A partir de deux types de plantes légumineuses (Pisum sativum et Medicago truncatula), chacune dans deux états physiologiques différents au cours de la germination, quatre banques d'ADNc ont été construites en utilisant le phage λ gt11 - EcoRI comme vecteur de clonage et E. coli LE392 comme bactérie hôte.

• Les titres des banques sont peu élevés probablement en raison de la conservation des milieux d'empaquetage 6 jours à 4°C avant la transformation bactérienne.
• Malgré l'obtention de fragments de tailles supérieures à 12 kpb, le résultat des amplifications effectuées avec le couple d'amorces λ gt11 sur les milieux d'empaquetage permet de faire l'hypothèse d'une assez grande représentativité des différents ADNc dans chaque banque. Ces dernières semblent donc exploitables.

Les séquences du couple d'amorces GDH résultent de l'alignement de séquences de différentes isoformes EC 1.4.1.2 et EC 1.4.1.3 de cette enzyme. Le taux de dégénérescence de ces amorces permet donc probablement l'amplification, à partir des ADNc, de ces deux isoformes mais aussi de l'isoforme EC 1.4.1.4.

En conséquence, le résultat de l'hybridation avec les sondes GDH radioactives suggère qu'un ou que des clone(s) recombinant(s), contenant tout ou partie de la séquence codant une isoforme de la GDH, ont été isolés.

Il est donc nécessaire :

• de séquencer les produits d'amplification ayant servi de sondes ;
• d'isoler et de sous-cloner les ADNc contenus dans les plages de lyse correspondant aux endroits où les tâches radioactives ont été observées sur les empreintes.

S'il se confirme qu'une séquence codant l'isoforme EC 1.4.1.4 a bien été isolée :

• La séquence codante est incomplète : il faut envisager l'amplification rapide des extrémités d'ADNc (3' et 5' RACE).
• Cette séquence est pleine longueur : il faut cloner la séquence codante dans un vecteur d'expression.

Quels que soient les résultats, la purification de l'isoforme EC 1.4.1.4 à partir du matériel végétal est incontournable.