L3 - Janvier 2004 - Enzymologie (8 points)
Partie A

L'élution du gel de filtration se fait en fonction des masses molaires décroissantes. Le complexe enzyme - inhibiteur correspond au pic 1 et l'inhibiteur libre au pic 2.

Donc : Pic 1 = inhibiteur LIÉ ; pic 2 = inhibiteur LIBRE

[I]lié

(ÁM)

[I]libre

(ÁM)

[E]totale

(ÁM)

nu =

[I]lié / [E]tot

nu / [I]libre

(ÁM-1)

10

5.60

100

0.100

0.0179

20

12.3

100

0.200

0.0163

40

34.0

100

0.400

0.0118

55

60.0

100

0.550

0.00917

70

117

100

0.700

0.00598

90

437

100

0.900

0.00206

Remarque : 1 molécule d'inhibiteur se fixe par molécule d'enzyme.

  • masse molaire de l'enzyme = 25 kDa
  • masse molaire du complexe = 75 kDa
  • ==> masse molaire de l'inhibiteur = 50 kDa

Une stoechiométrie 1:1 est donc cohérente :

  • avec la masse molaire du complexe ;
  • avec l'ordre d'élution : complexe puis inhibiteur (l'enzyme libre étant exclue du gel)

 

 

Partie B

1. En absence d'inhibiteur : VMax  = 1,18 UA.min-1 

D'après la relation de Beer - Lambert et avec eM = 2600 M-1.cm-1 et l = 1 cm :

                                        1,18
              VMax   =   -----------------   =  4,5 10-4 M.min-1 = 7,5 µM.sec-1
                                     2600 x 1

                                                VMax
                 ==>   kcat   =   ----------------   =  278 sec-1
                                                 [E]0

 

  2. En présence de l'inhibiteur : VMaxapp = 1,9 10-4 M.min-1 = 3,2 µM.sec-1

  • VMaxapp < VMax
  • KMS est inchangé
  • ==>   inhibition non compétitive

 

                                   VMaxapp   .    [I]0
          et :   KI   =   -------------------------------   =   6,7 mM
                                 (VMax -VMaxapp)