Partie A

On étudie la fixation d'un inhibiteur de protéase I sur l'élastase E. La masse molaire de l'enzyme est de 25 kDa. Celle du complexe enzyme - inhibiteur est de 75 kDa.

On fait agir différentes concentrations d'inhibiteur marqué au ³²P pour une concentration fixe de l'enzyme : [E]₀ = 100 µM.

L'inhibiteur non fixé et le complexe enzyme - inhibiteur sont séparés par chromatographie (gel de filtration).

Pour chaque concentration initiale d'inhibiteur, on obtient deux pics de radioactivité : le pic 1 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en premier ; le pic 2 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en second. L'enzyme libre est exclue du gel.

Le tableau suivant donne les valeurs de concentration des molécules de chaque pic.

1. A quelle(s) molécule(s) correspondent les pics 1 et 2 ?

2. Déterminez le nombre de site de fixation de l'inhibiteur et la constante de dissociation K_D.

Partie B

On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l'inhibiteur I, en mesurant l'absorbance du produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A. : Unité Arbsorbance):

1. Déterminez les paramètres cinétiques (V_max, K_M et k_cat) et les paramètres cinétiques en présence de l'inhibiteur. Exprimez k_cat en sec^-1.

2. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition K_I.

Données : l = 1 cm ; ε_M^produit = 2600 M^-1.cm^-1 ; [E]0 = 27 nM