La vitesse maximale d'une réaction enzymatique est une vitesse initiale théorique.

C'est l'asymptote de l'hyperbole obtenue lorsque l'on reporte : v_i = f([S₀]), que l'on appelle la courbe de saturation.

Elle ne peut donc être physiquement mesurée puisqu'elle correspond à une concentration de substrat infinie. Sa valeur ne peut-être qu'approchée.

Dans un premier temps par la mesure d'activité en présence de concentrations très fortes de substrat ([S₀] >> K_M).

Dans un second temps, par extrapolation des donnéees expérimentales à une concentration infinie à l'aide de représentations graphiques comme celle dite des double inverse ou représentation de Lineweaver-Burk (figure ci-dessous).

Voir un cours sur la cinétique enzymatique.