Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Extraction des ARN totaux


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Pour chacun des 2 temps d’imbibition (12 h et 22 h), les ARN totaux ont été extraits à partir de 4 g de graines entières de Pisum sativum. Ceux de Medicago truncatula ont été fournis par une équipe de l'ex-UMR PMS.

a. Mesures d'absorbance

La concentration des ARN totaux et l'éventuelle contamination par d'autres types de macromolécules sont déterminées en mesurant l'absorbance à trois longueurs d'onde :

  • 260 nm (253 nm < λmax < 271 nm) : longueur d'onde moyenne d'absorbance maximale des ribonucléotides 5'-monophosphate. La concentration des acides nucléiques est calculée à partir de la relation : 1 unité d'absorbance à 260 nm = 40 µg/mL
  • 277 nm : contamination par les protéines à pH 7 (λmax du noyau indole des Trp) et les polyphénols
  • 230 nm : contamination par les polysaccharides
Matériel biologique imbibition concentration ARN totaux contaminations
volume
(µL)
A260 concentration
(µg/mL)
A277 A260/A277 A230 A260/A230
Pisum sativum 12 h 2000 0,239 976 0,114 2 0,121 1,97
22 h 2000 0,129 528 0,063 2,04 0,074 1,74
Medicago truncatula 10 h 500 0,136 270 0,091 1,49 0,075 1,81
30 h 500 0,281 556 0,186 1,51 0,152 1,84
Les valeurs indiquent une faible contamination par les protéines / polyphénol pour Pisum sativum et une faible contamination par les polysaccharides pour tous les échantillons (sauf Pisum sativum 22h).

Spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 12 h :

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Spectre d'absorbance des ARN totaux de Pisum sativum imbibition 22 h :

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b. Gels d'électrophorèse (agarose 1%) en conditions dénaturantes

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A : imbibition 22 heures - 4 µg; B : imbibition 12 heures - 8 µg

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A : axes embryonnaires imbibés 10 heures; B : cotylédons imbibés 10 heures
C : axes embryonnaires imbibés 30 heures; D : cotylédons imbibés 30 heures

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c. Comparaison avec des ARN totaux qualité commerciale

Le gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes révèle des ARN totaux (puits 1) peu dégradés : on voit une bande de faible intensité en bas du gel pouvant correspondre à de très courts fragments issus d'une hydrolyse partielle par des RNases. De plus, il n'y a pas de contamination visible par de l'ADN génomique.

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Source : Clontech

M : marqueurs de masse molaire / 1 : ARN totaux de placenta humain
Les deux bandes les plus intenses (environ 1,9 kb et 4,5 kb) correspondent respectivement aux ARN ribosomiques 18S et 28S.

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