Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Transfection de E. coli LE 392 et détermination du titre des banques d'ADNc


Voir la thématique générale.

a. Culture de E. coli LE392

La souche bactérienne a été cultivée soit :

  • Dans du milieu liquide LB (bactotryptone 10 g/l ; extrait de levure 5 g/l ; NaCl 5 g/l) supplémenté en MgSO4 10 mM et en maltose 0,2 %.
  • Sur milieu solide (milieu LB avec 15 g/l d'agar).

Ces milieux de culture ont été stérilisés par autoclavage (121°C pendant 20 min).

  • Une pré-culture de nuit à 37°C a été effectuée en ensemençant 1,5 mL de LB supplémenté avec une colonie isolée de E. coli LE 392 fraîchement étalée.
  • Puis 50 ml de LB supplémenté ont été ensemencés avec 500 µL de la pré-culture.
  • Les bactéries ont été cultivées à 37°C jusqu'à une valeur de densité optique à 600 nm de 0,6 - 0,8 (phase exponentielle de croissance).

Retour haut de page

b. Transfection de E. coli LE392

Chaque milieu d'empaquetage a été dilué au 1/100, au 1/1 000 et au 1/10 000 dans du tampon de phage (les témoins ont été dilués au 1/10 000).

Les bactéries sont ensuite transfectées par les phages en mélangeant 100 µL de milieu d'empaquetage dilué à 100 µL de culture bactérienne. Le mélange est incubé à 37°C et le temps d'adsorption des phages varie de 30 min à 1 heure.

  • Le maltose induit l'expression de la protéine Lam B qui est un transporteur du maltose (maltoporine) ancré dans la membrane externe de la bactérie et sur laquelle s'adsorbe spécifiquement le phage .
  • Le magnésium, quant à lui, est essentiel pour la stabilité du phage λ.

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

Schéma modifié de Applied Molecular genetics

Voir une photographie de l'adsorption du phage λ sur E. coli :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

Retour haut de page

c. Étalement

Les 200µl de milieu d'adsorption ont été ajoutés à 3ml de TB ("Terrific Broth") top agar (bactotryptone 10 g/l ; NaCl 5 g/l ; agar 8 g/l ; MgSO4 10 mM) préalablement chauffé à 46°C (pour maintenir ce milieu à l'état liquide) puis le tout est étalé sur du milieu LB solide (préchauffé à 37°C).

d. Lyse des bactéries et détermination du titre

Après une nuit à 37°C, les plages de lyse apparaissent sous la forme de petites zones circulaires translucides. Le titre de la banque est calculé en ramenant le nombre de plages de lyse à la dilution du milieu d'empaquetage et à 1 mL de culture bactérienne.

Voir la phase de lysogénie et la phase lytique du phage λ :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

Retour haut de page

Valid XHTML 1.0 Transitional