Transfection de E. coli LE 392 et détermination du titre des banques d'ADNc

a. Culture de E. coli LE392

La souche bactérienne a été cultivée soit :

  • dans du milieu liquide LB (bactotryptone 10 g/l ; extrait de levure 5 g/l ; NaCl 5 g/l) supplémenté en MgSO4 10 mM et en maltose 0,2 %.
  • sur milieu solide (milieu LB avec 15 g/l d'agar).

Ces milieux de culture ont été stérilisés par autoclavage (121°C ; 20 min).

Une pré-culture de nuit à 37°C a été effectuée en ensemençant 1,5 mL de LB supplémenté avec une colonie isolée de E. coli LE 392 fraîchement étalée. Puis 50 ml de LB supplémenté ont été ensemencés avec 500 ÁL de la pré-culture. Les bactéries ont été cultivées à 37°C jusqu'à une valeur de densité optique à 600 nm de 0,6 - 0,8 (phase exponentielle de croissance).

 

b. Transfection de E. coli LE392

Chaque milieu d'empaquetage a été dilué au 1/100, au 1/1 000 et au 1/10 000 dans du tampon de phage (les témoins ont été dilués au 1/10 000).

Les bactéries sont ensuite transfectées par les phages en mélangeant 100 ÁL de milieu d'empaquetage dilué à 100 ÁL de culture bactérienne. Le mélange est incubé à 37°C et le temps d'adsorption des phages varie de 30 min à 1 heure.

  • le maltose induit l'expression de la protéine Lam B qui est un transporteur du maltose (maltoporine) ancré dans la membrane externe de la bactérie et sur laquelle s'adsorbe spécifiquement le phage l ;
  • le magnésium, quant à lui, est essentiel pour la stabilité du phage.

Schéma modifié de "Applied Molecular genetics"

Voir une splendide photographie

de l'adsorption du phage l sur E. coli.

c. Étalement

Les 200Ál de milieu d'adsorption ont été ajoutés à 3ml de TB "top agar" (bactotryptone 10 g/l ; NaCl 5 g/l ; agar 8 g/l ; MgSO4 10 mM) préalablement chauffé à 46°C (pour maintenir ce milieu à l'état liquide) puis le tout est étalé sur du milieu LB solide (préchauffé à 37°C).

 

d. Lyse des bactéries et détermination du titre

Les 200Ál de milieu d'adsorption ont été ajoutés à 3ml de TB "top agar" (bactotryptone 10 g/l ; NaCl 5 g/l ; agar 8 g/l ; MgSO4 10 mM) préalablement chauffé à 46°C (pour maintenir ce milieu à l'état liquide) puis le tout est étalé sur du milieu LB solide (préchauffé à 37°C).

Après une nuit à 37°C, les plages de lyse apparaissent sous la forme de petites zones circulaires translucides. Le titre de la banque est calculé en ramenant le nombre de plages de lyse à la dilution du milieu d'empaquetage et à 1 mL de culture bactérienne.