptateurs

Ils sont éliminés par une chromatographie sur un tamis moléculaire (gel Sephacryl® S400). En ce qui concerne les fragments d'ADN, la limite d'exclusion de ce gel est de 271 pb, les adaptateurs (12 pb + 4 bases à l'extrémité cohésive) sont donc retenus.

• On dépose la phase aqueuse sur le gel dans un tube Eppendorff® contenant un fritté et percé à son extrémité inférieure et les ADNc sont élués par une centrifugation (800g, 5 min).
• Les ADNc sont ensuite précipités puis lavés et repris dans du TE 10:1.

L'efficacité de ces étapes a été évaluée par une amplification PCR en utilisant le couple d'amorce GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3).

d. Ligation des ADNc - adaptateurs EcoRI au bras du phage λ gt11 - EcoRI

Afin d'optimiser cette étape, certaines conditions sont requises :

• Le phage λ gt11 - EcoRI est déphosphorylé pour éviter sa recircularisation;
• En considérant la taille du phage λ gt11 - EcoRI (43 kpb) et une taille moyenne d'ADNc de 1,5 kpb, 2 rapports molaires [bras:ADNc] ont été testés pour augmenter la probabilité de ligation : 3:1 et 1:1. Le premier est recommandé de manière générale et le second est préconisé pour le phage λ gt11 - EcoRI. La concentration des [ADNc - adaptateurs EcoRI phosphorylés] a été déterminée par fluorimétrie avec le réactif de Hoescht®.
• Un témoin de ligation sans ADNc permet d'estimer la proportion de phage λ gt11 - EcoRI recircularisé donc non déphosphorylés.

Le schéma ci-dessous résume les différentes étapes de ce protocole :

• 2 µL de phage l gt11 - EcoRI (soit 0,036 pmoles)
• T₄ DNA ligase 12,5 U
• 1 µl de tampon de ligase (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 ; MgCl₂ 100 mM ; DTT 100 mM ; dATP 5 mM)
• de l'eau - DEPC tel que le volume final soit de 10 µl