Enzymologie N°3 - Réactions enzymatiques à deux substrats


Voir le cours sur les cinétiques à 2 substrats.

Exercice N°1 : Mécanisme ordonné

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

On trouve :

1/VMax = 10 µM-1.min ===> VMax = 0,1 µM.min-1

1/KDY = 0 (point de concourrance sur l'axe des ordonnées) ===> KDY= infini ===> Y ne peut pas se fixer sur l'enzyme libre.

C'est donc un mécanisme ordonné avec Y en second.

E   +   X  

KDX
<======>

E-X   +   Y

KMY
<======>

E-X-Y

kcat
---------->

E + P

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Exercice N°2 : Mécanisme ordonné - calcium - DBL et inhibiteurs

1. Graphes primaires

Graphe primaire secondaire cinetique enzymatique 2 substrats ordonne au hasard ping pong

KD(Ca2+) = 41,7 µM

Graphe primaire secondaire cinetique enzymatique 2 substrats ordonne au hasard ping pong

1/KDDBL = 0 (point de concourrance sur l'axe des ordonnées)
===> KDDBL = infini ===> DBL se fixe en second.

2. Graphe secondaire

A partir du graphe primaire pour le calcium (ci-dessus à gauche), on obtient les valeurs du tableau ci-dessous qui permettent de tracer le graphe secondaire pour la DBL (ci-contre) :

[DBL] (mM)

1/[DBL] (mM-1)

1/VMax[DBL] (µmol-1.min.mg)

11,4 0,088 0,762
22,7 0,044 0,481
34 0,029 0,389
45,4 0,022 0,342

Graphe primaire secondaire cinetique enzymatique 2 substrats ordonne au hasard ping pong

On trouve :

VMax = 5 µmol.min-1.mg-1 

KMDBL = 31 mM

Il s'agit d'un mécanisme réactionnel ordonné.
  KD(Ca2+) = 41,7 µM   KMDBL = 31 mM   kcat  
E   +   Ca   <======> E-Ca   +   DBL <======> E-Ca-DBL ----------> E + P
   + Ba kinetics equilibrium deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random   KI      + Ac. but. kinetics equilibrium deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random   K'I        
E-Ba   E-Ca-Ac. but.

 

     
3. Effet des inhibiteurs : baryum et acide butyrique

  1er substrat : Ca2+ 2ème substrat : DBL
baryum Compétitif pour le Ca2+ (fixation sur la forme libre E) Puisque compétitif pour le Ca2+, alors forcément compétitif pour DBL
acide butyrique (Ac. but.) Incompétitif : fixation sur E-Ca (qui est une forme ES) Compétitif : fixation de Ac. but. sur E-Ca qui est une forme libre pour DBL

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Exercice N°3 : Mécanisme au hasard - glycogène - phosphate

1. Graphes primaires

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

KD(phosphate) = 30 mM

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

KD(glycogène) = 3,8 mg.ml-1

2. Graphes secondaires

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

On trouve :

VMax = 159 µmol.min-1.mg-1 

KMglycogène = 3,8 mg.ml-1

KMphosphate = 30 mM

De plus, on a un schéma carré puisque :

KD(phosphate) = KMphosphate = 30 mM

KD(glycogène) = KMglycogène = 3,8 mg.ml-1

Il s'agit d'un mécanisme réactionnel au hasard.
  KD(phosphate)      
E   +   Phosphate   <======> E-Phosphate    
   + Glyc kinetics equilibrium deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random   KD(glycogène)      + Glyc kinetics equilibrium deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random   KMglycogène    
E-Glyc   +   Phosphate

KMphosphate
<======>

E-Glyc-Phosphate

kcat
---------->

E + P

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Exercice N°5 : Mécanisme ping-pong

1. Graphes primaires

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

L'ensemble de droites parallèles indique un mécanisme ping-pong.

2. Graphes secondaires

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

VMax= 0,39 µM.min-1.mg-1

KMgalactose-1-P = 0,39 mM KMUDP-glucose = 0,19 mM

Effet des inhibiteurs (voir l'énoncé)
  UDP-glucose Galactose-1-P
UDP-galactose Compétitif Non compétitif
Glucose-1-P Non compétitif Compétitif

Le schéma du bas de la figure ci-contre impose une hypothèse supplémentaire : en effet, l'UDP galactose peut difficilement être synthétisé à partir du galactose-1-P sans apporter l'UDP comme substrat.

Une expérience supplémentaire est donc effectuée : en utilisant du 14C-UDP-glucose à concentration saturante, en absence de galactose-1-P, le 14C-UMP se fixe de façon covalente sur l'enzyme.

14C-UDP-glucose + Enzyme ----> 14C-UMP-Enzyme + glucose-1-P

Cette réaction démontre la validité de la 1ère partie du schéma du haut ou la 2nde partie du schéma du bas.

On suit aussi la libération de glucose-1-P. Le tableau suivant résume les résultats obtenus.

kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong


E (μM) 14C-UMP incorporé sur l'enzyme (μM) glucose-1-P (μM)
6 6,1 6,2
6 5,9 5,8
2 1,9 1,8
2 2,1 2,2

D'après ces résultats, on obtient des quantités équimolaires pour les 2 substrats (UDP-glucose et glucose-1-P).

Le schéma du haut est donc correct : l'enzyme doit être sous la forme libre E pour fixer l'UDP-glucose.

En revanche, l'enzyme devrait être sous la forme E-UMP pour libérer l'UDP-galactose comme dans le schéma du bas.

 

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