Préparation des inserts ADNc
a. Ligation des adaptateurs EcoRI

L'ADN peut être quantifié à l'aide du colorant fluorescent Hoechst® 33258 qui s'y lie spécifiquement. L'excitation est effectuée à 360 nm et l'émission de fluorescence est mesurée à 405 nm. La concentration en ADN de l'échantillon est calculée par comparaison avec des étalons d'ADN de concentration connue [Haq, I., Ladbury, J.E., Chowdhry, B.Z., Jenkins, T.C., Chaires, J.B. (1997) J. Mol. Biol. 271, 244 -257].

250 ng d'ADNc sont ligués à10 pmoles d'adaptateurs EcoRI, pendant une nuit à 15°C dans un milieu contenant :

  1. la T4 DNA ligase 2,5 U ;
  2. 3 Ál de BSA acétylée ;
  3. 3 Ál de tampon de ligase (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 ; MgCl2 100 mM ; DTT 100 mM ; dATP 5 mM) ;
  4. de l'eau - DEPC tel que le volume final soit de 30 Ál.

 

b. Phosphorylation de l'extrémité cohésive des adaptateurs EcoRI ligués aux ADNc

Le vecteur l gt11 - EcoRI  est déphosphorylé. Il est donc nécessaire de phosphoryler l'extrémité cohésive des adaptateurs. Au milieu de ligation sont ajoutés :

  1. la T4 polynucléotide kinase 10 U ;
  2. 2 Ál de dATP 100 mM ;
  3. 4 Ál de tampon de kinase (Tris-HCl 700 mM, pH 7,6 ; MgCl2 100 mM ; DTT 50 mM) ;
  4. de l'eau - DEPC tel que le volume final soit de 40 Ál.
  • le milieu réactionnel est incubé à 37°C pendant 30 min ;
  • les ADNc sont ensuite purifiés par une extraction des enzymes au phénol:chloroforme (24:1) saturé en TE, pH 8, suivie d'une centrifugation (12000 g, 2 min) ;
  • la phase aqueuse contient les ADNc ligués aux adaptateurs EcoRI phosphorylés à l'extrémité cohésive.

 

 

c. Elimination de l'excès d'adaptateurs

Ils sont éliminés par une chromatographie sur un tamis moléculaire (gel Sephacryl® S-400). En ce qui concerne les fragments d'ADN, la limite d'exclusion de ce gel est de 271 pb, les adaptateurs (12 pb + 4 bases à l'extrémité cohésive) sont donc retenus.

  • on dépose la phase aqueuse sur le gel dans un tube Eppendorff® contenant un fritté et percé à son extrémité inférieure et les ADNc sont élués par une centrifugation (800g, 5 min) ;
  • les ADNc sont ensuite précipités puis lavés et repris dans du TE 10:1.

L'efficacité de ces étapes a été évaluée par une amplification RPC en utilisant le couple d'amorce GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3).

 

d. Ligation des ADNc - adaptateurs EcoRI au bras du phage l gt11 - EcoRI

Afin d'optimiser cette étape, certaines conditions sont requises :

  • le phage l gt11 - EcoRI est déphosphorylé pour éviter sa recircularisation ;
  • en considérant la taille du phage l gt11 - EcoRI (43 kpb) et une taille moyenne d'ADNc de 1,5 kpb, 2 rapports molaires bras:ADNc ont été testés pour augmenter la probabilité de ligation : 3:1 et 1:1. Le premier est recommandé de manière générale et le second est préconisé pour le phage l gt11 - EcoRI. La concentration des [ADNc - adaptateurs EcoRI phosphorylés] a été déterminée par fluorimétrie avec le réactif de Hoescht® .
  • un témoin de ligation sans ADNc permet d'estimer la proportion de phage l gt11 - EcoRI recircularisé donc non déphosphorylés.

Schéma ci-contre :

les différentes étapes de ce protocole

 

Le tableau ci-contre résume les différentes conditions de ligation testées :

La ligation est effectuée à 4°C pendant 18 heures dans un milieu contenant :

  1. 2 ÁL de phage l gt11 - EcoRI (soit 0,036 pmoles) ;
  2. la T4 DNA ligase 12,5 U ;
  3. 1 Ál de tampon de ligase (Tris-HCl 300 mM, pH 7,8 ; MgCl2 100 mM ; DTT 100 mM ; dATP 5 mM) ;
  4. de l'eau - DEPC tel que le volume final soit de 10 Ál.

matériel biologique

Pisum sativum

Medicago truncatula

temps d'imbibition

12 h

22 h

10 h

30 h

rapport molaire bras/ADNc

1/1

3/1

1/1

3/1

1/1

3/1

1/1

3/1

volume ADNc (ÁL)

4

1,2

3

1

3

1

3

1

quantité ADNc (pmoles)

0,032

0,010

0,032

0,011

0,032

0,011

0,011

0,034