Purification des ARNm et synthèse des ADNc

voir M & M ARNm

voir M & M ADNc

La quantité des ARN messagers est bien souvent trop faible pour pouvoir contrôler l'étape de purification. La purification des ARN messagers et leur rétro-transcription ont donc été indirectement contrôlées en amplifiant les ADNc de Medicago truncatula (MT) et de Pisum sativum (PS) avec différents couples d'amorces (voir séquences) :

  • EF1a : facteur de transcription
  • GS1a : isoforme 1 cytosolique de la glutamine synthétase de Medicago truncatula
  • GS : isoforme cytosolique de la glutamine synthétase de Pisum sativum
  • GDH : ensemble d'oligonucléotides dégénérés issus de l'alignement de séquences de glutamate déshydrogénase (EC 1.4.1.2 et 1.4.1.3). La taille du produit d'amplification est de 420 pb.

Les produits d'amplification ont été déposés sur gel d’électrophorèse (agarose 1 %) :

 

marqueurs

masse

molaire

MT

10 h

MT

30 h

MT

10 h

MT

30 h

marqueurs

masse

molaire

PS

12 h

PS

12 h

PS

22 h

PS

22 h

marqueurs

masse

molaire

PS

12

PS

22 h

MT

10 h

MT

30 h

EF1a
EF1a
GS1a
GS1a
GS
EF1a
GS
EF1a
GDH
GDH
GDH
GDH

Conclusion

  • seules 2 amplifications n'ont pas donné de produit (MT 30 h avec EF1a et GS1a) ;
  • on distingue une très faible bande pour [PS 22 h - GS] ;
  • enfin, les 4 amplifications avec GDH ont donné un produit.

En regard :

  • du taux de dégénérescence des amorces
  • des origines biologiques distinctes entre les échantillons amplifiés et les séquences des amorces

il semble que les étapes de purification des ARNm et de synthèse des ADNc aient convenablement fonctionné.