Enoncé

Un expérimentateur dispose d'une enzyme E et d'un substrat S de cette enzyme. Par ailleurs, il dispose de deux molécules A et B. Il veut déterminer si :

• 1^ère possibilité : l'une des molécules A ou B est un second substrat et l'autre un inhibiteur.
• 2^ème possibilité : A et B sont deux inhibiteurs.

Il mesure la vitesse initiale de la réaction dans différentes conditions. Voici les résultats :

1. Si vous pensez que A ou B est un second substrat, ne faites que les représentations primaires.
Déterminez les paramètres cinétiques auxquels vous avez accès.
Donnez l'ordre de fixation des substrats.

2. Déterminez les paramètres cinétiques en absence d'inhibiteur (V_Max, K_M et k_cat).
Déterminez les paramètres cinétiques en présence du ou des inhibiteur(s).
Précisez le ou les type(s) d'inhibition et calculez la ou les constante(s) d'inhibition K_I.

3. Proposez un schéma du mécanisme réactionnel tenant compte des molécules E, S, A et B et des différentes constantes déterminées.

Remarques : toutes les concentrations doivent être exprimées en molarité.

Données : l = 1 cm ; ε_M^produit = 1230 M^-1.cm^-1 ; [E]₀ = 9 pM

Correction

Expérience A. Vitesses initiales de la réaction pour différentes concentrations de S et de A.

• Il n'y a que S et A dans cette expérience : quand la concentration de A augmente, la vitesse initiale augmente. A est un substrat, pas un inhibiteur.
• Le point de concourrance se situe sur l'axe des abcisses : A ne se fixe pas sur l'enzyme libre. Il s'agit donc d'un mécanisme ordonné et A est le second substrat.
• K_M^S = 1,25 mM

Expérience B. Vitesses initiales de la réaction pour différentes concentrations de S et de B, en présence de A à une concentration maintenue fixe.

• Dans cette expérience, on a : S, A et B.
• Quand la concentration de B augmente, la vitesse initiale diminue : B est un inhibiteur.

Les valeurs de V_Max pour chaque concentration de B sont indiquées dans le tableau dans la figure ci-dessous.

Pour [B] = 0 µM : 1/V_Max = 1 UA^-1.min  => V_Max = 1 UA.min^-1

                    1
V_Max = ---------- = 8,1 10^-4 M.min^-1 = 810 µM.min^-1
             1230 x 1

                   V_Max
=> k_cat = ------- = 9 10⁷ min^-1 = 1,5 10⁶ s^-1
                    [E]₀

Pour [B] = 0,5 µM : V_Max^app = 5,4 10^-4 M.min^-1 = 540 µM.min^-1

Pour [B] = 3 µM : V_Max^app = 4,1 10^-4 M.min^-1 = 410 µM.min^-1

            V_Max^app . [B]₀
K_B = --------------- = 1 10^-6 M = 1 µM
          (V_Max -V_Max^app)