Enzymologie : Réactions enzymatiques à deux substrats
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Voir le cours sur les cinétiques à 2 substrats.

Exercice N°1 - mécanisme ordonné

biochimej kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

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1/VMax = 10 µM-1.min => VMax = 0,1 µM.min-1

1/KDY = 0 (point de concourrance sur l'axe des ordonnées) => KDY= infini => Y ne peut pas se fixer sur l'enzyme libre.

C'est donc un mécanisme ordonné avec Y en second.

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Exercice N°2 : Mécanisme ordonné calcium - DBL et inhibiteurs

1. Graphes primaires

biochimej Graphe primaire secondaire cinetique enzymatique 2 substrats ordonne au hasard ping pong

KDCa2+ = 41,7 µM

biochimej Graphe primaire secondaire cinetique enzymatique 2 substrats ordonne au hasard ping pong

1/KDDBL = 0 (point de concourrance sur l'axe des ordonnées) => KDDBL = infini => DBL se fixe en second.

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2. Graphe secondaire

A partir du graphe primaire pour le calcium (ci-dessus), on obtient les valeurs du tableau ci-dessous qui permettent de tracer le graphe secondaire pour la DBL (ci-dessous) :

[DBL] (mM)

1/[DBL] (mM-1)

1/VMax[DBL] (µmol-1.min.mg)

11,4 0,088 0,762
22,7 0,044 0,481
34 0,029 0,389
45,4 0,022 0,342

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1/VMax = 0,2 µmol-1.min.mg et -1/KMDBL = 0,032 mM-1 => VMax = 5 µmol.min-1.mg-1 et KMDBL = 31 mM.

Il s'agit d'un mécanisme ordonné.

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3. Effet des inhibiteurs : baryum et acide butyrique
inhibiteur 1er substrat : Ca2+ 2ème substrat : DBL
baryum Compétitif pour le Ca2+ : fixation sur la forme libre E Puisque compétitif pour le Ca2+, alors forcément compétitif pour DBL
acide butyrique (Ac. but.) Incompétitif : fixation sur E-Ca (qui est une forme ES) Compétitif : fixation de Ac. but. sur E-Ca qui est une forme libre pour DBL

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Exercice N°3 : Mécanisme au hasard - glycogène - phosphate

1. Graphes primaires

biochimej kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

KDphosphate = 30 mM

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KDglycogène = 3,8 mg.ml-1

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2. Graphes secondaires

biochimej kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random

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VMax = 159 µmol.min-1.mg-1
KMglycogène = 3,8 mg.ml-1
KMphosphate = 30 mM

Il s'agit d'un mécanisme réactionnel au hasard.

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Il s'agit d'un schéma carré puisque :
KDphosphate = KMphosphate = 30 mM
KDglycogène = KMglycogène = 3,8 mg.ml-1

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Exercice N°5 - mécanisme ping-pong

1. Graphes primaires

biochimej kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

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L'ensemble de droites parallèles indique un mécanisme ping-pong.

2. Graphes secondaires

biochimej kinetics enzymatique deux substrats two substrate ordered ordonne au hasard random ping pong

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VMax= 0,39 µM.min-1.mg-1
KMgalactose-1-P = 0,39 mM
KMUDP-glucose = 0,19 mM

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Effet des inhibiteurs (voir l'énoncé)
  UDP-glucose Galactose-1-P
UDP-galactose Compétitif Non compétitif
Glucose-1-P Non compétitif Compétitif

Le schéma du bas de la figure ci-dessous impose une hypothèse supplémentaire : en effet, l'UDP galactose peut difficilement être synthétisé à partir du galactose-1-P sans apporter l'UDP comme substrat.

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Une expérience supplémentaire est donc effectuée : en utilisant du 14C-UDP-glucose à concentration saturante, en absence de galactose-1-P, le 14C-UMP se fixe de façon covalente sur l'enzyme.

14C-UDP-glucose + Enzyme ----> 14C-UMP-Enzyme + glucose-1-P

Cette réaction démontre la validité de la 1ère partie du schéma du haut ou la 2nde partie du schéma du bas.

On suit aussi la libération de glucose-1-P. Le tableau suivant résume les résultats obtenus.

E (μM) 14C-UMP incorporé sur l'enzyme (μM) glucose-1-P (μM)
6 6,1 6,2
6 5,9 5,8
2 1,9 1,8
2 2,1 2,2

D'après ces résultats, on obtient des quantités équimolaires pour les 2 substrats (UDP-glucose et glucose-1-P).

Le schéma du haut est donc correct : l'enzyme doit être sous la forme libre E pour fixer l'UDP-glucose.

En revanche, l'enzyme devrait être sous la forme E-UMP pour libérer l'UDP-galactose comme dans le schéma du bas.

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