Le cytochrome c, la chaîne respiratoire et l'apoptose

1. Les cytochromes

2. Le cytochrome c

3. Phylogénie et historique de la photosynthèse et de la respiration

4. Implication du cytochrome c dans l'apoptose

5. Les 2 voies de l'apoptose

6. Signalisation de l'apoptose

7. Les caspases

8. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Les cytochromes

Le nom de cytochrome a été proposé par D. Keilin en 1925.

Ce sont des protéines qui contiennent un ou plusieurs groupements hème : un atome de fer à l'état ferreux (FeII) ou ferrique (FeIII) chélaté par un groupe tétrapyrrole. L'état d'oxydation Fe(IV) est trouvé dans certains systèmes enzymatiques comme intermédiaire catalytique.

Un hémochrome est défini comme un composé hème de spin faible au sein duquel la 5ème et la 6ème position de coordination sont occupées par des ligands à fort champs par rapport à l'état d'oxydation du fer.

Il existe 4 groupes de cytochromes :

  • groupe a (exemples : a1, a3) : cytochromes dont le groupe prosthétique hème est un hème a dont l'atome de fer est chélaté à une cytoporphyrine IX.
  • groupe b (exemples : b1, b2, b3, b5, b6, b7, b-559, b-562, b563, b' ou bo) : cytochromes avec un protohème. L'atome de fer est chélaté à une cytoporphyrine IX en tant que groupe prosthétique mais il n'y a pas de liaison covalente entre la porphyrine et le cytochrome.
  • groupe c (exemples : c, c1 à c7, c-551, c-552, c-553, c-555, c-556, f): cytochromes avec une liaison covalente thioether entre l'une et/ou l'autre des chaînes vinyle du protohéme et le cytochrome.
  • groupe d (exemples : d1, a2) : cytochromes dont le groupe prosthétique est un atome de fer chélaté par un noyau tétrapyrrole au sein duquel le degré de conjugaison des liaisons doubles est inférieur à celui au sein de la porphyrine. Exemples : dihydro-porphyrine (chlorine - hème d aussi appelé hème a2), tétrahydro-porphyrine (isobactériochlorines - hème d1), sirohème.

La classification est aussi liée à la plus faible longueur d'onde d'absorbance du groupement hème (bande d'absorbance de la pyridine ferro-hémochrome en solution alcaline) lors de la réduction :

  • groupe a : 580-590 nm
  • groupe b : 556-563 nm
  • groupe c : 553 nm (1 liaison covalente thioether)
  • groupe c : 549-551 nm (2 liaisons covalentes thioether)
  • groupe d : 600-620 nm

Il existe d'autres transporteurs d'électrons dans les cellules qui contiennent d'autres types de groupements prosthétiques. Exemples : la ferrédoxine (fer et soufre), l'azurine (cuivre), la plastocyanine.

2. Le cytochrome c

Ces sont les premières séquences de protéines qui ont été intégrées dans la base de données Swiss-Prot/Uniprot !

  • cytochrome c - Homo sapiens : P00001 (obsolète) devenu P99998 (chimpanzé) et P99999 (humain)
  • cytochrome c - Macaca mulatta (macaque) : P00002
  • cytochrome c - Equus caballus (cheval) : P00004
  • cytochrome c - Canis lupus familiaris (chien) : P00011
  • ...

Le cytochrome c est une petite protéine trés soluble (70 à 120 acides aminés selon la classe - voir ci-dessous / 105 acides aminés chez l'homme - masse molaire = 11,8 kDa), associée à la membrane interne des mitochondries.

Le génome de Geobacter sulfurreducens code pour plus de 100 cytochromes c (!) qui acceptent des donneurs et des accepteurs d'électrons trés divers ce qui laisse supposer de grandes aptitudes d'adaptation via de multiples voies métaboliques.

Il existe 4 classes de cytochromes c (Ambler, 1991) :

  • la classe I : elle inclue les cytochromes c des mitochondries et des bactéries. Le site de fixation de l'héme est du côté N-terminal (His) et la 6ème liaison de coordination est fournie par une Met située 40 acides aminés plus loin vers l'extrémité C-terminal. Sur la base de similarité de séquences, la classe I est subdivisée en 5 sous-classes (IA à IE). La classe IA inclue le cytochrome c2 "long" (tel que celui de Rhodospirillum rubrum) et le cytochrome c-550 qui possèdent des boucles additionelles par rapport au cytochrome c de la classe IB. La classe IB inclue le cytochrome c des mitochondries eucaryotes et le cytochrome c2 "court" des procaryotes (tel que celui de Rhodopila globiformis).).
  • la classe II : elle inclue le cytochrome c' (appelé "high-spin cytochrome") et un certain nombre de "low-spin cytochrome" (cytochrome c-556). Le site de fixation de l'hème est du côté C-terminal.
  • la classe III : elle inclue les cytochromes qui contiennent plusieurs hèmes de faible potentiel rédox. Exemples : le cytochrome c7 de Geobacter sulfurreducens (71 acides aminés - 3 hèmes), le cytochrome c3 (4 hèmes), et les HMC ("high-molecular-weight cytochrome c" - 16 hèmes) avec 30 à 40 acides aminés par groupement hème. Les groupements hèmes des cytochromes c sont tous doublement coordinés à une His. Ils sont tous différents tant du point de vue structural que fonctionnel et ont des valeurs de potentiel rédox dans la gamme 0 à -400 mV.
  • la classe IV : elle inclue les complexes protéiques qui contiennent d'autres types de groupes prosthétiques en plus de l'hème c. Exemples : les flavocytochromes c et les cytochromes cd.

Le cytochrome c est un composant essentiel de la chaîne de transport des électrons (figure ci-dessous).

Chaine respiratoire

Source : KEGG - "Oxidative phosphorylation"

La figure originale est interactive et permet d'obtenir un trés grand nombre d'informations concernant les gènes, les protéines et autres pour les divers complexes.

Le complexe III de la chaîne respiratoire

Le cytochrome c est un transporteur mobile de la chaîne respiratoire. Il est constitué entre autre d'une protéine Fe - S, d'un cytochrome b qui porte les groupes hème b560 et b566 et du cytochrome c1.

Les électrons sont cédés par le complexe III au cytochrome c (attention : différent du cytochrome c1). Puis les 4 électrons sont transferés un à un du cytochrome c au complexe IV. L'ordre de transfert des électrons est : cytochrome c ---> atome de cuivre A ---> hèmes cytochrome a ---> [hème cytochrome a3 / atome de cuivre B].

Le tracé des électrons n'a été résolu que quand un trajet circulaire, appelé cycle Q, fût suggéré par Peter Mitchell puis détaillé entre autres par Bernard Trumpower. Le coenzyme Q et le coenzyme QH2 diffusent d'une face à l'autre de la membrane mitochondriale interne et l'ensemble des deux hèmes du cytochrome b occupe toute l'épaisseur de cette membrane.

Bilan du cycle Q : coenzyme QH2+ 2 cyt coxydé + 2 H+ matrice ---> coenzyme Q + 2 cyt creduit + 2 H+espace intermembranaire

La variation d'énergie libre de Gibbs liée au parcours des électrons au sein du complexe III permet l'expulsion de 2 x 2 protons vers l'espace intermembranaire. Le complexe III contribue à la force protons motrice.

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L'hème contient un atome de fer au sein d'un noyau porphyrine.

L'atome de fer est lié à 4 atomes d'azote du noyau porphyrine.

Seul l'hème du cytochrome c est covalemment lié à des résidus cystéine via une liaison thioether.

Les groupements hèmes des groupes a, b et c de cytochrome diffèrent légèrement au niveau des substituants du noyau porphyrine. Par exemple, l'hème du cytochrome a possède une longue chaîne farnesyle qui inclue 3 unités isoprènoides.

 

Structure heme cytochrome C

Source : KEGG - "Oxidative phosphorylation"

Schéma de la fixation de l'hème au cytochrome c mitochondrial

Les groupement vinyle de l'hème sont saturés par l'addition de groupements thiols de Cys inclues dans un motif C14XXC17H18.

Les Cys établissent donc des liaisons covalentes entre l'hème (noyau porphyrine en bleu) et le cytochrome c et l'atome d'azote de His ligande l'atome de fer (en bleu) de l'hème.

La 6ème liaison de coordination à l'atome de fer est fournie par Met80 (chez les Eucaryotes) située vers l'extrémité C-terminal.

Selon les règnes, on trouve d'autres acides aminés à la place de la Met : His chez les bactéries, Cys, un acide aminé N-terminal, Asn, Lys, voire un site de coordination libre.

Adapté de Allen et al. (2008)

Structure heme cytochrome C

Voir une étude des acides aminés invariants des cytochromes.

Le cytochrome c et d'autres cytochromes sont parmi les protéines qui ont été le plus étudiées sur le plan structural (grande facilité d'obtention, stabilité de la structure se prêtant à la cristallisation, petit nombre d'acides aminés, ...).

Il existe plus d'une centaine de structures PDB !

Ci-contre, cytochrome c du thon.

Structure 3D cytochrome C

Visualisation du cytochrome c du cheval à une résolution de 1,90 Å.

Code PDB : 1HRC

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

3. Phylogénie et historique de la photosynthèse et de la respiration

Le cytochrome c est une protéine qui existe depuis pratiquement le début de la vie sur terre et on le trouve dans la plupart des êtres vivants, (plantes, animaux, levures, bactéries) et on en connait un trés grand nombre de séquences.

C’est donc une protéine qui se prête à des études de phylogènie pour étudier l’évolution des espèces.

Alignement de sequences de cytochrome c

Figure ci-contre : arbre phylogénique, sur la base des séquences du cytochrome c, retraçant l'évolution des métabolismes bactériens et notamment l'apparition de la respiration bien après la photosynthèse.

La respiration au sulfate a précédé la respiration à l'oxygène, apparue obligatoirement après la photosynthèse évoluée décomposant l'eau et enrichissant l'atmosphère en oxygène.

Source : "Physiologie végétale" (1995) - D. Laval-Martin et P. Mazliak

Arbre phylogenetique du cytochrome C

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4. Implication du cytochrome c dans l'apoptose

Certaines protéines pro-apoptotiques de la famille Bcl-2 ("B-cell lymphoma 2") telles que Bax et Bak sont localisées sur la membrane du réticulum endoplasmique (RE) et interagissent avec le domaine cytosolique d'IRE-1 ("Inositol-Requiring Enzyme-1").

Elles régulent l'homéostasie calcique.

Remarque : Bcl-2 est à la fois le nom de la famille et le nom de protéines anti-apoptotiques.

Le RE peut relarguer du calcium intracellulaire via les canaux sous contrôle du récepteur de l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP3R).

Le relarguage du calcium du RE peut activer des calpaïnes, qui peuvent à leur tour activer par protéolyse la caspase 12, un médiateur de l'apoptose.

Source : Malhi & Kaufman (2011)

Apoptose proteines bcl2 bax et bak

L'afflux de calcium dans la mitochondrie altère la perméabilité de la membrane mitochondriale ce qui induit un relarguage du cytochrome c dans le cytosol via des pores de transition de perméabilité (PT).

Le pore PT est un canal constitué de :

  • la porine ("Voltage Dependent Anion Channel" - VDAC) - membrane externe
  • l'ANT ("Adenine Nucléotide Translocator") - membrane interne
  • la cyclophiline D (protéine matricielle)

La fixation du cytochrome c à la protéine Apaf-1 ("Apoptotic peptidase activating factor") entraîne l'activation de la caspase 9 qui accélère l'apoptose en activant d'autres caspases ("aspartic-acid-specific cystein proteases").

Apoptose pore mitochondrie et relarguage du cytochrome c

Source : RCDRG

5. Les 2 voies de l'apoptose

Entre 50 milliards et 70 milliards de cellules meurent chaque jour par apoptose chez l'humain adulte.

La voie intrinsèque est régulée par les membres de la famille Bcl-2 et la fonction des effecteurs est médiée par le relarguage de protéines comme le cytochrome c après perméabilisation de la membrane mitochondriale externe, comme décrit ci-dessus.

Le cytochrome c, la protéine Apaf-1, la pro-caspase 9 et l'ATP forment un complexe multi-protéique appelé l'apoptosome (figure ci-contre).

Apaf-1 contient :

  • un domaine CARD ("CAspase Recruitment Domain") qui se fixe au domaine CARD de la caspase 9
  • plusieurs domaines à motifs WD répétés qui se fixent au cytochrome c
  • un domaine NB-ARC qui permet l' oligomérisation de Apaf-1 sous forme d'un heptamère

Apoptosome caspase 9

Source : RCDRG

La caspase 9 est activée et elle active à son tour la caspase 3.

Ces caspases hydrolysent des protéines clé comme celles du cytosquelette, ce qui entraîne un changement typique de la morphologie des cellules observée lors de l'apoptose.

Source : RCDRG

Apoptosome caspase 9

La voie extrinsèque, appelée aussi la voie du récepteur de mort cellulaire ("death receptor pathway"), est déclenchée par la fixation de molécules à des récepteurs de l'apoptose qui appartiennent à la famille "tumor necrosis factor" ou TNF.

Ces récepteurs contiennent un domaine intracellulaire de signalisation de mort cellulaire qui recrute et active des caspases initiatrices telles que la caspase 8 ou la caspase 10.

Il s'en suit l'activation de caspases effectrices telles que la caspase 3, la caspase 6 ou la caspase 7.

La voie extrinsèque a lieu indépendamment de la famille Bcl-2.

Les 2 voies ont donc rarement lieu ensemble, sauf dans les hépatocytes, où l'hydrolyse par la caspase 8 médie l'activation de la protéine "BH3-only" Bid , un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2. Bid est activée par protéolyse par la caspase-8 au niveau de sa région intrinsèquement désordonnées ("Intrinsically disordered regions").

En dehors de ceux médiés par l'activation des récepteurs de mort cellulaire, il existe des mécanismes qui déclenchent aussi une cascade d'activation de caspases.

Par exemple, la granzyme B relarguée dans les cellules par les lymphocytes T cytotoxiques, peut activer directement les caspases 3, 7, 8 et 10.

La granzyme B est une protéase à sérine.

Source : Qiagen

Activation de l'apoptose par la granzyme B

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6. Signalisation de l'apoptose

a. Via les récepteurs de mort cellulaire

Les récepteurs de mort cellulaire sont situées à la surface des cellules.

Ils transmettent les signaux apoptotiques qui sont initiés par des ligands spécifiques tels que FasL ("Fas Ligand"), TNF α et TRAIL.

La fixation du ligand aux récepteurs de mort cellulaire peut générer des céramides produits par la sphingomyelinase acide (ou sphingomyeline phosphodiestérase - EC 3.1.4.12) à partir de la sphingomyeline.

Les céramides (figure ci-contre) sont une famille de sphingolipides , composés d'une sphingosine et d'un acide gras.

Les sphingolipides sont en grande quantité dans les membranes des cellules.

Ceramide lipide membranaire

Cette formation importante de céramides entraîne la fusion de lipides qui induit un regroupement d'un très grand nombre de récepteurs de mort cellulaire, ce qui a pour conséquence d'amplifier le signal de la mort cellulaire.

En l'absence de regroupement de récepteurs de mort cellulaire, certaines cellules comme les lymphocytes sont malgré tout capables de déclencher l'apoptose. Mais dans la plupart des cas, ce mode d'amplification est nécessaire à la pleine activation de la réponse apoptotique.

La fixation du ligand au récepteur de mort cellulaire induit un changement de conformation du domaine intracellulaire du récepteur. Ce changement révèle un domaine de mort cellulaire qui lui permet de recruter de nombreuses protéines apoptotiques. Ce complexe protéique est appelé DISC ("Death Inducing Signalling Complex").

L'étape suivante est le recrutement d'une caspase (typiquement la caspase 8) par DISC, caspase qui est activée et qui initie l'apoptose.

Voir une très belle animation.


b. Via les récepteurs TNF α ("tumor necrosis factor α" ou cachexine)

TNF α est une cytokine (glycoprotéine - 185 acides aminés) produite par les lymphocytes T et les macrophages activés en reponse à l'infection et aux processus inflammatoires

L'activation du récepteur de TNF - le récepteur TNFR1 a de nombreux effets.

La fixation de TNF α à TNFR1 induit la trimèrisation du récepteur et le regroupement de domaines intracellulaires de mort cellulaire.

Une molécule adaptatrice appelée TRADD ("TNF-RI-associated with death domain") peut alors s'y fixer via les interactions entre les domaines de mort cellulaire.

TRADD peut recruter un grand nombre de protéines différentes au récepteur activé. Le recrutement de TRAF2 ("TNF-associated factor 2") peut conduire à l'activation des voies de signalisation NF-kB et JNK ("c-Jun N-terminal kinase").

JNK a des effets pro-apoptotiques : activation induite par phosphorylation de Bim et inactivation des protéines Bcl2.

TRADD peut aussi s'associer à FADD ("Fas associated protein with death domain"), ce qui conduit à l'induction de l'apoptose via le recrutement et l'hydrolyse de la pro-caspase 8.

Source : RCDRG

Structure des recepteurs TNF

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7. Les caspases ("Cysteine-dependent ASPartyl-specific proteASES")

En 2011, on dénombre 15 caspases.

Elles ne sont pas toutes impliquées dans l'apoptose. Par exemple, la caspase 1 ("interleukin-1-beta converting enzyme" - ICE) est impliquée dans les processus inflammatoires.

Il existe 2 types de caspases apoptotiques :

  • les caspases initiatrices (2 domaines DED - "Death Effector Domain" - caspases 2, 8, 9 et 10).
  • les caspases effectrices (caspases 3, 6, 7, 14).
  • les caspases initiatrices protéolysent la forme précurseur inactive des caspases effectrices.

Les caspases qui contiennent un domaine CARD ("CAspase Recruitment Domain") sont soit :

  • des caspases initiatrices, impliquées dans la voie intrinsèque (caspase 2 - appareil de Golgi et caspase 9 - mitochondrie)
  • des caspases impliquées dans l'activation de cytokines pro-inflammatoires (caspases 1, 4 et 5).

Les caspases appartiennent à la famille des protéases à cystéine et sont biosynthétisées sous la forme de précurseurs inactifs (ou zymogènes) : les pro-caspases. Ces zymogènes sont activés par coupure protéolytique par des caspases ou par auto-activation.

Les caspases ont une structure très conservée  :

  • un pro-domaine N-terminal de taille variable : celui des caspases initiatrices est plus long que celui des caspases effectrices
  • un domaine catalytique appelé grande sous-unité ou p20 (17 - 21 kDa)
  • un domaine catalytique appelé petite sous-unité ou p10 (10 - 14 kDa)
  • certaines caspases possèdent un domaine de liaison entre p20 et p10

Structure schematique des caspases

L'activation du zymogène en caspase active s'effectue par 2 coupures protéolytiques successives au niveau d'une liaison Asp-X (Asp en position P1 - voir la figure ci-dessous). La première coupure protéolytique libére la petite sous-unité et la seconde libére le pro-domaine.

La caspase active est un tétramère composé de deux p20 et deux p10.

Le site catalytique du domaine p20 des caspases est très conservé : motif QACXG où C est la Cys active et X = Gly, Gln ou Arg.

Les caspases sont trés sélectives (voir des exemples de cibles des caspases). On note qu'un grand nombre de protéines kinases sont protéolysées pendant l'apoptose.

Source : Denault & Salvesen (2002)

Site actif des caspases

Structures 3D : caspase 3 / PDB 1PAU - caspase 6 / PDB 3OD5 - pro-caspase 7 / PDB 1K88 - caspase 7 / PDB 1F1J - caspase 9 / PDB 1NW9

 

8. Liens Internet et références bibliographiques

Keilin, D. (1925) Proc. R. Soc. (Lond.) B. Biol. Sci 98, 312-339

Ambler, R.P. (1991). "Sequence variability in bacterial cytochromes c" Biochim. Biophys. Acta 1058, 42 - 47

"Nomenclature of Electron-Transfer Proteins : section 4 - Cytochromes"

"Reproductive and Cardiovascular Disease Research Group"

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Pokkuluri et al. (2011) "Structure of a novel dodecaheme cytochrome c from Geobacter sulfurreducens reveals an extended 12 nm protein with interacting hemes" J. Struct. Biol. 174, 223 - 233

Allen et al. (2008) "Order within a mosaic distribution of mitochondrial c-type cytochrome biogenesis systems ?" FEBS J. 275, 2385 - 2402

Article

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Lynes & Simmen (2011) "Urban planning of the endoplasmic reticulum (ER): How diverse mechanisms segregate the many functions of the ER" BBA 1813, 1893 - 1905

Rautureau et al. (2010) "Intrinsically Disordered Proteins in Bcl-2 Regulated Apoptosis" Int. J. Mol. Sci. 11, 1808 - 1824

Article

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"Les mécanismes moléculaires de l'apoptose" - J.E. Ricci

"The CAspase Substrate dataBAse Homepage"

"CASVM: Server for SVM Prediction of Caspase Substrates Cleavage Sites"

"Domain structure of the human caspases in the UniProt database"

Denault & Salvesen (2002) "Caspases" Curr. Protoc. Prot. Sci. 21.8

123bio.net

The CASBAH

CASVM

InterPro

Article

 

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