ENZYMOLOGIE

Historique - site actif - complexe enzyme/substrat - état de transition - protéases

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1. Historique

2. Spécificité de l'association [protéine - ligand] - Notion de site actif - Classes d'enzymes (E.C. X.X.X.X)

3. Le complexe enzyme - substrat

4. Etat de transition, énergie libre d'activation et énergie libre de la réaction enzymatique

a. Généralités

b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'état de transition et l'accélération de la réaction par franchissement de la barrière d'activation.

c. voir une animation

 

5. Les effets de l'encombrement intracellulaire des macromolécules ("Macromolecular crowding effects")

6. Illustration des protéases

a. Généralités

b. Les protéases à sérine

7. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

Annexe : distinction entre concentrations à l'équilibre et à l'état stationnaire

 

1. Historique.

Les organismes vivants sont le siège d'un grand nombre de réactions biochimiques très diverses.

Ces réactions s'effectuent dans des conditions où, normalement, elles ne pourraient se faire. Si elles ont lieu, c'est parce qu'elles sont catalysées par des macromolécules biologiques : les enzymes.

Le pouvoir de catalyse des enzymes est lié, entre autre, à la très haute spécificité de reconnaissance des molécules sur lesquelles elles agissent.

L'enzymologie est la partie de la biochimie qui étudie les propriétés structurales et fonctionnelles des enzymes (la relation structure - fonction).

En particulier, elle s'applique à décrire la vitesse des réactions catalysées par les enzymes.

Il est difficile de situer exactement la découverte de la notion d'enzyme et surtout d'enzyme en tant que seul catalyseur des réactions chimiques qui se déroulent dans les organismes vivants.

1783 : Lazzaro Spallanzani a rapporté que la viande est liquéfiée par un extrait gastrique. Il a noté également que la température a un grand effet.

1814 : M. Kirchhoff observa qu'un composant "glutineux" (comme il l'a appelé à l'époque) de blé convertit l'amidon en sucre.

1833 : La première découverte d'une enzyme est d'habitude attribuée à Anselme Payen et Jean-François Persoz qui ont traité un extrait aqueux de malt à l'éthanol puis précipité une substance labile à la chaleur qui hydrolyse l'amidon.

Ils ont appelé cette fraction "diastase" ("séparation" en Grec) puisque cette fraction sépare le sucre soluble de l'amidon insoluble. On sait maintenant que cette préparation était une solution non purifiée d'amylase.

1834 : Theodor Schwann a obtenu le premier un agent actif d'origine animale (la pepsine) qu'il a partiellement purifiée en traitant la paroi stomacale par l'acide.

Il est important de souligner qu'à l'époque les premières observations d'activité enzymatique ont précédé une notion claire et précise de la catalyse. Le concept de catalyse provient de l'observation de l'action de la diastase et de la pepsine parallèlement à celle de la levure pendant la fermentation : dans tous les cas, une "substance était changée en une autre" sous l'influence d'un agent actif : le catalyseur.

A l'époque, la levure n'était pas encore considérée comme une cellule vivante.

1838 : Charles Cagniard de Latour montra que le processus de fermentation est dû à des organismes vivants.

1858 à 1871 : Les travaux de Louis Pasteur confirmèrent cette idée. Pasteur émit l'hypothèse révolutionnaire que les changements chimiques lors de la fermentation résultaient des processus de la vie des micro-organismes impliqués dans la fermentation.

A l'opposé, Justus von Liebig privilégiait une théorie purement chimique : un "ferment" était une substance chimique produite par un organisme en décomposition et les atomes de ce ferment étaient supposés en mouvement incessant. Cet état d'agitation élevé était transmis aux atomes de la molécule de sucre (substrat du ferment) dont les éléments devaient être maintenus par des forces faibles. Il en résultait une scission du sucre en CO2 et éthanol dont les liaisons étaient plus fortes.

1860 : Marcellin Berthelot fit macérer de la levure et obtint une fraction précipitable à l'alcool capable de convertir le sucrose en glucose plus fructose. Il conclut que l'invertase (nom qu'il donna à l'agent actif de cet extrait) était l'un des multiples ferments présents dans la levure. L'invertase est la β-fructofuranosidase (E.C. 3.2.1.26).

1876 - 1877 : Wilhelm Kühne a découvert la trypsine dans le liquide pancréatique de l'intestin de boeuf au cours de ses études sur la digestion intermédiaire des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Il a conclu que la trypsine était initialement inactive puis convertie en sa forme active. Cette observation est à la base de la notion de précurseur inactif des protéases que l'on appelle zymogène et de l'activation de ce zymogène par (auto)protéolyse.

1878 : Wilhelm Kühne proposa le nom d'enzyme ("En-" et "zumê", signifiant "dans le levain") pour qualifier ces ferments. L'addition du ssuffixe "ase" au nom du substrat d'une enzyme pour dénommer cette enzyme fût proposé par Emile Duclaux en 1898.

1897 : Un chimiste allemand, Martin Hahn, tentait d'isoler des protéines de levure (Saccharomyces cerevisiae) en broyant ces levures dans un mortier avec du sable fin et de terre de diatomées. Cependant, cette préparation d'extrait de levure se conservait mal.

Hans et Eduard Buchner s'intéressaient aussi aux extraits de levure dans un but thérapeutique. Ces extraits étant destinés à l'homme ne pouvaient contenir des bactéricides. Se souvenant que le sucre permet de conserver les fruits, Hans Buchner, proposa d'ajouter du saccharose à l'extrait de levure pour le conserver.
Eduard Buchner observa que l'adjonction de sucre entraînait la formation de bulles dans le mélange. Il conclut à la fermentation, processus décrit par Louis Pasteur comme "la vie à l'abris de l'air".

En publiant ses observations, Eduard Buchner concluait : "La complexité de la levure n'est pas indispensable au déroulement de ce processus. Le ferment actif du jus n'est probablement qu'une substance dissoute, sans aucun doute une protéine : nous la baptiserons zymase". Pour cette découverte, Eduard Buchner reçut le Prix Nobel en 1907.

On sait maintenant que la "zymase" des extraits de levure est en fait un mélange d'enzymes dont l'ensemble catalyse les réactions de la glycolyse.

1897 : La même année, Gabriel Bertrand observa que certaines enzymes requièrent des facteurs dialysables pour leur activit. Il les nomma coenzymes.

Au début du 20è siècle, de gros travaux furent entrepris pour purifier des enzymes et surtout décrire leur activité catalytique en termes mathématiques.

1902 : V. Henri et Adrian Brown suggérèrent indépendamment que la formation d'un complexe enzyme - substrat est un intermédiaire obligatoire de la réaction enzymatique.

Cette suggestion s'appuyait sur la forme de la courbe obtenue quand on reporte la vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration en substrat. A. Brown avait étudié la vitesse d'hydrolyse du sucrose par la β-fructofuranosidase, l'invertase de la levure.

De plus cette suggestion était en accord avec le concept de reconnaissance enzyme - substrat du type "clé - serrure" proposé par Emil Fisher en 1894.

Henri fût donc le premier à décrire l'équation mathématique reliant l'effet de la concentration du substrat à la vitesse de catalyse.

1913 : Leonor Michaelis et Maud Menten redécouvrirent l'équation de V. Henri et établirent la relation connue sous le nom d'équation de Henri - Michaelis - Menten.

Le point important est que l'obtention de cette équation repose sur l'hypothèse qu'il s'établit un équilibre rapide entre les concentrations de l'enzyme, du substrat et du complexe enzyme - substrat (E + S <==> ES).

1925 : George Briggs et James Haldane généralisèrent l'équation précédente en introduisant le concept d'état stationnaire pour la concentration du complexe enzyme - substrat.

Le fait que les enzymes sont des protéines ne fût accepté qu'à partir de la fin des années 20.

De nouvelles techniques chimiques et physiques furent employées pour analyser la structure des protéines.

1926 : James Sumner (Prix Nobel en 1946) cristallisât l'uréase.

Années 30 : John Northrop (Prix Nobel en 1946) et ses collaborateurs cristallisèrent le pepsinogène, la pepsine et plusieurs isoformes de la trypsine et de la chymotrypsine et démontrèrent la pureté des cristaux obtenus.

Années 40 et 50 : Des centaines d'enzymes furent purifiées et cristallisées permettant ainsi l'élucidation de dizaines de voies métaboliques.

1955 : Frédéric Sanger (1er Prix Nobel en 1958) publia la séquence complète en acides aminés d'une petite protéine : l'insuline (masse molaire 6000 Da).

1957 : La première structure cristallographique d'une protéine (la myoglobine), déduite de la diffraction des rayons X, fût obtenue par John Kendrew (Prix Nobel en 1962 avec Max Perutz).

Années 60 : La première séquence d'une enzyme (la ribonucléase, masse molaire 13700 Da) fût publiée en 1960 et la première synthèse chimique (également de la ribonucléase) fût obtenue en 1969.

Les biochimistes focalisèrent alors sur le mécanisme de l'activité enzymatique et son mode de régulation.

1958 : Daniel Koshland a proposé le modèle de l'ajustement induit.  Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme.

1961 : Christian Anfinsen (Prix Nobel en 1972) et ses collaborateurs ont montré que, pour un grand nombre de protéines, c'est la séquence en acides aminés qui détermine le repliement de la chaîne polypeptidique dans son unique conformation native donc active. Cette conformation est la plus stable parce qu'elle a une énergie libre minimale.

1963 : Cleland proposa une procédure claire et uniforme pour écrire les équations des cinétiques des systèmes enzymatiques à plusieurs substrats.

1965 : Jacques Monod (Prix Nobel en 1965), Jeffries Wyman et Jean-Pierre Changeux proposèrent un modèle cinétique (modèle MWC) pour les enzymes allostériques (enzymes dont la courbe de vitesse en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïdale et non une hyperbole).

1966 : Daniel Koshland, Georges Nemethy et D. Filmer généralisèrent le modèle précédent (modèle KNF) en incluant la notion d'ajustement induit proposé par Koshland.

Années 80 à nos jours :

L'hypothèse de C. Anfinsen, vérifiée pour un grand nombre de protéines (notamment dites "globulaires") est restée longtemps l'un des dogmes de la biologie.

Cependant, à partir des années 1980, 2 autres processus ont été mis en évidence :

- les protéines chaperones (Ron Laskey - 1978; John Ellis - 1987) aident au repliement de certaines protéines ou les maintiennent dans la conformation native quand la cellule est soumise à certains stress. Parmi les chaperonnes, on peut citer :

- les protéines intrinsèquement non structurées : elles n'ont pas de structure tridimensionnelle à l'état libre et n'acquière leur structure repliée, donc fonctionnelle, que quand elles interagissent avec leurs partenaires cellulaires.

Des approches plus récentes et plus vastes sont venues compléter les connaissances acquises pendant plus d'un siècle :

  • le développement de divers modèles du repliement de la chaîne polypeptidique (exemple : "molten globule" - Wada & Ohgushi, 1983).
  • en parallèle, les moyens informatiques de plus en plus puissants ont permis de développer des simulations utilisant la modélisation moléculaire, la mécanique moléculaire ou la dynamique moléculaire (GROMACS, méthode de Monte-Carlo, méthode ab-initio, ...).
  • enfin, le développement d'Internet, la création de bases de données de plus en plus complètes et spécialisées et la bioinformatique constituent autant d'outils modernes pour développer les moyens d'étude en enzymologie.
Quelques bases de données dédiées aux enzymes Enzyme Nomenclature
ExPASy (Expert Protein Analysis System)
ENZYME - Enzyme nomenclature database
UniProt
Protein Data Bank
BRENDA
ExplorEnz - The Enzyme Database
KEGG LIGAND Database

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2. Spécificité de l'association [protéine - ligand] - Notion de site actif

Quels sont les facteurs qui expliquent l'extrême spécificité de la reconnaissance entre une protéine et un ligand  ?

a. Toutes les protéines (sauf les protéines intrinsèquement non structurées) se replient dans une conformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquièrent leur activité biologique (leur pouvoir de catalyseur dans le cas des enzymes).

Ce repliement aboutit à une structure tridimensionnelle fonctionnelle unique de la protéine.

b. Cette structure globale de la macromolécule permet à une région particulière, le site actif (souvent enfoui au sein de la protéine), d'adopter elle aussi une structure spatiale qui est reconnue par le ligand spécifique de la protéine (et, le cas échéant, par un petit nombre de molécules dont la structure est proche de celle du ligand).

On peut citer divers types d'association entre une protéine et un ligand :

Si elle est réversible, l'association protéine - ligand correspond à l'équilibre suivant :

                           k1
                PL <====> P + L
                           k-1

* k1 et k-1 sont des constantes de vitesse (constantes microscopiques).

* k1 : constante de vitesse du second ordre (réaction bimoléculaire). Unités : mol.L-1.s-1 ou M.s-1

* k-1 : constante de vitesse du premier ordre (réaction monomoléculaire). Unités : s-1

On définit la constante de dissociation (constante macroscopique) qui lie la concentration des composés impliqués dans la réaction :

                                            [P] x [L]                  k1                        1
             Kdissociation   =   ----------------    =    ---------    =   ------------------
                                               [PL]                      k-1              Kassociation

L'énergie libre de Gibbs de formation des complexes est très variable comme le montre le tableau suivant : 
Protéine Ligand Kdissociation (M) ΔG (kcal.mol-1)
Carboxypeptidase β-phénylpropionate 5 10-3 3,2
Trypsine butylamine 10-3 4,2
Phosphofructokinase (2 conformations) adénosine diphosphate (ADP) 10-3 - 2 10-5 4,2 - 6,5
Homosérine déshydrogénase NADPH 3 10-7 9
Méthionine - ARNt synthétase méthionyl - adénylate 2 10-9 12
Histone ADN 10-11 15
Apohémoglobine hème 10-13 18
Source : "Biochimie" Chapeville, Clauser et al. (1974) Ed. Hermann

c. Le site actif est constitué d'un petit nombre d'acides aminés qui le plus souvent ne sont pas contigus dans l'enchaînement de la chaîne polypeptidique.

Ces acides aminés sont caractérisés par une chaîne latérale dont à la fois la nature chimique (groupement ionisable ou polarisable) et la structure (encombrement stérique) sont spécifiquement adaptés à la reconnaissance du (ou des) ligand(s).

La stéréochimie qui résulte de cet agencement unique des acides aminés qui constituent le site actif est la cause de la stéréospécificité de reconnaissance entre ces acides aminés et le (ou les) ligand(s).

specificite site actif fixation enzyme substrat stereochimie

Source : Enzyme Mechanisms

d. Les enzymes ne fixent pas seulement un ligand (qui dans ce cas s'appelle un substrat). Elles le transforment en un produit lors d'une réaction chimique. Certains acides aminés du site actif ont pour fonction, non pas de fixer le substrat, mais de fournir les groupements chimiques nécessaires à la réaction catalysée par l'enzyme.

Dans le cas des enzymes, on distingue donc au sein du site actif :

  • les acides aminés qui constituent le site de fixation (ces acides aminés n'ont pas de fonction chimique impliquées dans la réaction)
  • les acides aminés qui constituent le site catalytique

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Les différentes classes d'enzymes

La classification établie par la commission des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (sigle anglais "IUBMB") a été établie sur des critères de spécificité.

La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X (E.C. : "Enzyme Commission").

La liste de toutes les enzymes, leur nomenclature et leur identifiant EC est disponible dans la base de données : Enzyme Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions


Le premier "X" correspond aux 6 types de réactions catalysées par les enzymes. 1er X Réaction catalysée exemple de coenzyme impliqué
X = 1 : oxydoréductases (E. C. 1.X.X.X) oxydoréduction NAD(P)+
X = 2 : transférases (E. C. 2.X.X.X) transfert de groupes phosphate de pyridoxal
X = 3 : hydrolases (E. C. 3.X.X.X) hydrolyse aucun
X = 4 : lyases (E. C. 4.X.X.X) addition de groupe à des atomes engagés dans des doubles liaisons pyrophosphate de thiamine
X = 5 : isomérases (E. C. 5.X.X.X) isomérisation (de position de groupe ou de fonction) phosphate de pyridoxal
X = 6 : ligases (E. C. 6.X.X.X) condensation de deux molécules ATP
Remarque : dans les banques de données, on trouve une catégorie "Autres" ; exemples : kinases, phosphoprotéines, "Mutator transposons".

Considérons le groupe 1 des oxydoréductases :

le 2ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction de la nature du groupe du donneur d'électrons sur lequel l'enzyme agit.

2ème X l'enzyme agit sur :
X = 1 : E. C. 1.1.X.X le groupe CH-OH du donneur d'électrons
X = 2 : E. C. 1.2.X.X la fonction aldéhyde ou oxo du donneur d'électrons
X = 3 : E. C. 1.3.X.X le groupe CH-CH du donneur d'électrons
etc ...
X = 19 : E. C. 1.19.X.X la flavodoxine réduite
X = 97 : E. C. 1.97.X.X autres oxydoréductases

Considérons le groupe 1.4 des oxydoréductases qui agissent sur le groupe CH-NH2 du donneur d'électrons :

le 3ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction de la nature du groupe accepteur d'électrons sur lequel l'enzyme agit.

3ème X l'accepteur d'électrons est:
X = 1 : E. C. 1.4.1.X NAD+ ou NADP+
X = 2 : E. C. 1.4.2.X un cytochrome
X = 3 : E. C. 1.4.3.X l'oxygène
X = 4 : E. C. 1.4.4.X un groupe disulfure
X = 7 : E. C. 1.4.7.X une protéine fer - soufre
X = 99 : E. C. 1.4.99.X autres accepteurs
Remarque : il n'y a pas de classe E. C. 1.4.5.X et E. C. 1.4.6.X

Considérons le groupe 1.4.1 des oxydoréductases qui utilisent le NAD+ ou le NADP+ comme accepteur d'électrons :

le 4ème "X" permet un classement supplémentaire en fonction du substrat sur lequel l'enzyme agit.

4ème X Nom de l'enzyme
X = 1 : E. C. 1.4.1.1 alanine déshydrogénase
X = 2 : E. C. 1.4.1.2 glutamate déshydrogénase
X = 3 : E. C. 1.4.1.3 glutamate déshydrogénase (NAD(P)+)
X = 4 : E. C. 1.4.1.4 glutamate déshydrogénase (NAD(P)+)
etc ...
X = 19 : E. C. 1.4.1.19 tryptophane déshydrogénase
X = 20 : E. C. 1.4.1.20 phénylalanine déshydrogénase

L'exemple de la glutamate déshydrogénase (E. C. 1.4.1.2, E. C. 1.4.1.3 et E. C. 1.4.1.4) met en évidence la notion d'isoenzymes ou d'isoformes de la "même" enzyme.

Voir la base de données : ExplorEnz - The Enzyme Database

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3. Le complexe enzyme - substrat

La formation initiale d'un complexe [enzyme - substrat] ES ou complexe de Michaelis-Menten-Henri, NON covalent, fût suggérée d'après les observations suivantes :

  • Le haut degré de spécificité de la reconnaissance d'un substrat par le site actif d'une enzyme. Pour l'expliquer, Emil Fisher suggéra en 1894 que cette reconnaissance résulte d'une très forte complémentarité des structures (mais aussi de la nature chimique des groupements réactionnels) du substrat et de l'enzyme qui le fixe, comme le sont une clé et la serrure dans laquelle elle entre.
  • Le fait que les substrats protègent souvent les enzymes de l'inactivation (O'Sullivan & Tompson, 1890).

L'hypothèse "clé -serrure", bien qu'extrêmement satisfaisante, ne peut rendre compte de certaines observations :

  • Par exemple, certains composés qui ressemblent chimiquement à un substrat mais qui ont des groupements moins volumineux ne sont pas catalysés, bien qu'ils doivent encore mieux s'insérer dans le site actif.
  • Il existe un mécanisme enzymatique à deux substrats appelé "fixation ordonnée" pour lequel un substrat B ne peut se fixer que si le substrat A l'est déjà. Or, selon l'hypothèse "clé - serrure", le substrat B devrait se fixer d'emblée.

Nature des forces dans les associations [enzyme - substrat]

  • forces d'interactions électrostatiques : entre atomes ou groupes d'atomes qui possèdent une charge électrique permanente. Interactions entre 2 ions, 1 ion et 1 dipôle ou entre 2 dipôles permanents.
  • forces d'induction : résultent de l'induction d'un dipôle dans un groupe non polaire soumis au champ électrostatique d'une charge permanente. On distingue les interactions entre un ion et un dipôle induit ou entre un dipôle permanent et un dipôle induit. Ces interactions sont classées dans les interactions de Van der Waals ou dans les interactions électrostatiques.
  • interactions électrocinétiques ou forces de dispersion de London : interactions entre groupes non polaires dues à l'induction mutuelle de dipôles qui fluctuent.
  • répulsions à courtes distances : répulsions électrostatiques entre les électrons par suite du recouvrement des nuages électroniques de 2 atomes.
  • liaisons hydrogène : se forment entre 2 atomes électronégatifs reliés par un atome d'hydrogène. Elles sont de nature électrostatique.
  • interactions hydrophobes : interactions entre groupements non polairesdans l'eau. Elles résultent de la réorganisation de la structure de l'eau en présence d'un composé non polaire. Les molécules d'eau autour d'un composé non polaire sont organisées de manière à établir le maximum de liaisons hydrogène autour d'elles. L'accroissement d'entropie dû à la désorganisation de la structure du réseau de molécules d'eau constitue la contribution majeure à l'énergie des interactions hydrophobes.
  • liaison covalente : partage d'une paire d'électrons entre 2 atomes. Ce type de liaison est parfois impliqué dans les complexes [enzyme - substrat] (exemples : acyl-enzyme ou phosphoryl-enzyme) : elle intervient alors dans une étape consécutive à la formation du complexe de Michaelis-Menten-Henri qui est non covalent.

Si KS est la constante de dissociation du complexe [enzyme - substrat], l'énergie libre de Gibbs de formation du complexe est : ΔG = - RT Ln (1/KS).

Les valeurs de ΔG pour la formation du complexe de Michaelis-Menten-Henri sont généralement assez faibles et toujours négatives.

En d'autres termes, la formation du premier complexe s'accompagne d'une diminution de l'énergie libre de Gibbs du système : c'est donc un processus spontané.

specificite site actif fixation enzyme substrat stereochimie enrgie libre enthalpie entropie compexe Michaelis ES


Exemples de valeurs de paramètres thermodynamiques de l'association [enzyme - substrat] ou [enzyme - inhibiteur]
Enzyme Substrat ou inhibiteur ΔG (kcal.mol-1) ΔH (kcal.mol-1) ΔS (u. e.)
Chymotrypsine

méthyl hydrocinnamate
benzoyl-L-tyrosine éthyl ester
benzoyl-L-tyrosine

- 1,9
- 3,3
- 0,9

- 5,3
- 8,4
- 9,9

- 11,4
- 17,1
- 30,0

Carboxypeptidase carboxybenzoxy-L-tryptophane
carboxybenzoxy glycyl-L-phénylalanine
carboxybenzoxy glycyl-L-tryptophane
- 3,4
- 2,5
- 3,4
5
- 0,4
0
- 28,0
- 7,0
- 11,5
Pepsine

carboxybenzoxy-L-glutamyl-L-tyrosine éthyl ester
carboxybenzoxy-L-glutamyl-L-tyrosine

- 4,7
- 4,3
- 1,4
- 3,0
20,6
24,4
Uréase urée - 3,2 - 2,9 0,9
ATPase ATP - 7,5 8 52
Source : "Enzymologie moléculaire et cellulaire" J. Yon-Kahn & G. Hervé (2005) Coll. Grenoble Sciences (EDP Sciences)

La variation d'entropie résulte de 3 contributions :

  • la formation d'une molécule (le complexe) à partir de 2 molécules (enzyme et substrat ou enzyme et inhibiteur) qui s'accompagne d'une diminution d'entropie (δΔS1 < 0)
  • l'exclusion du solvant autour des molécules de substrat et du site actif de l'enzyme lors de l'association. Les molécules d'eau passent d'un état structuré à un état moins structuré dans l'eau environnante (δΔS2 > 0)
  • les 2 facteurs précédents sont insuffisants pour rendre compte des les variations d'entropie observées. La 3ème contribution est liée aux variations de la conformation de la protéine lors de l'association avec le substrat (δΔS3 < 0 ou δΔS3 < 0)

Diverses théories ont été proposées pour expliquer les modifications structurales du substrat et/ou de l'enzyme lors de leur association.

a. Henry Eyring et Rufus Lumry (1954) ont proposé le modèle appelé "rack" (traduction : chevalet de torture ; tourmenter).

C'est le substrat qui subit un changement conformationnel, la structure de l'enzyme étant considérée comme rigide.

Le résultat est un accroissement de la labilité des liaisons à rompre dans la molécule de substrat puisque celui-ci, bien que fixé de manière lâche, subit des tensions dans ses liaisons qui l'amènent dans une configuration proche de celle de l'état de transition.

b. Daniel Koshland (1958) a proposé le modèle dynamique de l'ajustement induit ("induced fit").

Le substrat induit un changement conformationnel du site actif de l'enzyme. Les orbitales des groupements catalytiques et du groupement réactionnel du substrat sont alignées de manière optimale pour l'acte catalytique (voir article).

A l'inverse, des molécules qui ont une structure analogue à celle du substrat peuvent se fixer mais l'orientation spatiale des groupements ne permet pas l'acte catalytique

Dans le modèle de l'ajustement induit (figure ci-contre) :

  • E : forme inactive de l'enzyme
  • E' : forme active prédominante en présence du substrat mais non significativement existante en son absence
  • K1 << 1 et K4 >> 1 donc K2 > K3 c'est-à-dire - ΔG2 > - ΔG3.
  • Puisque : K1 . K2 = K3 . K4 alors K4 > K1.
  • Conclusion : en présence de substrat la forme E'S est favorisée.

Figure adaptée de "Enzymologie moléculaire et cellulaire" Yon-Kahn & Hervé (2005)

specificite site actif fixation enzyme substrat stereochimie ajustement induit Koshland

Exemples en faveur de changements conformationnels de l'enzyme consécutives à la fixation du substrat :

  • Dans le cas d'un mécanisme ordonné à 2 substrats, la fixation du premier induit un changement de conformation qui révèle le site de fixation du second substrat. Par exemple, l'hexokinase de levure se replie en deux domaines structuraux reliés par une région flexible appelée "charnière". Cette enzyme catalyse la phosphorylation (par l'ATP) du glucose en glucose-6-phosphate. Quand elle fixe le glucose, l'hexokinase subit un profond changement de conformation : les deux domaines se rapprochent l'un de l'autre par un mouvement d'environ 12°, ce qui augmente l'hydrophobicité du site actif et prévient l'hydrolyse de l'ATP.
  • L'inhibition non compétitive : un inhibiteur non compétitif ne se fixe pas sur le site actif donc le complexe [enzyme - inhibiteur] ne devrait pas perdre son activité si l'enzyme ne changeait pas de conformation.

c. Williams Jenks (1966) a proposé le modèle appelé "strain" (tension - déformation).

C'est une combinaison des deux théories qui précèdent. Les changements de conformation de l'enzyme entraînent des contraintes dans la structure du substrat.

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4. Etat de transition, énergie libre d'activation et énergie libre de la réaction enzymatique - voir une animation

a. Généralité

Comme toutes molécules, un substrat et un produit d'une réaction enzymatique sont caractérisés par des liaisons chimiques.

Au cours d'une réaction, des échanges d'énergie avec le milieu environnant ont lieu : certaines liaisons du substrat sont rompues en absorbant de l'énergie et les liaisons du produit sont formées en libérant de l'énergie.

Dans le cas d'une réaction exergonique, l'énergie nécessaire pour rompre les liaisons du substrat est inférieure à l'énergie libérée lors de la formation des liaisons du produit. L'énergie requise pour que la réaction ait lieu (l'énergie nécessaire pour que les liaisons du substrat soient rompues) s'appelle l'énergie libre d'activation : ΔG#.

Lors de l'absorption de cette énergie, la vitesse des molécules de substrats augmente et donc la fréquence et le nombre de collisions entre molécules de substrats et d'enzyme augmentent aussi. Parallèlement, l'augmentation de l'agitation thermique fragilise les liaisons qui sont donc plus faciles à rompre.

Eyring a proposé la théorie de l'état de transition en 1935 : quand toute l'énergie d'activation est absorbée, la molécule de substrat est dans l'état de transition (les angles et les longueurs des liaisons chimiques du substrat sont distordues). C'est l'état le plus énergétique, donc le plus instable. La réaction évolue spontanément vers un état énergétique plus faible, la formation du produit de la réaction.

Pour sa part, la différence d'énergie libre de Gibbs entre les produits et les substrats est la variation d'énergie libre de Gibbs de la réaction : ΔGréaction.

Il faut noter que même dans le cas d'une réaction exergonique, les substrats doivent franchir la barrière d'activation. Cette barrière est essentielle pour la vie : sans elle, les macromolécules (protéines, acides nucléiques ...) à fort potentiel énergétique se décomposeraient spontanément.

Dans les conditions de la vie cellulaire, peu de molécule peuvent franchir la barrière d'activation dans un laps de temps compatible avec les processus biologiques. Par exemple, le demi-temps de désamination de l'adénosine à 20°C et à pH7 est d'environ 20.000 ans !

Seule l'intervention d'un catalyseur biologique, une enzyme, le permet.

Une enzyme augmente la vitesse de la réaction en abaissant l'énergie d'activation : à la même température, les substrats franchissent plus facilement et donc plus fréquemment la barrière d'activation.

En conclusion :

  • les enzymes ne modifient pas la variation d'énergie libre de Gibbs de la réaction : la constante d'équilibre de dissociation (Kdissociation) d'une réaction n'est pas modifiée.
  • en revanche, les constantes de vitesse microscopiques (k1 et k-1) sont modifiées dans le même rapport.

b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'état de transition et l'accélération de la réaction par franchissement de la barrière d'activation.

Voir un trés bon cours : Enzyme Mechanisms

L'état de transition est un arrangement de liaisons chimiques en train de se former et de se rompre puisque c'est une structure intermédiaire entre celle du substrat dont il est issu et celle du produit qu'il va former.

L'état de transition est donc une structure hautement énergétique donc instable. Sur le plan thermodynamique, l'un des facteurs essentiels de l'efficacité catalytique est la complémentarité de l'enzyme pour l'état de transition du substrat et non pour son état fondamental.

Par ailleurs, la vitesse d'une réaction enzymatique dépend de l'efficacité de la rencontre / collision entre les molécules qui vont former l'état de transition.

Cette efficacité dépend à la fois :

  • de l'orientation des molécules l'une par rapport à l'autre
  • d'une énergie minimale requise appelée énergie d'activation

1er facteur : les deux grands types chimiques de mécanismes catalytiques

α. La catalyse acide-base générale : c'est le mécanisme le plus courant de la catalyse enzymatique. L'accélération de la réaction résulte du transfert d'un proton.

Par exemple, ce proton peut provenir du couple [imidazole / imidazolium] de la chaîne latérale de l'histidine puisqu'elle a un pKa situé entre 6 et 7 et constitue au pH physiologique un groupe [donneur / accepteur] de proton.

L'activité catalytique des enzymes de ce type est largement influencée par le pH.

Exemples de groupes fonctionnels d'acides aminés qui peuvent agir en tant que catalyseur acide/base :

  • groupement imidazole de la chaine latérale de His
  • groupement α-aminé
  • groupement α-carboxylique
  • groupement thiol de Cys
  • groupement carboxylique de Glu et Asp
  • groupement ε-aminé de Lys
  • groupement phénol de Tyr
  • groupement guanidino de Arg

β. La catalyse par covalence (aussi appelée catalyse nucléophile) : elle concerne essentiellement les réactions enzymatiques où plusieurs substrats sont impliqués (environ 20% des enzymes et toutes les enzymes à mécanisme à 2 substrats de type "ping-pong").

Une partie du premier substrat est transférée à l'enzyme via la formation d'une liaison covalente puis cette partie du substrat est transférée au second substrat.

2ème facteur : l'effet de voisinage

La fixation d'une molécule de substrat au site actif d'une enzyme augmente la concentration effective du substrat par rapport à sa concentration à l'état libre en solution.

Les molécules ne sont plus assujetties au hasard de collisions suffisament énergétiques.

Cet accroissement de concentration augmente la fréquence de formation de l'état de transition.

facteurs accroissement

3ème facteur : la fixation préférentielle de l'état de transition

L'enzyme fixe plus fortement l'état de transition que le substrat ou le produit pour des raisons de contrainte ou de distorsion.

L'état de transition s'ajuste mieux et établit davantage de contacts avec les résidus d'acides aminés du site actif.

C'est trés probablement l'enzyme qui subit des changements de conformation (voir ajustement induit) car il est peu probable qu'il y ait suffisament d'énergie dans la fixation du substrat pour en contraindre la structure.

analogue etat transition

4ème facteur : la stabilisation de l'état de transition

Quand le complexe [enzyme - substrat] est formé, il est en équilibre avec sa forme activée, c'est-à-dire le complexe [enzyme - état de transition] ou ES#.

La stabilisation de l'état de transition déplace l'équilibre en faveur de ES# et en même temps abaisse l'énergie d'activation.

Il est important de noter que ce phénomène exige une fixation lâche du substrat (attention : pas une fixation lâche de l'état de transition !) à l'enzyme car une fixation trop forte irait à l'encontre de la catalyse.

L'enzyme doit donc maintenir le substrat en place tant que l'état de transition n'est pas atteint mais sans l'immobiliser. Si tel était le cas, le complexe ES formé serait trop stable pour atteindre sa configuration de l'état de transition (ES#).

5ème facteur : la catalyse électrostatique

Une protéine possède de nombreuses charges ainsi que des dipôles qui créent des champs électrostatiques dont l'intensité est très variable selon les endroits de la protéine. De plus ces charges fluctuent en fonction des changements de conformation de la protéine.

Quand le substrat se fixe à l'enzyme, les molécules d'eau sont de manière générale "exclues" du site actif (effet de désolvatation).

  • La constante diélectrique "locale" est donc abaissée ce qui accroit les forces d'interaction électrostatiques au niveau du site actif.
  • Cette exclusion protège les groupements réactifs de réactions parallèles avec l'eau.

Ainsi, les champs électrostatiques créés par la protéine au niveau du site actif sont complémentaires de la distribution des charges du substrat dans l'état de transition.

Un cas particulier est l'eau qui agit comme substrat (exemple des protéases à sérine).

L'ensemble de ces facteurs rend compte des valeurs d'accélération couramment observées avec les enzymes comme l'indique le tableau suivant :

Enzyme Vitesse non enzymatique (s-1) Vitesse enzymatique (s-1) Facteur d'accroissement
Chymotrypsine 4 10-9 4 10-2 107
Lysozyme 3 10-9 5 10-1 2 108
Triose phosphate isomérase 6 10-7 2 103 3 109
Fumarase 2 10-8 2 103 1011
Uréase 3 10-10 3 104 1014
Désaminase d'adénosine 10-12 102 1014
Phosphatase alcaline 10-15 102 1017
Source : "Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn, Scrimgeour (1994), Ed. DeBoecK Universités

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5. Les effets de l'encombrement intracellulaire des macromolécules ("Macromolecular crowding effects")

Les conditions "idéales" d'étude des cinétiques enzymatiques ne reflètent pas la réalité cellulaire.

Le milieu intracellulaire n'est pas rempli que d'eau et d'ions : il contient une très grande variété de petites molécules et de macromolécules (protéines, acides nucléiques, oligosaccharides).

La concentration des macromolécules peut varier de 200 à 400 mg/ml selon l'organisme et les types de cellules :

  • chez Escherichia coli, la concentration intracellulaire des métabolites est évaluée à 300 mM (100 millions de molécules de métabolites/cellule)
  • la concentration de la protéine cristalline atteint 500 mg/ml dans les cellules de la lentille
  • la concentration de l'hémoglobine dans les hématies est environ de 350 mg/ml
  • les polysaccharides contribuent également à cet encombrement, en particulier dans la matrice extracellulaire

Source : McGuffee & Elcock (2010)

specificite site actif fixation enzyme substrat stereochimie macromolecular crowding effect

Si on considère un cube de 100 nm d'arête, le volume du cytoplasme de Escherichia coli correspond à 600 cubes de cette taille.

Dans un de ces cubes, coexistent : 30 ribosomes avec plus de 100 facteurs protéiques, 30 aminoacyl-ARNt synthétases, 340 ARN de transfert, 2 à 3 ARN messagers, 6 ARN polymérases, 330 protéines (dont 130 enzymes de la glycolyse et 100 enzymes du cycle de Krebs), 300 autres molécules, 30.000 petites molécules (H20, cofacteurs, précurseurs et métabolites) et 50.000 ions.

Chez les Eucaryotes, le milieu intracellulaire contient en plus l'ensemble des protéines qui constituent le cytosquelette.

Dans une expérience in vitro, ce même cube ne contient qu'une molécule d'enzyme, les sels du tampon et les molécules d'eau.

Les effets de l'encombrement intracellulaire sont non linéaires : plus la macromolécule a une masse (donc bien souvent une taille) importante, plus elle en subit les effets. Ces effets sont donc nettement moins importants pour les petits métabolites et les ions.

Aucune espèce macromoléculaire n'est présente à forte concentration individuellement. Mais, ensemble, les macromolécules occupent une fraction importante du volume total : de 20 à 30 %.

Cette fraction du volume intracellulaire n'est donc physiquement pas disponible pour d'autres molécules. Cette exclusion stérique a des conséquences considérables du point de vue énergétique :

  • la concentration effective des macromolécules (plus précisément leur activité chimique) est augmentée et celà modifie considérablement les vitesses et les constantes d'équilibre des réactions in vivo.
  • l'encombrement intracellulaire favorise le repliement des protéines, l'auto-association de monomères (la dimérisation est augmentée d'un facteur 8 à 40 pour un monomère de 40 kDa) et les associations [protéines - protéines] et [protéines - autres composants de la cellule]. L'augmentation de la stabilité des protéines dans des conditions de surpeuplement macromoléculaire résulte d'une diminution de l'entropie de la dénaturation des protéines sans changement associé de l'enthalpie.
  • l'augmentation des interactions entre protéines a une incidence sur la conformation des enzymes et donc sur leur activité enzymatique.
  • une autre conséquence capitale de l'encombrement intracellulaire est la forte limitation (d'un facteur 10 à 20) de la diffusion des molécules : in vivo, il faut 2 µs à une protéine de 160 kDa pour parcourir une distance de 10 nm alors qu'il ne lui faut que 2 ns dans une solution homogène.

Effets de l'encombrement intracellulaire sur l'activité enzymatique

Le milieu intracellulaire diffère donc considérablement d'une solution homogène (conditions in vitro) dans laquelle les macromolécules biologiques sont dispersées (très diluées) : les concentrations des enzymes in vivo sont de l'ordre de 10-5 à 10-4 M, valeurs très supérieures aux concentrations des enzymes in vitro (de l'ordre de 10-10 à 10-7 M ).

Une étude du métabolome de Escherichia coli a montré que la concentration des métabolites est supérieure à la valeur de leur KM pour la grande majorité des enzymes.


Exemples d'effets de l'encombrement intracellulaire sur les paramètres cinétiques de la catalyse par quelques enzymes.

L'activité enzymatique augmente puis diminue avec l'augmentation de la concentration en protéines.
L'activité enzymatique diminue de façon monotone avec l'augmentation de la concentration de polymères.

 

L'addition de PEG 4000 à 20.000 :

  • augmente l'activité de la DNase I (KM n'est pas modifié pas VMax est augmentée d'un facteur 20) et de la nucléase S1
  • ne modifie pas significativement l'activité de l'exonucléase III
  • diminue l'activité de l'exonucléase I
L'activité spécifique de l'uréase augmente jusqu'à 10 fois en présence d'une concentration d'hémoglobine de 30% (en poids).
Le (PEG) 6000 augmente l'activité de l'enzyme AspP de Escherichia coli : une concentration de PEG 50 mg/mL diminue KM d'un facteur 4 et augmente VMax d'un facteur 6.
Le dextran 70.000, le Ficoll 70.000 ou le PEG 6000 augmente l'activité enzymatique de l'isochorismate synthase : une concentration de 25% de l'un de ces additifs, diminue KM d'un facteur 2 - 3.

L'activité spécifique de l'hexokinase diminue à des concentrations élevées de BSA : une concentration de BSA de 250 mg/mL diminue kcat de 33 % et diminue KM de 25 %.

Les effets des petits osmolytes et des concentrations élevées de BSA sur l'activité de l'hexokinase sont additifs.

L'encombrement intracellulaire est simulé in vitro par l'addition, dans le milieu de mesure de l'activité enzymatique, d'agents tels que le polyéthylène glycol (PEG), le Ficoll, le dextran ou l'albumine de sérum bovin (BSA).

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6. Illustration des protéases

Voir un cours sur les protéases.

a. Généralités

Les protéines ou les peptides sont hydrolysées en fragments peptidiques par des protéases.

Il en existe plusieurs familles constituées d'un trés grand nombre d'enzymes :


protéases à sérine métallo-protéases aspartyl-protéases protéases à cystéine protéases à thréonine
  • trypsine (EC 3.4.21.4)
  • LysC
  • thrombine
  • chymotrypsine
  • élastase
  • subtilisine
  • cathepsine
  • kallikréine
  • prostasine
  • granzyme
  • facteurs VIIa, IXa, Xa et XIIa de la coagulation

et bien d'autres ...

  • aminopeptidases A, B, N, O
  • carboxypeptidases A1 à A6, B, E, M, N, U
  • angiotensin-converting-enzyme 2
  • peptidases (hydrolyse de peptides tels que des neurotransmetteurs)

et bien d'autres ...

  • pepsines A, A4, A5
  • retropepsines de de rétrovirus
  • chymosine
  • rénine
  • cathepsines D, E

et bien d'autres ...

 

  • cathepsines B, F, H, K, L, O, S, V, W, X
  • calpaïnes 1 à 15
  • caspases 1 à 10
  • ubiquitinyl hydrolases
  • ubiquitinyl-spécific peptidases 1 à 54
  • secernine

et bien d'autres ...

et bien d'autres ...


Toutes les informations fonctionnelles (spécificité des substrats, inhibiteurs, séquences et autres) et structurales sont recensées dans les bases de données :

b. Les protéases à sérine

Les deux familles de protéases à sérine ("chymotrypsin-like" et "subtilisin-like") contiennent entre autres : la trypsine, la chymotrypsine, l'élastase, la subtilisine (voir tableau ci-dessus).

Chymotrypsine : en 1901, H. M. Vernon a proposé que les préparations de pancréas contiennent un activateur intrinsèque à ses propres enzymes. Cette idée ne fût acceptée qu'en 1934 quand Moses Kunitz et John Howard Northrop ont confirmé la présence d'une enzyme en plus de la trypsine : ils l'ont nommée chymotrypsine. Ils l'ont cristallisée de même que son précurseur inactif, le chymotrypsinogène.

En 1938, Kunitz a isolé différentes formes actives de la chymotrypsine en les appelant alpha, bêta et gamma. En 1947, Jacobsen a identifié des formes supplémentaires de la chymotrypsine en les appelant delta et pi.

Le domaine protéique appelé Kunitz (ou domaine inhibiteur de protéases de type Kunitz) est un domaine qui inhibe les protéases. Il est relativement petit (50 à 60 acides aminés). Exemple : l'aprotinine ou inhibiteur de la trypsine pancréatique bovine (BPTI).

En 1954, la première preuve du mécanisme catalytique en 3 étapes de l'hydrolyse de substrats amide et ester par la chymotrypsine a été apportée par Brian Hartley et B. Kilby. Ils ont émis l'hypothèse d'une forme acyl-enzyme intermédiaire, ce qui fut démontré ultèrieurement par Henderson en 1970. La chymotrypsine suit un mécanisme général de type "ping-pong".

En 1955, Michael Laskowski Jr. a obtenu une deuxième forme cristalline du chymotrypsinogène (chymotrypsinogène B).

Trypsine : en 1876 - 1877, Wilhelm Kühne a découvert la trypsine dans le liquide pancréatique de l'intestin de boeuf au cours de ses études sur la digestion intermédiaire des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Il a conclu que la trypsine était initialement inactive puis convertie en sa forme active. Cette observation est à la base de la notion de précurseur inactif des protéases que l'on appelle zymogène et de l'activation de ce zymogène par (auto)protéolyse.

En 1931, Northrop et Kunitz ont cristallisé la trypsine après la première purification de la pepsine en 1930.

En 1974 la structure tridimensionnelle de la trypsine a été déterminée et a servi de prototype pour la famille des endopeptidases à sérine de type S1 à laquelle la trypsine appartient.

De 1987 à 1992, des études de mutagénèse dirigée (trypsine recombinante) ont permis de déterminer le rôle d'acides aminés particulier.

La trypsine est utilisée dans les protocoles de cultures de cellules et de tissus, dans l'identification des protéines par séquençage de peptides (protéomique et spectromètrie de masse). La trypsine est une protéase très étudiée dans divers domaines médicaux : la mutation R117H empêche son autolyse et provoque la pancréatite. La trypsine a été utilisée pour modéliser la décomposition du cartilage articulaire dans l'ostéo-arthrite.

Elastase : on attribue à Christiaan Eijkman les premières études de l'élastase en 1904, comme produit des bactéries. Il a fallu attendre les études de J. Balo et I. Banga en 1949 pour démontrer qu'elle est une enzyme protéolytique du pancréas comme la trypsine et la chymotrypsine.

En 1968, David Shotton et Brian Hartley ont obtenu les premiers cristaux d'élastase porcine. Le rôle de l'élastase dans l'emphysème, l'athérosclérose et la pancréatite aiguë hémorragique a été étudié entre 1968 et 1974.

En 1974, W. Ardelt a découvert un deuxième type d'élastase appelée élastase pancréatique II.

Les protéases à sérine sont probablement les enzymes les plus étudiées tant du point de vue du mécanisme catalytique (voir ci-dessous) avec un trés grand nombre d'inhibiteurs de toutes sortes, que du point de vue structural. Par exemple, on dénombre plus de 900 structures cristallographiques liées à la trypsine (trypsine, trypsinogène, Kunitz trypsin inhibitor, ...).

Les protéases à sérine sont biosynthètisées sour forme d'un précurseur inactif, le zymogène, qui est activé par coupure protéolytique par des protéases à sérine.

Les protéases à sérine sont essentiellement des endopeptidases. Elles hydrolysent la liaison peptidique en fonction de la nature de certains acides aminés.

Par exemple, la trypsine hydrolyse la liaison peptidique après (côté C-terminal) les acides aminés lysine et arginine sauf si ces acides aminés sont suivis par une proline.

Cependant les protéases à sérine peuvent avoir une spécificité très complexe.

Hydrolyse par la trypsine

  • Aller à la page "MS-Digest" du logiciel "Prospector". Cliquer sur "perform digest" pour avoir un aperçu d'un résultat d'hydrolyse in silico d'une protéine.
  • Voir la liste de certaines protéases et leur spécificité : "Expasy".

c. Les acides aminés du site catalytique des protéases à sérine : la "triade" catalytique

Les protéases à sérine possèdent une sérine 195 réactive dans leur site actif.

Deux autres acides aminés sont impliqués dans la catalyse par les protéases à sérine : l'histidine 57 et l'aspartate 102.

Les protéases à sérine utilisent les deux types de catalyse :

  • l'histidine 57 sert de catalyseur acide-base. On estime que les acides aminés mis en jeu dans la catalyse acide - base accélèrent de 10 à 100 fois les réactions enzymatiques par rapport à la vitesse de la même réaction non catalysée par une enzyme.
  • la sérine 195 sert de catalyseur par covalence avec un carbone de la liaison peptidique qui va être clivée. L'accélération par la catalyse covalente est du même ordre de grandeur.
Figure ci-contre : les 3 acides aminés His 57, Asp 102 et Ser 195 forment la "triade catalytique".

Triade catalytique

source : E. Jaspard (2011) - Image réalisée avec CHIMERA - UCSF

Visualisation de la triade catalytique dans la forme acyl-enzyme de l'élastase pancréatique à une résolution de 0,95 Å.

Code PDB : 1GVK

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

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7. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

Voir un trés bon cours : Enzyme Mechanisms

1ere étape : formation du complexe enzyme-substrat (ES)

La protéase fixe le substrat (protéine ou peptide) dont elle hydrolyse la liaison peptidique au niveau d'acides aminés spécifiques de la protéase considérée.

La chaîne latérale R1 de l'acide aminé impliqué dans l'hydrolyse de la liaison peptidique est de nature aromatique ou encombrante (dans le cas de la trypsine) mais de toute autre nature pour d'autres types de protéases.

Cette chaîne latérale se fixe dans un endroit particulier du site actif de la protéase appelée "poche de spécificité" ("specificity pocket") de caractère hydrophobe.

Cette fixation optimise l'orientation stéréochimique de la liaison peptidique afin qu'elle soit hydrolysée du côté C-terminal (carboxyle) du résidu d'acide aminé.

Le squelette carboné du polypeptide substrat forme un court feuillet β avec le squelette carboné de l'enzyme au niveau du site actif (non montré dans la figure).

L'oxygène du groupement carbonyle du substrat forme une liaison hydrogène avec un groupement NH- (amide) du squelette carboné de l'enzyme (non montré dans la figure).

Le complexe enzyme-substrat (ES) est ainsi formé.

Formation ES protease a serine

2ème étape : acylation / formation du premier intermédiaire tétrahédrique

L'oxygène du groupement OH de la Ser 195 du site actif est activé en formant une liaison hydrogène avec l'azote N: du noyau imidazole de l'His 57. His 57 agit comme un accepteur de proton de Ser 195, selon un mécanisme de catalyse base générale, et devient His-H+.

En même temps, l'oxygène Ser-O devient nucléophile et attaque le C du groupement carbonyle de la liaison petidique à hydrolyser. Une liaison covalente est ainsi formée selon le mécanisme de catalyse par covalence.

Asp 102 a pour rôle le maintien d'un arrangement stéréospécifique idéal du réseau de liaisons hydrogène établi entre His 57 et Ser 195. Il stabilise aussi la forme HisH+ par interaction électrostatique ce qui facilite le transfert du proton.

Le résultat de cette étape dite d'acylation est la formation du premier intermédiaire tétrahédrique dont la structure est probablement semblable à celle de l'état de transition (ES#) avec un oxygène carbonyle négatif appelé l'oxyanion. Le site actif fixe plus fortement l'oxyanion qu'il ne fixe le groupement carbonyle original du substrat : l'état de transition est ainsi stabilisé.

Une autre liaison hydrogène est établie entre l'oxyanion et un groupement NH- du squelette carboné de l'enzyme (au niveau de Gly 193) situé dans une région appelée "trou oxyanion".

Schema catalytique suite

3ème étape : acylation (formation de l'acyl-enzyme) / libération du produit P1

La liaison peptidique originelle est clivée : His-H+ cède un proton à la moitié "amino" du substrat d'origine et agit selon un mécanisme de catalyse acide générale.

Cette partie aminée est dissociée du site actif et le produit P1 (R2NH2) est libéré.

L'oxyanion redevient C=O qui reste attaché de manière covalente à Ser 195.

C'est l'intermédiaire acyl-enzyme fixé par une liaison ester entre la moitié "carbonyle" du substrat d'origine et l'oxygène de la fonction alcool de Ser 195.

liberation premier produit

4ème étape : désacylation / formation du second intermédiaire tétrahédrique

Le second substrat, la molécule d'eau, forme une liaison hydrogène avec HisN: et His 57 agit de nouveau selon un mécanisme de catalyse base générale, et devient HisH+.

L'oxygène de l'eau est activé ce qui le rend nucléophile : il attaque le C du groupe carbonyle de l'acyl-enzyme (catalyse par covalence).

Asp 102 a pour rôle le maintien d'un arrangement stéréospécifique idéal du réseau de liaisons hydrogène établi entre His 57 et Ser 195. Il stabilise aussi la forme HisH+ par interaction électrostatique ce qui facilite le transfert du proton.

Le résultat de cette étape est la formation du second intermédiaire tétrahédrique (groupement -OH au lieu d'un groupement amide dans le cas du premier) dont la structure est probablement semblable à celle de l'état de transition (ES#) avec un oxygène carbonyle négatif (oxyanion).

Le site actif fixe plus fortement l'oxyanion qu'il ne fixe le groupement carbonyle original du substrat : l'état de transition est ainsi stabilisé.

De nouveau, une autre liaison hydrogène est établie entre l'oxyanion et un groupement NH- de Gly 193 situé dans le "trou oxyanion".

Formation 2eme intermediaire

5ème étape : désacylation / libération de P2 / reformation de E

His-H+ redonne son proton à l'oxygène de la fonction alcool de Ser 195 de l'acyl-enzyme.

La liaison ester est clivée, libérant le produit P2 : R1COOH = la partie N-terminale du substrat d'origine).

Les 3 acides aminés de la triade catalytique retrouvent leur état initial.

L'enzyme sous forme E est prête à catalyser de nouveau cette réaction.

formation second produit

Schémas réalisés avec ChemBioDraw®.

Figure ci-contre : mécanismes d'inhibition par différents composés qui forment un intermédiaire tétrahédrique.

Ces composés ont permis d'identifier la sérine 195 du site actif des protéases à sérine.

intermediaire tetrahedrique catalyse protease serine

 

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