Les réactions enzymatiques à 2 (ou plus) substrats

1. Introduction et définitions

2a. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé "au hasard"

2b. Démarche expérimentale pour la détermination des vitesses initiales

3. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé "ordonné"

4. Détail du mécanisme séquentiel ordonné de l'acyltransférase LpxD

5. Système à double déplacement appelé "Ping Pong"

6. Mécanismes d'inhibition des systèmes à 2 substrats

a. Inhibition par les analogues de substrats

 

b. Inhibition par les produits des réactions

7. Mécanismes plus complexes

a. Pas de complexe central ou isomèrisation de l'enzyme

b. Plus de 2 substrats / plus de 2 produits

c. Etude de la protéine kinase FAK-1

8. Utilisation d'isotopes pour distinguer les mécanismes : échange isotopique et effets des isotopes

9. Cas des protéases à sérine

10. Liens Internet et références bibliographiques


Démonstration de l'équation de vitesse pour un système : 

Représentation graphique primaire pour un système :

Equation des graphiques secondaires pour un système :

Représentation graphique secondaire pour un système :

 

1. Introduction et définitions

Nous faisons l'hypothèse de l'établissement rapide des différents équilibres de fixation entre l'enzyme et les substrats :

  • c'est l'hypothèse du quasi-équilibre (l'étape de catalyse étant l'étape limitante). L'approche du quasi-équilibre est plus simple pour l'établissement de l'équation de la vitesse.
  • cette hypothèse est justifiée pour les systèmes appelés "séquentiels au hasard" et, dans une moindre mesure, pour ceux appelés "séquentiels ordonnés".
Pour ce second type de système, l'hypothèse de l'état stationnaire est préférable (voir "Modèles homéomorphes") :

Cependant, cette approche nécessite une méthode graphique qui permet de représenter la distribution des différents complexes enzymatiques en termes de concentration de substrat et des différentes constantes de vitesse : la méthode de E. King & C. Altman (1956).

De plus, l'équation de la vitesse ainsi obtenue n'est pas encore utilisable telle quelle tant que les constantes de vitesse n'ont pas été exprimées en termes de paramètres cinétiques déterminables expérimentalement (VM, KM et KI).

Il faut alors appliquer les règles générales (ou nomenclatures) développées par Wallace Cleland (1963).

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random biochimej

Les mécanismes à plusieurs substrats sont de 3 types :

  • les mécanismes séquentiels (ou à simple déplacement) qui se subdivisent en mécanisme séquentiel ordonné ou mécanisme séquentiel au hasard
  • le mécanisme à double déplacement (ou mécanisme Ping Pong)
Définitions
Substrats
Produits
Enzyme
  • on appelle A, B (C, D, ...) les substrats d'une réaction
  • on appelle P, Q (R, S, ...) les produits d'une réaction
  • on appelle E, F (G, H, ...) les différentes formes de l'enzyme pour les systèmes impliquant une isomérisation de celle - ci
Forme enzymatique
  • toute forme sous laquelle se trouve l'enzyme (libre, complexée au(x) substrat(s) ; complexée au(x) produit(s) ; ...)
  • toute forme qui ne peut pas se dissocier selon une réaction unimoléculaire (ou s'isomériser dans une telle forme) est appelée forme enzymatique stable
Complexe central
  • complexe entre l'enzyme et tous les substrats ou complexe entre l'enzyme et tous les produits
  • exemple : dans la réaction EAB <==> E + P, le complexe EAB est un complexe central
  • le nombre minimal de complexes centraux est donc 2
  • un tel complexe ne participe qu'à des réactions unimoléculaire (relarguage d'un substrat ou d'un produit)
  • exception : dans les systèmes à double déplacement dit "Ping Pong", il n'existe pas de complexe (enzyme - tous les substrats) ou de complexe (enzyme - tous les produits)
Complexe terminal (ou abortif)
  • complexe enzyme - ligand (substrat ou produit) qui ne participe pas à la formation de produit(s) de la réaction
  • une partie de l'enzyme est donc inactive et le ligand est considéré comme un inhibiteur
Séquentiel
  • système où tous les substrats doivent se fixer à l'enzyme avant que n'importe lequel des produits soit relargué : système séquentiel au hasard ou système séquentiel ordonné.
Non séquentiel
  • système où un produit est relargué entre les additions successives des substrats : système à double déplacement dit "Ping Pong"
Theorell - Chance
  • système proposé par H. Theorell & B. Chance (1951) pour un mécanisme ordonné sans complexe central (le premier produit est relargué par la fixation du dernier substrat).

Nomenclature des systèmes
(Uni, Bi, Ter, Quad / Iso)

  • Les réactions sont classées : Uni, Bi, Ter ou Quad en fonction du nombre de substrats ou de produits.
  • Bi Uni (ou Uni Bi) : système impliquant 2 substrats et 1 produit (ou l'inverse). Exemple : Bi Uni ordonné.
  • Bi Bi : système impliquant 2 substrats et 2 produits. Exemple : Bi Bi au hasard.
  • Bi Ter : système impliquant 2 substrats et 3 produits. Exemple : Bi Ter ordonné.
  • Iso : système impliquant une isomérisation de l'enzyme (changement de conformation E ===> F). Exemple : Iso Ping Pong.
Modèles homéomorphes
  • modèles différents qui fournissent des équations de vitesse formellement identiques.
  • exemples : le système Bi Bi au hasard analysé avec l'hypothèse du quasi - équilibre et le système Bi Bi ordonné analysé avec l'hypothèse de l'état stationnaire conduisent à la même expression de la vitesse de la réaction.
Postulat 1
  • toute réaction élémentaire ne peut être que mono- ou bimoléculaire.
  • en d'autres termes, deux molécules de substrats ne peuvent pas se fixer simultanément (les complexes ternaires, quaternaires ... ne peuvent être formés que par additions successives de ligands).
Postulat 2
  • lorsqu'une réaction élémentaire est bimoléculaire, la réaction réverse est monomoléculaire.
  • On ne peut donc pas avoir de réaction du type :
           ki . [S]
Ei  <=======>  Ei+1
          k-i . [P]

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2. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé "au hasard"

Deux substrats, A et B, se fixent de manière aléatoire sur l'enzyme libre E (c'est-à-dire qu'il n'y a pas de fixation privilégiée de l'un ou l'autre des deux substrats) avec une constante de dissociation KA et KB, respectivement.

Parfois la fixation de l'un des deux substrats modifie la constante d'équilibre de dissociation de l'autre substrat de l'enzyme libre d'un facteur α.

Le mécanisme réactionnel s'écrit :          E    +    A
         +
         B

KA
<====>

           EA
            +
            B

KBfleche   αKBfleche

       

EB    +    A

αKA
<====>

         

EAB

kcat
-------->

 

E + Produit(s)

On aboutit à un ensemble de courbes de saturation pour chaque substrat (voir la démonstration des équations : vi = f([A0]) et vi = f([B0]))

1. L'équation de chaque courbe de saturation en fonction de la
concentration du substrat A pour une concentration fixe de B est :

                                                      [A0]
 vi      =      VMapp      .    ---------------------------
                                            KAapp    +   [A0

L'équation de chaque courbe de saturation en fonction de la
concentration du substrat B pour une concentration fixe de A est :

                                                      [B0]
 vi      =      VMapp      .    ---------------------------
                                            KBapp   +   [B0

2. Pour chaque concentration de A et de B, la vitesse maximale
apparente vaut :

                                      VM                                VM
VMapp      =      ----------------------    =     -----------------------
                                      α KA                              α KB
                           ( 1 + ---------- )              ( 1 + ------------- )
                                       [A0]                               [B0]
Et à concentration saturante en A et B : VMapp      ------>      VM

3. Pour chaque concentration de B, la constante de
Michaelis - Menten apparente pour le substrat A vaut :

                                                      KB
                                           ( 1 + --------- )
                                                     [B0]
KAapp      =      α KA  .  ------------------------ 
                                                    α KB
                                          ( 1 + ----------- )
                                                     [B0]
Et à concentration saturante en A et B :

KAapp      ------>      α KA

4. Pour chaque concentration de A, la constante de
Michaelis - Menten apparente pour le substrat B vaut :

                                                      KA
                                           ( 1 + --------- )
                                                     [A0]
KBapp      =      α KB  .  ------------------------ 
                                                    α KA
                                          ( 1 + ----------- )
                                                     [A0]

Et à concentration saturante en A et B :

KBapp      ----->      α KB

Les paramètres : α, KA et KB sont déterminés à partir :


La description de la démarche expérimentale pour déterminer les vitesses initiales permet de mieux comprendre ces deux types de représentations graphiques.

Exemples d'enzymes

  • La glutathion S-transférase

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random biochimej

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

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3. Système séquentiel (ou à simple déplacement) appelé "ordonné"

Dans un tel système, l'ordre de fixation est obligatoire : le substrat A doit se fixer à l'enzyme libre E avant le substrat B. En d'autres termes, le le substrat B ne peut se fixer qu'au complexe EA. 

Un complexe ternaire EAB est toujours formé.

Le mécanisme réactionnel s'écrit :

 

E    +    A

KA
<====>

 

EA + B

KB
<====>

 

EAB

kcat
-------->

 

E + Produit(s)

vi      = kcat . [EAB]

 [E0] = [E] + [EA] + [EAB]

L'équation de chaque courbe de saturation en fonction de la
concentration du substrat A pour une concentration fixe de B est :

                                                                       [A0] . [B0]
 vi      =      VMapp      .    --------------------------------------------------------------------
                                            KAapp . KBapp    +   KBapp . [A0]   +   [A0] . [B0]

Exemples d'enzymes

a. Les déshydrogénases à NAD+

Dans le cas de la lactate déshydrogénase (mécanisme Bi Bi ordonné) :

  • le coenzyme se fixe toujours en premier
  • le lactate est toujours relargué en premier

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random

b. L'adénylate kinase (E.C. 2.7.4.3) catalyse la réaction globale : AMP + ATP <===> 2 ADP.

Cette réaction s'effectue selon un mécanisme séquentiel ordonné.

c. Les sirtuines sont des histones désacétylases nictotinamide adénine dinucléotide (NAD+)-dépendantes / ADP-ribosyltransférases.

Elles couplent l'hydrolyse du NAD+ et la désacétylation d'un substrat acétylé pour former la nicotinamide, le produit désacétylé et le nouveau métabolite O-acétyl-ADP-ribose (OAADPR).

Reaction catalyse sirtuine desacetylation NAD multiple substrate

Figure ci-contre : schéma réactionnel des sirtuines 2 qui suivent un mécanisme Bi Ter ordonné.

  • le substrat acétylé (Ac-R) doit se fixer en premier, puis le NAD+, pour former le complexe ternaire.
  • La nicotinamide est le premier produit relargué suivi par une libération au hasard du produit désacétylé et de OAADPR.

multiple substrate Reaction catalyse sirtuine desacetylation NAD

Source : Borra et al. (2009)

d. Mécanisme ordonné des ADN polymérases.

Reaction catalyse sirtuine desacetylation NAD multiple substrate

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

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4. Détail du mécanisme séquentiel ordonné de l'acyltransférase LpxD

Le lipide A (glycolipide phosphorylé) est la partie hydrophobe du lipopolysaccharide qui constitue le feuillet externe de la membrane externe de la plupart des bactéries gram négatives.

Le lipide A ancre le lipopolysaccharide dans la membrane externe de la cellule et est généralement nécessaire pour la croissance bactérienne.

La LpxD acyltransférase (UDP-3-O-(3-hydroxymyristoyl)glucosamine N-acyltransférase - EC 2.3.1.191) est la 3ème enzyme de la voie de biosynthèse du lipide A chez Escherichia coli.

La LpxD catalyse la N-acylation [R-3-hydroxymyristoyl-ACP]-dépendante de l'UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine pour former l'UDP-2, 3-diacylglucosamine et l'ACP.

La chaîne acyle R-3-hydroxymyristoyl est portée par l'ACP.

Source : Bartling & Raetz (2008)

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random lipide A acyl carrier protein

Abréviations :

  • ACP = Acyl Carrier Protein
  • R-3-OHC14-ACP = R-3-hydroxymyristoyl-acyl carrier protein
  • UDP = Uridine DiPhosphate
 
  • UDP-acyl-GlcN = UDP-3-O-(R-3-OHC14)-GlcN = UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine
  • UDP-2-N-(R-3-OHC14)-GlcN = UDP-2-N-(R-3-hydroxymyristoyl)-α-D-glucosamine
  • 4′-PPT = 4 '-phosphopantéthéine

Figure ci-contre : acyl-ACP intacte.

L'ACP contient 4 hélices (I à IV) et des boucles (L1 à L3) 28, 29.

Le bras 4′-PPT et la chaîne acyle R-3-hydroxymyristoyl sont indiqués.

Source : Masoudi et al. (2013)

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random lipide A acyl carrier protein

Chaque monomère du trimère de LpxD contient 3 domaines :

  • le domaine N-terminal de fixation de l'uridine (UBD : "Uridine-Binding Domain")
  • un domaine central riche en hélices β de pas gauche (LβH : "Left-handed β-Helix domain") qui contient His 239 catalytique (base générale) et Gly 257 (trou oxyanion)
  • un domaine C-terminal (CTD)

La zone de reconnaissance (interaction) de l'ACP (ARD : "ACP Recognition Domain") est constitué du domaine C-terminal et de la dernière hélice du domaine LβH.

Source : Masoudi et al. (2013)

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random lipide A acyl carrier protein

La LpxD suit un mécanisme Bi Bi ordonné dans lequel :

  • l'acyl-ACP (R-3-OHC14-ACP) se fixe avant UDP-3-O-(R-3-OHC14)-GlcN
  • l'UDP-2, 3-diacylglucosamine se dissocie avant l'holo-ACP (la forme de l'enzyme dont la chaîne acyle s'est libérée)

Source : Bartling & Raetz (2008)

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random lipide A acyl carrier protein

Explication structurale de ce mécanisme

Figure a : l'acyl-ACP se fixe en premier à la forme libre de LpxD, formant le complexe binaire (EA - figure b).

Figure b : l'ACP est associée à l'ARD ("ACP recognition domain") et le groupe acyle 4 '-phosphopantéthéine (4′-PPT), lié à Ser 36, est empaqueté dans un canal hydrophobe.

Figure c : l'UDP-acyl-GlcN se fixe ensuite ce qui initie le transfert du groupe acyle.

two substrates mechanism mecanisme ordonne ordered sequential random lipide A acyl carrier protein

Source : Masoudi et al. (2013)

Figure d : Au sein du complexe ternaire, le bras de 4′-PPT issu de l'hydrolyse de l'acyl-ACP (ligne ondulée orange transparente) englobe complètement la chambre catalytique, ce qui empêche l'UDP-diacyl-GlcN de se dissocier.

Le déplacement de 4′-PPT (ligne ondulée orange foncée) vers Met290 (flèche en pointillés) ouvre la chambre catalytique.

Figure e : ce mouvement entraîne la sortie éventuelle de l'UDP-diacyl-GlcN.

Figure f : ce mouvement déclenche des changements conformationnels en aval de l'hélice II conduisant à une dissociation de l'holo-ACP.

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

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5. Système à double déplacement appelé "Ping Pong"

Un ou plusieurs produits est/sont relargué(s) avant que tous les substrats ne soient fixés à l'enzyme.

Ce mécanisme est caractérisé par la formation obligatoire d'une forme intermédiaire modifiée de l'enzyme (E*) qui est un acyl-enzyme.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong

Exemples d'enzymes

  • les aminotransférases : mécanisme Bi Bi Ping Pong (figure ci-contre)
  • certaines oxydo-réductases (exemples : thioredoxine réductase, 3'-phosphoadénosine-5'-phosphosulfate réductase)
  • certaines transférases (exemple : acylneuraminate-cytidylyl transférase)

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong serine protease chymotrypsin acyl enzyme acetate

Modèle cinétique

Le mécanisme réactionnel s'écrit :

E    +    A

k1
<====>
k-1

EA k2
-------->
E* + P
E*    +    B k3
<====>
k-3
E*B k4
-------->
E + Q

vi = d[P]/dt = d[Q]/dt = k2 . [EA] = k4 . [E*B]

 [E0] = [E] + [EA] + [E*] + [E*B]

L'équation des vitesses est :

                                                                                               1
 vi      =      kcat .   [E0]    .    ---------------------------------------------------------------------------------
                                                 (KMA . termeA  . 1/[A0])  +   (KMB . termeB  . 1/[B0])  +   1

                   k2 . k4
kcat   =   ----------------
                   k2 + k4

                    k-1 + k2
KMA   =   ----------------
                          k-1

                    k-1 + k4
KMB   =   ----------------
                          k-3

                            k4
termeA   =   ----------------
                         k2 + k4
                            k2
termeB   =   ----------------
                         k2 + k4

Ce mécanisme est caractérisé par un ensemble de droites parallèles selon la représentation en double - inverses.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong

Travaux dirigés : voir un exercice corrigé de ce mécanisme.

Mécanisme Ping Pong à 2 sites (ou plus)

La transcarboxylase (EC 2.1.3.1) catalyse un mécanisme appelé Ping Pong à 2 sites ("two-site Ping Pong mechanism"). D'autres enzymes catalysent des mécanismes ping pong à n sites.

Ces enzymes contiennent des coenzymes (exemples : biotine, acide lipoïque, 4-phosphopantétheine) liés par covalence. Ces coenzymes transfèrent d'un site à l'autre les groupements modifiés lors de la réaction enzymatique.

Le transfert du groupe carboxyle est médié par la biotine qui peut passer d'un site à l'autre. En effet, la biotine est covalamment liée à la transcarboxylase via une liaison amide entre le groupe pentanoyl de la biotine et le groupe aminobutyl d'une lysine de l'enzyme.

Sur un site : le méthyl-malonyl-CoA transfère son groupe carboxyle à la biotine pour former la carboxy-biotine-transcarboxylase et le propionyl-CoA est dissocié de l'enzyme.

Sur l'autre site : le pyruvate se fixe indépendamment. La carboxy-biotine y est transférée et le pyruvate est carboxylé en oxaloacétate qui se dissocie de l'enzyme.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong

Les équations des vitesses sont identiques au mécanisme Ping Pong classique mais les profils d'inhibitions sont inversés.

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6. Mécanismes d'inhibition des systèmes à 2 substrats


a. Inhibition par les analogues de substrats
Système Inhibiteur type d'inhibition vis-à-vis du substrat A type d'inhibition vis-à-vis du substrat B
Au hasard et quasi-équilibre analogue de A compétitif : la fixation de l'analogue de A est exclusive de celle de A non compétitif : l'analogue de A peut se fixer sur l'enzyme que le substrat B soit fixé ou non
analogue de B non compétitif compétitif
 
Ordonné et quasi-équilibre analogue de A compétitif compétitif
analogue de B incompétitif : la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe l'analogue de B devient très minoritaire quand la concentration de A devient très faible compétitif
 
Ordonné et état stationnaire analogue de A compétitif non compétitif : l'excès de B n'empêche pas la fixation de l'analogue de A
analogue de B incompétitif compétitif
 
Ping Pong analogue de A compétitif incompétitif
analogue de B incompétitif compétitif
Source : O. Viratelle (1993) "Protéines et enzymes - TD" - Collection Méthodes, Hermann - ISBN : 2-7056-6185-9

b. Inhibition par les produits des réactions

α. Règles générales

  • L'étude de l'effet inhibiteur de l'un des produits est faite en absence de l'autre produit : la formation réverse des substrats ne peut pas avoir lieu.
  • Le produit ajouté se fixant à l'enzyme libre et/ou l'enzyme complexée à l'un des substrats, il diminue la vitesse de la réaction comme le ferait un analogue de substrat. De plus, un produit peut favoriser la réaction réverse ce qui diminuerait encore davantage la vitesse de la réaction.
  • Cette diminution a lieu aussi bien aux faibles qu'aux fortes concentrations en substrat : c'est alors un effet inhibiteur non compétitif.
  • Cet effet disparaît à faible concentration en substrat si la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe le substrat et la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe le produit sont séparées par des étapes irréversibles : le produit se comporte alors comme un inhibiteur classique.
  • Une étape qui implique la fixation d'un substrat ou d'un produit peut être rendue irréversible si on travaille à très fortes concentrations en substrat ou en absence du produit.

β. Fixation au hasard - hypothèse du quasi-équilibre pour les substrats et les produits.

Aucun produit ne peut, seul, favoriser la réaction réverse car, en absence de l'autre produit, le complexe EPQ ne peut pas se former. Les produits se comportent donc comme des analogues de substrat.

Il y a 4 types d'inhibition qui dépendent de l'aptitude des 2 produits à se fixer en même temps que les 2 substrats :

  • la fixation d'un produit est exclusive de celle d'un des substrats : il y a au moins 2 inhibitions compétitives
  • si un produit empêche la fixation des 2 substrats, il y a 3 inhibitions compétitives et 1 inhibition non compétitive

γ. Fixation ordonnée - hypothèse du quasi-équilibre pour les substrats et les produits

E + A <===> EA <===> EAB <===> EPQ <===> EQ <===> E + Q

Le produit Q est un inhibiteur compétitif :

  • vis-à-vis du substrat A : sa fixation est exclusive de celle de A
  • vis-à-vis du substrat B : l'étape : la réaction E + A <===> EA étant en quasi-équilibre, l'excès de B déplace la réaction EQ <===> E + Q vers Q, ce qui empêche la fixation de Q

Le produit P :

  • n'a pas d'effet inhibiteur car EQ n'existe pas en absence de Q
  • mais si le produit P peut se fixer sur EA, alors le produit P se comporte comme un analogue de B : inhibition incompétitive vis-à-vis de A et compétitive vis-à-vis de B

δ. Fixation ordonnée - hypothèse de l'état stationnaire

Le produit Q est :

  • un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat A
  • un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat B : la forme de l'enzyme sur laquelle se fixe B (EA) et celle sur laquelle se fixe Q (E) sont séparées par une étape réversible

Le produit P :

  • est un inhibiteur non compétitif vis-à-vis des substrats A et B : la forme E sur laquelle se fixe A et le complexe EA sur lequel se fixe B sont séparés du complexe EQ (sur lequel se fixe P) par des étapes réversibles
  • pour de très fortes concentrations de B, l'étape EA + B <===> EAB devient irréversible et le produit P se comporte alors comme un inhibiteur incompétitif vis-à-vis du substrat A (pas d'inhibition à faible concentration de A)

ε. Mécanisme Ping Pong

E + A <===> EA <===> E'P <===> E' + P
E' + B <===> E'B <===> EQ <===> E + Q

En présence d'un des produits de la réaction, les étapes de fixation des deux substrats ne sont plus séparées par des étapes irréversibles : les droites dans les graphes primaires ne sont plus parallèles.

Le produit P est :

  • un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat A : la forme E sur laquelle se fixe A et la forme E' sur laquelle se fixe P sont séparés par des étapes réversibles
  • un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat B : leurs fixations sont exclusives

Le produit Q est :

  • un inhibiteur compétitif vis-à-vis du substrat A
  • un inhibiteur non compétitif vis-à-vis du substrat B

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7. Mécanismes plus complexes

a. Pas de complexe central ou isomèrisation de l'enzyme

Mécanisme séquentiel Theorell - Chance (exemple : histone acétyltransférase p300) : le complexe central ne s'accumule pas car les substrats s'associent faiblement avec l'enzyme. En conséquence, la concentration à l'état stationnaire du complexe central est négligeable du point de vue cinétique.

Exemple de mécanisme Iso Bi Bi Ordonné où l'enzyme libre s'isomèrise (forme E en forme F).

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong

b. Plus de 2 substrats / plus de 2 produits

Exemples d'enzymes qui catalysent des réactions avec 3 substrats et 2 ou 3 produits :

Exemple de mécanisme Tri-Uni Uni Ping Pong de la pyruvate phosphate dikinase (EC 2.7.9.1).

Cette enzyme est utilisée par les plantes en C4.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong biochimej

Autres exemples

Le complexe multi-enzymatique mitochondrial α-cétoglutarate deshydrogénase (EC 1.2.4.2, EC 2.3.1.61 et EC 1.6.4.3) est un élément clé de la régulation du cycle de Krebs. Ce complexe catalyse la réaction : α-cétoglutarate + CoA-SH + NAD+ + H2O <===> succinyl-CoA + CO32- + NADH + H+

Cette réaction a été analysée via un mécanisme catalytique sophistiqué Ter Ter.

Figure ci-contre :

Mécanisme Ter Bi Ordonné catalysé par la glutamate deshydrogénase à NADP+ (EC 1.4.1.3).

Mécanisme Ter Ter catalysé par l'aspartate-ammonia ligase (EC 6.3.1.1 - asparagine synthétase).

Remarque : il existe une asparagine synthétase ["glutamine-hydrolyzing"] (EC 6.3.5.4) qui catalyse la réaction : ATP + Asp + Gln + H2O ===> AMP + diphosphate +Asn + Glu

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong


Nombre de mécanismes théoriques vs. nombre de mécanismes réels
Type de mécanismes Nombre théorique de mécanismes Nombre réel de mécanismes différents1 Exemples
Ter Ter   6 mécanismes : Ter Ter Ordonné / Bi Uni Uni Bi Ping Pong / Bi Bi Uni Uni Ping Pong / Uni Bi Bi Uni Ping Pong / Uni Uni Bi Bi Ping Pong / Hexa Uni Ping Pong

glutamate déshydrogénase

synthèse de la S-adénosyl methionine

Quad2 Bi 4 3 mevalonic pyrophosphate décaxboxylase
Quad Ter 10 5 citrate-splitting enzyme
Quad Quad 20 9 carbamyl phosphate synthétase

1. Différents modèles peuvent aboutir à des équations de vitesse formellement identiques. Exemples : le système Bi Bi au hasard analysé avec l'hypothèse du quasi - équilibre et le système Bi Bi ordonné analysé avec l'hypothèse de l'état stationnaire conduisent à la même expression de la vitesse de la réaction.

2. Pour une description détaillée des mécanismes et des équations d'un système Quad (4 substrats), voir : Yago et al. (2013) "Initial Rate Equations in Four-Substrate Enzyme Reactions. Application to Discriminate between Some Mechanisms and Evaluate Global Kinetic Parameters" MATCH Commun. Math. Comput. Chem. 69, 215-248


Ci-contre : les 3 mécanismes ordonnés Ter Bi.

Voir l'article de W. Cleland (1963).

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong biochimej

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c. Etude de la protéine kinase FAK-1 - Schneck et al. (2010)

FAK-1 : "Focal Adhesion Kinase-1" est une protéine kinase (tyrosine kinase non-récepteur) ubiquitaire dans toutes les cellules.

Méthode de mesure des vitesses de catalyse : mesures de la radioactivité incorporée lors de la phosphorylation d'un substrat synthétique, le peptide Ac-RRRRRRSETDDYAEIID-NH2 (Y est le site de phosphorylation) appelé FAK-tide.

FAK-1 est un homodimère (2 x 119 kDa). Son domaine catalytique contient un motif SH2, flanqué d'un domaine N-terminal FERM et d'un domaine C-terminal contenant la séquence de ciblage pour l'adhésion focale ("Focal Adhesion Targeting" - FAT).

Sous sa forme inactive, le domaine FERM relie les extrémités des lobes N- et C-terminaux du domaine kinase et s'étend au travers du site actif, bloquant ainsi l'accès au substrat, donc la catalyse.

La séquence du peptide FAK-tide correspond donc à la séquence du site d'autophosphorylation de FAK-1 (autophosphorylation de Tyr397) : il faut noter que Tyr397 n'est pas située dans la boucle d'activation mais dans une région qui relie domaine FERM et le domaine catalytique.


Hypothèses

Expressions des paramètres cinétiques
(voir le schéma catalytique ci-dessous)

Valeurs des paramètres cinétiques

Tous les complexes binaires (enzyme-substrats, enzyme-produits et les deux complexes abortifs) sont en équilibre rapide.

L'expression VMax / [E0] est décrite par trois étapes lentes (k13, k14 et k15) avec k3 et k11 >> k12, k13, k14, et k15 et k16 négligeables.

kcat = 1 / [1/k3 + 1/k11 + (k14 + k15 ) / (k13 . k15 + 1/k15)]

≈ (k13 . k15) / (k13 + k14 + k15 )

kcat = 0.052 s-1
KMMgATP = [k13 . k15 / (k13 + k14 + k15 )] [(k10 + k11) / k9 . k11]

KMMgATP = 1.2 μM

KMFAK-tide = 5.6 μM

KMFAK-tide = [k6 . (k14 + k15 ) . (1 + k3 / k4)] / [(k13 + k14 + k15 ) . (k3 . k5 / k4)]

KIMgATP = 1.3 μM

KIFAK-tide = 6.1 μM


Profils d'inhibition par les produits et par les complexes abortifs
  Mg-ATP FAK-tide
Mg-ADP compétitif - KI = 1.4 μM non compétitif

Phospho-FAK-tide

non compétitif compétitif - KI = 220 μM

AMP-PNP
[adénosine 5′-(β,γ-imido)triphosphate]

compétitif - KI = 4.5 μM non compétitif
Phe/Tyr-FAK-tide non compétitif compétitif - KI = 700 μM

Deux complexes [substrat - produit] abortifs sont possibles : E-MgADP-FAK-tide (EBQ) et E-MgATP-P-FAK-tide (EAP).

Le complexe E-MgADP-peptide (EBQ) a été observé pour d'autre kinases : exemple, le complexe E-MgADP-Ser-peptide de la protéine kinase AMPc-dépendante.


L'ensemble des résultats sont en faveur d'un mécanisme Bi-Bi au hasard (figure ci-desous).

  • Les étapes de formation et de dissociation de tous les complexes binaires devraient être beaucoup plus rapides que la catalyse : les constantes de vitessse k1, k2, k7, k8, et les constantes k19 à k27 sont plus élevées que k13.
  • Les formes enzymatiques marquées d'une astérisque indiquent des étapes correspondant à un changement de conformation qui entraîne l'activation d'une boucle fermée.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong biochimej

Source : Schneck et al. (2010)

EAB* et EPQ* : E-MgATP-FAK-tide et E-MgADP-phospho-FAK-tide, respectivement, avec la boucle d'activation fermée

EPQ : E-MgADP-phospho-FAK-tide avec la boucle d'activation ouverte

L'étape de catalyse (kcat) est limitante à cause de deux évènements lents (encadré du bas de la figure ci-dessus) :

  • le transfert réversible du groupement phosphoryle (kaller ≈ 0.2 s-1 et kretour ≈ 0.04 s-1)
  • un processus conformationnel lent (kconformationnel ≈ 0.1 s-1) qui correspond sans doute à l'ouverture de la boucle d'activation après le transfert du groupement phosphoryle, mais avant la libération du produit

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8. Utilisation d'isotopes pour distinguer les mécanismes : échange isotopique et effets des isotopes

Il existe plusieurs méthodes :

a. La comparaison des représentations réciproques avec des substrats non marqués et marqués :

  • le rapport des pentes reflète l'effet isotopique sur [VMax / KM]
  • le rapport des points d'intersection avec l'axe des ordonnées reflète l'effet isotopique sur VMax. C'est la seule façon de déterminer les effets isotopiques sur VMax mais elle est limitée à des effets isotopiques d'au moins 5%.

b. La "compétition interne" où les substrats non marqués et marqués sont présents en même temps. Le changement dans leur proportion reflète l'effet isotopique sur [VMax / KM] du substrat marqué. Cette méthode est utilisée avec 3H ou 14C ou avec l'abondance naturelle de 13C, 15N et 18O.

c. L'étude des perturbations de l'équilibre quand un substrat marqué et le produit correspondant non marqué sont présents à l'équilibre.


Les utilisations des isotopes pour les études cinétiques
Condition Type de marquage isotopique Effets des isotopes
localisation de la substitution des isotopes éloigné du site actif

- liaison impliquée dans la réaction : effet primaire des isotopes
- à une liaison de distance de la liaison impliquée dans la réaction : effet secondaire des isotopes
- solvant : effet isotopique du solvant

étendue de la substitution à l'état de trace

- idéalement totale (100%)
- la substitution par 3H n'est possible qu'à l'état de trace : les expériences qui nécessitent la saturation de l'enzyme par des molécules substituées par 3H ne sont pas possibles

propriétés isotopiques radioactive différentes masses atomiques
isotopes employés 3H, 14C, 32P 2H, 3H
Voir : chapitre 7 - "Fundamentals of enzyme kinetics" (2001) A. Cornish-Bowden, Portland Press Ltd.

a. Etude de l'échange isotopique

L'hypothèse élémentaire est que :

  • la substitution d'un isotope par un autre n'a aucun effet sur les propriétés chimiques
  • les effets sur les propriétés cinétiques sont négligeables

Le schéma ci-contre représente le transfert d'un atome radioactif (représenté par une astérisque) de A* à P* dans un mécanisme ordonné.

two substrates mechanism mecanisme double deplacement ping pong biochimej

Cet échange d'atomes recquiert que A* se fixe à E : il ne peut donc avoir lieu que s'il y a une concentration suffisante de E. La réaction d'échange doit donc être inhibée par de fortes concentrations de A ou de Q puisqu'ils sont en compétition avec A* pour E.

Les effets de B et P sont plus subtils :

  • d'un côté la réaction d'échange inclue la fixation de B sur EA* et dès lors une concentration finie de B est nécessaire.
  • d'un autre côté, si B et P sont présents à de très fortes concentrations, l'enzyme est très largement sous forme de complexe ternaire (EAB + EPQ) : il n'y a donc pas de forme E sur laquelle pourrait se fixer A. En conséquence, de fortes concentrations de B et P inhibent cet échange.

Deux équations fonction des concentrations [EA*] et [EA*B] :

  • d[EA*]/dt = k1[A*][E] - (k-1 + k2[B]) . [EA*] + k-2[EA*B] = 0       (hypothèse de l'état stationnaire)
  • d[EA*B]/dt = k2[B][EA*] - (k-2 + k3[B]) . [EA*B] + k-3[P*][EQ] = 0

Pour [P*] => 0 (condition de vitesse initiale) : [EA*B] = k1.k2[A*][B][E] / k-1.(k-2 + k3) + k2.k3[B]

La vitesse initiale d'échange : vi* = k3.[EA*B] = k1.k2.k3[A*][B][E] / k-1.(k-2 + k3) + k2.k3[B]

Quelle est l'expression de [E] ?

Le traitement de l'équation ci-dessus est simplifié si on fait l'hypothèse que les concentrations des substrats non marqués ne sont pas modifiées par la présence de traces de substrats radioactifs. De la même manière la concentration [E] est la même que dans la situation substrats radioactifs.

Il y a deux manières de s'affranchir d'une expression très complexe (inutilement) de [E] :

  • la vitesse d'échange d'isotopes est étudiée avec les réactions impliquant le substrat non marqués à l'équilibre : [E] = [E0] / 1 + ([k1[A*]/k-1) + (k1.k2[A][B] / k-1.k-2) + (k1.k2.k3[A][B][P] / k-1.k-2.k3)
  • on ne prend pas en compte les vitesses d'échange mais le rapport de ces vitesses d'échange

b. Etude des effets des isotopes

A l'inverse de l'échange isotopique, l'hypothèse élémentaire est qu'il y a une différence de cinétiques et de propriétés à l'équilibre entre les molécules qui contiennent des isotopes différents.

Remarque : les deux hypothèses (échange d'isotopes et effets des isotopes) ne peuvent être vraies simultanément.

  • Il est donc nécessaire d'ajuster les conditions expérimentales pour être en mesure d'étudier l'un ou l'autre de ces deux processus.
  • Par ailleurs, la disponibilité du deutérium (2H ou D) et du tritium (3H) procure un outil très efficace pour l'étude de effets des isotopes.

L'énergie de la liaison C-H en fonction de la distance séparant les deux atomes ne dépend que du nuage électronique qui les entoure et cette énergie est la même pour tous les isotopes de C et de H.

Cependant, quand une liaison vibre, les niveaux d'énergies (qui correspondent à des quanta d'énergie) de cette liaison dépendent des masses des atomes en vibration : en conséquence, ces niveaux d'énergies sont différents pour des isotopes différents.

 

10. Liens Internet et références bibliographiques

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Cleland W.W. (1963) "The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more substrates or products. I. Nomenclature and rate equations" Biochim. Biophys. Acta. 67, 104-137

Segel I.H. (1975) "Enzyme Kinetics", John Wiley, New York

Cornish-Bowden A. (1977) "An automatic method for deriving steady-state rate equations" Biochem. J. 165, 55 - 59

"Fundamentals of enzyme kinetics" (2001) A. Cornish-Bowden, Portland Press Ltd. / ISBN : 1 85578 070 0

Cleland W.W. (2003) "The use of isotope effects to determine enzyme mechanisms" J. Biol. Chem. 278, 51975 - 51984

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Bartling & Raetz (2008) "Steady-State Kinetics and Mechanism of LpxD, the N-Acyltransferase of Lipid A Biosynthesis" Biochemistry 47, 5290 - 5302

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Schneck et al. (2010) "Kinetic Mechanism and Rate-Limiting Steps of Focal Adhesion Kinase-1" Biochemistry 49, 7151 - 7163

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