Voir un cours sur les paramètres cinétiques des réactions ctalysées par les enzymes.

Exercice N°1

Une enzyme E catalyse la réaction d'hydrolyse: A + H₂O <=> B + C 

On suit la cinétique d'apparition du produit C, pour différentes concentrations en substrat A.  Les valeurs obtenues (en µmoles de C par tube) sont présentées dans le tableau suivant: 

1. Tracez les cinétiques et déterminez la vitesse initiale de chacune d'elle. 
Dans quelle condition de concentration du substrat A s'est-on placé pour suivre ces cinétiques? 
Pourquoi ne se préocupe-t-on pas de la concentration de l'eau ? 

2. Tracez la courbe de saturation et commentez la. 
Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme à partir de cette représentation. 

3. Déterminez les paramètres cinétiques à l'aide de la représentation des double inverses. 
Expliquez la différence entre les valeurs déterminées à partir de ces deux représentations. 

4. Les réactions enzymatiques sont effectuées dans un tube contenant 1 ml de la solution d'enzyme à une concentration initiale de 3 µM, le volume réactionnel étant complété par 2 ml de substrat dans le tampon approprié. 
Calculez les valeurs des paramètres cinétiques (exprimez la concentration en molarité). 

5. Une unité d'enzyme (U) est la quantité qui hydrolyse 1 µmole de substrat par minute. Par ailleurs, l'activité spécifique d'une enzyme est le rapport de l'activité maximale de l'enzyme à sa concentration (exprimée en mg/ml) dans le milieu réactionnel. Enfin, la masse molaire de l'enzyme E est de 100.000 dalton. 
Calculez l'activité spécifique en U.mg^-1. 

6. On considère que l'enzyme a été totalement purifiée. Calculez la valeur de la constante catalytique (kcat) en s^-1. 

7. Si l'enzyme E est une enzyme dite "Michaelienne", à quelle constante du schéma réactionnel classique pour une telle enzyme correspond cette constante ? Expliquez-en les unités. 
Retrouvez les unités de Km sur la base de celles des constantes de vitesse k₁, k_-1 et k₂. 

Exercice N°2

On suit la cinétique d'hydrolyse d'un substrat par une enzyme en mesurant l'absorbance du produit apparu. Les valeurs des vitesses initiales sont les suivantes (U.A. = Unité d'Absorbance) :

Déterminez les paramètres cinétiques V_max, K_M et k_cat (en s^-1) en exprimant la concentration en molarité.

Données : [E₀] = 160 nM ; ε_M^produit = 16300 M^-1.cm^-1; l = 1 cm

Exercice N°3

L'étude préliminaire de l'activité de deux enzymes (E1 et E2) vis-à-vis du même substrat donne les résultats suivants: 

Tracez la courbe vi = f([S0]). Quelles conclusions pouvez-vous en tirer ? 

Exercice N°4

D'une part, on a purifié une isomérase. D'autre part, on a cloné la séquence codant cette isomérase dans un vecteur d'expression et transformé des bactéries. On a fait une culture de ces bactéries et induit la synthèse protéique. Enfin, de l'extrait brut bactérien obtenu, une enzyme recombinante a été purifiée que l'on appelle l'enzyme inconnue (E_inc). 

On étudie la réaction d'isomérisation d'un substrat S en un produit P, en présence: 

• 1ère expérience: de l'isomérase seule
• 2éme expérience: de l'isomérase ET de l'enzyme inconnue

Pour chaque expérience, on mesure la vitesse initiale de la réaction (exprimée en nM.s-1) pour différentes concentrations [S0] du substrat. Les résultats sont résumés dans le tableau suivant: 

1. Pour chaque expérience, déterminez les paramètres cinétiques V_max et K_M, à partir de la représentation des doubles inverses.
2. Calculez la valeur de la constante catalytique de l'isomérase (k_cat^Iso).

On a déterminé la constante catalytique de l'enzyme inconnue: k_cat^Einc = 15360 min^-1.
3. Un seul paramètre cinétique diffère entre les 2 expériences (d'un facteur 2). Lequel et pourquoi ?
4. En conclusion, l'enzyme inconnue dont le gène a été cloné est-elle bien l'isomérase ?

Exercice phosphatase alcaline

La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse des esters de l'acide ortho-phosphorique. Pour suivre l'activité enzymatique, on utilise un substrat synthétique, le paranitrophénol-phosphate (M. M. = 371 g.mol^-1) qui libère du paranitrophénol (M. M. = 139 g.mol^-1) qui absorbe à 410 nm avec un coefficient d'extinction pondéral: ε^1% = 1260 g^-1.100 mL.cm^-1. 

Chaque réaction est effectuée dans un volume réactionnel de 10 ml contenant 0,2 ml d'enzyme à une concentration initiale de 10 mg/ml.

On obtient les résultats suivants (longueur du trajet optique = 1 cm) : 

Déterminez les valeurs des paramètres cinétiques de cette enzyme vis-à-vis de ce substrat (on exprimera la concentration en molarité). 

Calculez l'activité spécifique de l'enzyme avec l'unité de concentration précisée dans l'exercice N°1.