Etude d'article : potentiel de membrane des mitochondries - tranports membranaires

Voir le cours sur les transports membranaires.

Ci-dessous, un extrait de l'article Podrabsky & Hand (2015) à analyser.

« We measured proton leak respiration as a function of the membrane potential (ΔΨM) in mitochondria isolated from diapausing and post-diapausing embryos. Because ΔΨM is the driving force for the leak, it is essential to compare proton conductances between different states only at the same driving force.

When the F1Fo-ATP synthase (complex V) is inhibited, mitochondrial respiration is then proportional to proton leak rate through the inner membrane. Accordingly, the kinetic response of the proton conductance pathway to its driving force can be measured as the relationship between respiration rate and ΔΨM when the latter is varied by titrating the electron transport system (ETS) with inhibitors.

Our results indicate clearly that proton conductance, as judged by leak respiration, does not differ between mitochondria isolated from diapausing and post-diapausing embryos (Figure 8). Consequently, because proton conductance across the inner mitochondria membrane is not restricted during diapause, ΔΨM is undoubtedly compromised. »

Figure 8 : Kinetic response of proton leak at 25°C (measured as respiration rate) as a function of the driving force (mitochondrial membrane potential, ΔΨM).

« Mitochondria were isolated from diapausing and post-diapausing embryos of Artemia franciscana.

Succinate plus rotenone was used as the substrate to support leak respiration (state 4) in the presence of oligomycin (inhibitor of the F1Fo-ATP synthase) and nigericin (K+/H+ exchanger), the latter of which served to convert the ΔpH to ΔΨM.

Stepwise addition of malonate (complex II inhibitor) was employed to progressively inhibit the electron transport system and thus lower overall ΔΨM.

Triphenylmethyl phosphonium (TPMP)-sensitive electrodes were used to measure the distribution of this lipophilic cation across the inner membrane, from which the ΔΨM was calculated with the Nernst equation. »

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Questions

a. Rechercher cet article via la base de données « Pubmed ». Qu'est Pubmed ? Une version « PMC » en accès « libre » est disponible. Qu'est PMC ?
b. Quelles sont les caractéristiques principales des [cellules / organite] étudiés ?
c. Expliquer le principe de : [électrode sensible au TPMP => mesure de la distribution du cation => calcul de ΔΨM avec l'équation de Nernst] sur la base de l'article Deutsch et al. (1979).
d. De quel processus membranaire s'agit-il ? Où se situe-t-il ?
e. Rappeler les effets du succinate, de la roténone, de l'oligomycine, de la nigéricine et du malonate sur la chaîne respiratoire et la vitesse de respiration.
f. Interpréter les résultats obtenus (figure 8 ci-dessus).

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1. PubMed est une ressource gratuite développée et maintenue par le "National Center for Biotechnology Information" (NCBI) à la "National Library of Medicine" (NLM).

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2. Artemia franciscana

Diapause

  • Arrêt programmé du développement d'un organisme. La diapause est d'une importance critique pour la survie dans des conditions environnementales extrêmes.
  • Cet arrêt est contrôlé par des facteurs physiologiques endogènes et peut ou non impliquer une diminution du métabolisme.
  • La diminution du catabolisme et de l'anabolisme se traduit par un rapport [ATP]/[ADP] stable ce qui maintient un équilibre énergétique favorable au sein des cellules en diapause.
  • En particulier, la vitesse de respiration est fortement diminuée pendant la diapause.

3. La chaîne respiratoire

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  • transfert des électrons
  • consommation d'oxygène (complexe IV)
  • expulsion des protons vers l'espace intermembranaire (force proton motrice)
  • synthèse d'ATP par l'ATP synthase avec retour de 3 protons vers la matrice (dissipation du gradient)

Complexe ou protéine de la chaîne respiratoire Entité transferée Inhibiteurs
NADH - coenzyme Q oxydoréductase (complexe I) électrons et protons roténone amytal
succinate - coenzyme Q oxydoréductase (complexe II) électrons malonate
coenzyme Q électrons et protons -----------
coenzyme Q - cytochrome c oxydoréductase (complexe III) électrons et protons antimycine
cytochrome C électron -----------
cytochrome c oxydase (complexe IV) électrons et protons KCN / CO / NaN3

La nigéricine

  • C'est un ionophore : molécule qui fixe des ions de manière réversible. Beaucoup d'ionophores sont solubles dans les lipides : ainsi ils transportent les ions en traversant les membranes.
  • Autre exemple d'ionophore : la valynomicine.
  • La nigéricine :
    1. agit comme ionophore H+, K+, Pb2+
    2. est un antibiotique
    3. est un antiport [H+ / K+]

L'oligomycine

  • Inhibiteur de la synthèse d'ATP.
  • Les inhibiteurs de la phosphorylation empêchent la consommation d'oxygène après l'addition d'ADP.
  • Ils n'ont pas d'effet sur la stimulation de la respiration par les agents découplants.

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L'ATP synthase F0F1

C'est le complexe V de la chaîne respiratoire. Il utilise le gradient de concentration de protons comme source d'énergie pour synthétiser l'ATP.

Le sigle "F" désigne un facteur de couplage, selon la nomenclature des enzymes : en effet, l'ATP synthase couple la phosphorylation de l'ADP en ATP à l'oxydation de substrats dans la mitochondrie.

  • F1 est l'élément qui catalyse la synthèse de l'ATP
  • le composant F1 de l'ATP synthase de E. coli a une stoechiométrie α3β3γδε (chaque lettre indiquant un type différent de sous-unité)
  • F0 constitue un "tunnel" à protons sur toute l'épaisseur de la membrane interne de la mitochondrie. Il a été baptisé ainsi du fait de sa sensibilité à l'oligomycine, antibiotique qui, en se fixant à F0, empêche la synthèse d'ATP
  • le composant F0 de l'ATP synthase de E. coli a une stoechiométrie a1b2c10-15

Source : Wang & Oster (1998)

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4. Principe de la mesure du potentiel de membrane de la mitochondrie avec le TPMP+

Le caractère lipophile des cations phosphonium leur permet de traverser la membrane interne mitochondriale (sans ionophore) sous l'action du potentiel de membrane : ils s'accumulent dans la matrice mitochondriale du fait de leur charge positive.

Exemples de cations lipophiles : TPP+ (cation tétraphényl phosphonium) ou TPMP+(cation triphénylmethyl phosphonium).

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Cette caractéristique permet de mesurer le potentiel de membrane des mitochondries isolées respirant en présence de succinate.

Le TPMP+ est incubé avec des mitochondries énergisées. Le cation est alors distribué, sous l'action du potentiel de membrane, entre le milieu extérieur à la mitochondrie ([TPMP+]extracellulaire) et la matrice mitochondriale ([TPMP+]intracellulaire).

On mesure :

  • soit les concentrations intracellulaire et extracellulaire en utilisant un cation radioactif (exemple : 3H-TPMP+).
  • soit la concentration extracellulaire avec une électrode ion sélective sensible au TPMP. Les mesures avec une électrode sont effectuées en temps réel et simultanément avec d'autres mesures telles que la vitesse de respiration mitochondriale. La concentration dans la matrice ([TPMP+]intracellulaire) est alors calculée à partir du volume mitochondrial et d'un facteur de correction de la fixation du cation à la membrane.

On applique alors la relation de Nernst pour calculer le potentiel de membrane :

ΔΨM = [RT / zTPMP+ . F] . ln ([TPMP+]extracellulaire / [TPMP+]intracellulaire)

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Le terme [2.303 R.T / z.F] vaut environ 60 mV à 37 ° C : il y a donc une accumulation du cation libre intracellulaire d'un facteur 10 pour un potentiel de membrane de - 60 mV.

Le potentiel de membrane de la mitochondrie est de - 120 à - 180 mV : il y a donc une accumulation de plusieurs centaines de fois dans la matrice mitochondriale.

5. Adsorption du TPMP et entrée dans la matrice mitochondriale

Figure a (ci-dessous) : adsorption sur la bicouche phospholipidique de la membrane interne des mitochondries d'un cation triphénylphosphonium (conjugué à un groupement X).

Ce mécanisme permet aux cations lipophiles d'accéder à la matrice de la mitochondrie même en absence de potentiel de membrane. En présence d'un potentiel de membrane, la distribution des cations s'équilibre conduisant à une très forte accumulation dans la matrice mitochondriale.

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Source : Ross et al. (2005)

Figure b : profil d'énergie du déplacement d'un cation TPMP+ au travers d'une bicouche phospholipidique.

On observe des puits d'énergie potentielle à proximité des groupes carbonyle des chaînes d'acides gras des phospholipides.

  • Les cations s'adsorbent à la membrane en monocouche au niveau des points correspondant à des puits d'énergie potentielle.
  • Ils traversent rapidement le coeur hydrophobe de la membrane jusqu'à un puit d'énergie potentielle situé sur l'autre face de la membrane.
  • Ils sont alors désorbés de la membrane.

Figure c : isotherme de Langmuir de l'adsorption d'un cation phosphonium sur une bicouche phospholipidique.

La fonction θ représente la fraction des sites de fixation sur la membrane occupés par le cation phosphonium en fonction de la concentration du cation, pour différentes valeurs de K (constante d'association du cation sur la bicouche phospholipidique).

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6. Signification de l'expérience représentée dans la figure 8

Lorsque l'ATP synthase est inhibée, la vitesse de respiration est proportionnelle à la vitesse de la fuite des protons au travers de la membrane interne mitochondriale.

On mesure donc la vitesse de respiration quand ΔΨM varie lorsque l'on modifie la chaîne respiratoire par des inhibiteurs :

  • le succinate : les électrons portés par le succinate entrent dans la chaîne respiratoire au niveau du complexe II
  • le succinate et la roténone sont les substrats qui amorce la respiration (état 4)
  • l'oligomycine inhibe l'ATP synthase et permet que la respiration n'entraîne que la fuite de protons
  • la nigéricine dissipe le gradient de pH : il y a conversion de ΔpH en ΔΨM
  • le malonate inhibe le complexe II de la chaîne respiratoire. Son addition progressive inhibe le transport des électrons et diminue ainsi ΔΨM

L'état 4 : lorsque le rapport [ATP] / [ADP] s'approche de l'équilibre, la force proton motrice augmente, le retour des protons via l'ATP synthase s'arrête et la respiration diminue. Pour obtenir des informations concernant la dissipation de protons, il est nécessaire d'avoir le graphique : [courant / tension] = f(conductance pour une gamme de potentiels) :

  • en commençant à l'état 4 et en limitant progressivement le transport d'électrons (par exemple par titration du malonate dans une préparation mitochondriale qui oxyde le succinate)
  • et en déterminant de manière simultanée la respiration et ΔΨM avec une électrode TPMP en présence de nigéricine
  • Voir : Brand & Nicholls (2011)

7. Résultat

La vitesse de consommation d'oxygène est représentée en fonction du potentiel de membrane mitochondrial ΔΨM, qui est la force motrice de cette fuite (figure 8, ci-contre).

Il n'y a pas de différence de conductance du proton à travers la membrane interne des mitochondries isolées des embryons en diapause et en post-diapause : le potentiel de membrane ΔΨM est donc compromis.

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Avantage biologique à ne pas maintenir la force proton motrice : réduction considérable de la consommation d'énergie pendant la diapause.

Inconvénients potentiels : probabilité accrue

  • d'ouverture de pores transitoires assurant la perméabilité mitochondriale
  • d'induction des voies de signalisation associées à la mort cellulaire

Pour survivre sans eau, les organismes dits anhydrobiotes (exemples : le ver Caenorhabditis elegans et la levure Saccharomyces cerevisiae) changent leur état métabolique. De tels organismes produisent aussi des molécules qui préservent la structure de leurs cellules. Parmi ces molécules essentielles, on peut citer le tréhalose (diholoside - 2 unités de glucose).

 

Références bibliographiques

Deutsch et al. (1979) « Cellular energy metabolism, trans-plasma and trans-mitochondrial membrane potentials, and pH gradients in mouse neuroblastoma » Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2175 - 2179

Ross et al. (2005) "Lipophilic triphenylphosphonium cations as tools in mitochondrial bioenergetics and free radical biology" Biochemistry (Mosc) 70, 222 - 230

Article

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Brand & Nicholls (2011) "Assessing mitochondrial dysfunction in cells" Biochem J. 435, 297 - 312

Podrabsky & Hand (2015) « Physiological strategies during animal diapause: lessons from brine shrimp and annual killifish » J. Exp. Biol. 218, 1897 - 1906

Elkalaf et al. (2016) "Mitochondrial Probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) Inhibits the Krebs Cycle Enzyme 2-Oxoglutarate Dehydrogenase" PLoS One 11, e0161413

Article

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