Construction de banques d'ADNc de semences de Pisum sativum et de Medicago truncatula

Amplification des milieux d'encapsidation des ADNc ligués aux bras du phage l gt11


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Le phage λ permet l'insertion d'ADNc d'une taille allant jusqu'à 7,2 kpb ;

  • Les trainées obtenues avec les amorces λ gt11 (partie gauche de la figure A) dépassent très largement cette taille.
  • L'absence de trainées pour les amplifications sans amorce (partie droite de la figure A) permet de conclure que celles observées avec les amorces ne correspondent pas à du matériel génomique provenant du lysat de E. coli C (le milieu d'empaquetage).
  • On peut faire l'hypothèse qu'il s'agit de produits d'amplification de ce matériel génomique (3 µL de milieu d'empaquetage).

Cette hypothèse est confortée par l'obtention de trainées de taille maximale de 7 à 8 kpb quand les amplifications sont effectuées avec un volume moindre (1 µL) de milieu d'empaquetage (Figure B).

Figure A

Amplification RPC des milieux d'empaquetage (3 µL) avec le couple d'amorces λ gt11 : la taille attendue du produit d'amplification avec ce couple d'amorces est 420 pb.

Gel d'électrophorèse sur agarose (1,5 %) :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

De gauche à droite :

  • A à H & K : milieu d'amplification avec le couple d'amorces
  • L à O : milieu d'amplification sans le couple d'amorces
  • A, B, & L : Pisum sativum imbibition 12 heures
  • C, D, & M : Pisum sativum imbibition 22 heures
  • E, F, & N : Medicago truncatula imbibition 10 heures
  • G, H, & O : Medicago truncatula imbibition 30 heures
  • K : Témoin d'encapsidation λ cI857 Sam7
  • A, C, E, G, L, M, N & O : rapport [bras:ADNc] 1:1
  • B, D, F, H : rapport [bras:ADNc] 3:1
  • I : marqueurs de masse molaire
Figure B

Amplification PCR avec 1 ou 3 µL de milieux d'empaquetage et le couple d'amorces λ gt11. Gel d'électrophorèse sur agarose (1,5 %) :

glutamate dehydrogenase vecteur clonage phage lambda gt11 extraction purification ARN totaux synthese premier second brin ADNc insert encapsidation recombinant transfection coli LE392 criblage titre banque sonde radioactive biochimej

De gauche à droite :

  • A : marqueurs de taille
  • B, D, F & H : 3 µL de milieu d'empaquetage (Pisum sativum) pour l'amplification
  • C, E & G : 1 µL de milieu d'empaquetage (Pisum sativum) pour l'amplification

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