L3 - Janvier 2004 - Enzymologie (8 points)
Partie A :

On étudie la fixation d'un inhibiteur de protéase I sur l'élastase E. La masse molaire de l'enzyme est de 25 kDa. Celle du complexe enzyme - inhibiteur est de 75 kDa.

On fait agir différentes concentrations d'inhibiteur marqué au 32P pour une concentration fixe de l'enzyme : [E]0 = 100 ÁM.

L'inhibiteur non fixé et le complexe enzyme - inhibiteur sont séparés par chromatographie (gel de filtration).

Pour chaque concentration initiale d'inhibiteur, on obtient deux pics de radioactivité : le pic 1 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en premier ; le pic 2 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en second. L'enzyme libre est exclue du gel.

Le tableau suivant donne les valeurs de concentration des molécules de chaque pic.

Concentration molécule(s) Pic 1

(ÁM)

Concentration molécule(s) Pic 2

(ÁM)

10

5,60

20

12,3

40

34,0

55

60,0

70

117

90

437

 

1. A quelle(s) molécule(s) correspondent les pics 1 et 2 ?

2. Déterminez le nombre de site de fixation de l'inhibiteur et la constante de dissociation KD.

Partie B :

On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l'inhibiteur I, en mesurant l'absorbance du produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A. : Unité Arbsorbance):

[S]0 (mM)

vi (U.A.min-1)

sans inhibiteur

vi (U.A.min-1)

[I] = 9 mM

0,032

0,18

0,070

0,048

0,25

0.097

0,076

0,35

0,137

0,096

0,42

0,164

0,136

0,50

0,195

0,232

0,68

0,270

0,348

0,78

0,312

 

1. Déterminez les paramètres cinétiques (Vmax, KM et kcat) et les paramètres cinétiques en présence de l'inhibiteur. Exprimez kcat en sec-1.

2. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.

Remarques partie B:

Pour Vmax la concentration doit être exprimée en molarité.

Inutile de tracer les courbes de saturation (représentation de Michaelis-Menten-Henri).

Données : l = 1 cm ; eMproduit = 2600 M-1.cm-1 ; [E]0 = 27 nM