Encapsidation des phages lambda recombinants

L'encapsidation de phages in vitro utilise un système bactérien mis au point par Rosenberg et coll. (1985, 1987) :

  • en conséquence, les particules de phage qui se développent dans la bactérie hôte n'ont pour origine que les phages recombinants qui ont transfecté cette bactérie et non pas les phages préalablement contenus dans le lysat. Ces derniers ont pour rôle de fournir le matériel génétique minimal pour la multiplication des phages recombinants et leur encapsidation ;
  • de plus, la souche E. coli C est particulière car son génome ne code pas le système des enzymes de restriction de la famille E. coli K-12 (EcoK).

a. Encapsidation

  • 5 l de chaque milieu de ligation (environ 0,5 g d'ADN de phage recombinant) ont donc été ajoutés à 50 l de milieu d'encapsidation de phage (système " Packagene®", Promega, France) et incubés à 22°C pendant 3 heures ;
  • puis 445 L de tampon de phage (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4 ; NaCl 100 mM ; MgSO4 10 mM) et 25 L de chloroforme sont ajoutés au mélange d'encapsidation.

Les phages recombinants empaquetés sont conservées à -70°C après supplémentation en DMSO 7% et en gélatine 0,01%.

  • un contrôle de l'efficacité de l'encapsidation est effectué en encapsidant le phage l cI857 Sam7 (déjà circularisé et sans insert) dans les mêmes conditions ;
  • l'efficacité de ces étapes a été évaluée par une amplification RPC des milieux d'empaquetage en utilisant le couple d'amorce "GDH" (ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3) et le couple d'amorce spécifique du phage l gt11.

b. Bibliographie

  • Rosenberg S. M., Stahl M. M. , Kobayashi I. & Stahl F.W. (1985) "Improved in vitro packaging of coliphage lambda DNA : a one-strain system free from endogenous phage" Gene 38, 165 - 175
  • Rosenberg S. M. (1987) "Improved in vitro packaging of lambda DNA" Methods Enzymol. 153, 95 - 103