La dégradation des protéines : marquage par l'ubiquitine et les protéasomes
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1. Généralités

2. Le marquage des protéines dégrader par l'ubiquitine

a. Structure de l'ubiquitine
b. Mécanisme du marquage par l'ubiquitine
c. Mécanisme de reconnaissance sélective des protéines à marquer
d. Les enzymes E3 - "Ubiquitin-protein ligases"
e. Le complexe LUBAC
f. Devenir des protéines selon le type de marquage par l'ubiquitine (mono- et poly-ubiquitinylation greffée ou linéaire)

3. Les enzymes de désubiquitinylation

 

4. Le protéasome 26S

5. Le protéasome 20S

6. Le protéasome 19S

7. Autres activateurs du protéasome 20S

8. Les machineries protéolytiques de la famille [AAA / ATPase]

9. La protéase ATP-dépendante bactérienne ClpXP

10. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Généralités.
Les protéines sont constamment synthétisées et dégradées dans tous les types de cellules dans le but :
  • d'éviter les risques d'accumulation de protéines défectueuses qui pertuberaient gravement le fonctionnement cellulaire. Ces protéines défectueuses résultent de la mutation d'un ou plusieurs acide(s) aminé(s) au cours de la biosynthèse ou de dommages subits pendant leur fonctionnement au sein de la cellule (exemple : le stress oxydatif).
  • d'assurer un recyclage des acides aminés.

Il existe 3 processus de protéolyse (hydrolyse des protéines) :

a. Une hydrolyse non spécifique des protéines ou des peptides alimentaires en fragments peptidiques par des protéases (enzymes digestives).

Il en existe plusieurs familles constituées d'un trés grand nombre d'enzymes :


protéases à sérine

EC 3.4.16

EC 3.4.21

métallo-protéases

exo- : EC 3.4.17

endo- : EC 3.4.24

aspartyl-protéases

EC 3.4.23

protéases à cystéine

EC 3.4.18

EC 3.4.22

protéases à thréonine

EC 3.4.25

  • trypsine (EC 3.4.21.4)
  • LysC
  • thrombine
  • chymotrypsine
  • élastase
  • subtilisine
  • cathepsine
  • kallikréine
  • prostasine
  • granzyme
  • facteurs VIIa, IXa, Xa et XIIa de la coagulation
  • fibrinolysine
  • protéine C
  • protéinase 3, K
  • plasmine
  • acrosine

et bien d'autres ...

  • aminopeptidases A, B, N, O
  • carboxypeptidases A1 à A6, B, E, M, N, U
  • angiotensin-converting-enzyme 2
  • peptidases (hydrolyse de peptides tels que des neurotransmetteurs)
  • thermolysine

et bien d'autres ...

  • pepsines A, A4, A5
  • retropepsines de de rétrovirus
  • chymosine
  • rénine
  • cathepsines D, E

et bien d'autres ...

 

  • cathepsines B, F, H, K, L, O, S, V, W, X
  • calpaïnes 1 à 15
  • caspases 1 à 10
  • ubiquitinyl hydrolases
  • ubiquitinyl-spécific peptidases 1 à 54
  • secernine
  • papaïne

et bien d'autres ...

et bien d'autres ...

Toutes les informations fonctionnelles (spécificité des substrats, inhibiteurs, séquences et autres) et structurales sont recensées dans les bases de données :


b. Un système protéolytique dans le lysosome des Eucaryotes qui permet de recycler les protéines membranaires, les protéines extracellulaires et les protéines caractérisées par de trés longs temps de demi-vie.

c. Enfin, chez les Eucaryotes, les Archées et certaines bactéries, il existe un processus hautement sélectif et régulé qui se déroule dans le noyau et le cytoplasme et qui nécessite de l'énergie (hydrolyse de l'ATP) : il s'agit du système protéolytique ubiquitine-protéasome.

Ce système joue un rôle majeur dans la dégradation des protéines impliquées dans le cycle cellulaire, la prolifération, l'apoptose, le contrôle de la transcription, la transduction du signal et la régulation du métabolisme.

De nombreuses enzymes qui constituent des points de contrôle des voies métaboliques sont aussi des cibles d'une dégradation fréquente.


Remarque : il existe d'autres processus de protéolyse qui n'ont pas trait à la dégradation des protéines mais bien au contraire à leur maturation par modifications post-traductionnelles. Il s'agit du clivage, entre autre,

  • de la méthionine N-terminale issue du codon d'initiation de la traduction
  • du clivage du (pré)-pro-peptide dans le cas de certains précurseurs inactifs (exemple : les protéases synthétisées sous forme de zymogène)
  • du clivage du peptide signal en position N-terminale de la chaîne polypeptidique

Les temps de demi-vie dans la cellule des protéines sont trés variables : ornithine décarboxylase 11 min - tryptophanne oxygénase 2 h - myosine 30 jours.

Ces temps de demi-vie sont en général plus courts que celui des cellules o se trouvent ces protéines.

Un contre-exemple est l'hémoglobine dont le temps de demi-vie (110 jours) est équivalent celui des érythrocytes o on la trouve.

L'acide aminé en position N-terminale a une grande importance sur le temps de demi-vie des protéines (tableau ci-contre).

Les protéines qui possèdent un motif dit "PEST", motif de 12 acides aminés riche en Pro (P), Glu (E), Ser (S) et Thr (T), sont plus rapidement degradées.

La règle du N-terminal (Alexander Varshavsky, 1996)

Acide aminé N-terminal temps de demi-vie
Acide aminé stabilisants
Met / Gly / Ala / Ser / Thr / Val > 20h
Acide aminé déstabilisants
Ile / Gln 30 min
Tyr / Glu 10 min
Pro 7 min
Leu / Phe / Asp / Lys 3 min
Arg 2 min

Ces règles ne sont pas absolues car de nombreux paramètres influent sur le temps de demi-vie (et le taux de synthèse - dégradation) des protéines et des macromolécules biologiques.

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2. Le marquage des protéines par l'ubiquitine

a.Structure de l'ubiquitine

Chez les Eucaryotes, le processus de dégradation des protéines met en jeu une protéine de 76 acides aminés (8,6 kDa) : l'ubiquitine.

Cette protéine est ainsi appelée du fait de son ubiquité dans tous les règnes Eucaryotes et dans tous les compartiments cellulaires des Eucaryotes.

Le mécanisme complet dans lequel cette protéine est impliquée a été élucidé au début des années 80 par Aaron Ciechanover, Avram Hershko et Irwin Rose (Prix Nobel de Chimie en 2004).

L'ubiquitine contient en particulier 7 résidus lysine et la glycine 76 C-terminale qui jouent un rôle trés important :

MQIFVK6TLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPP

DQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQK63ESTLHLVLRLRGG76

L'ubiquitine est toujours synthétisée sous la forme d'un précurseur inactif avec une extension du côté C-terminal au del de la glycine 76.

structure de l'ubiquitine

Code PDB : 1UBQ

Visualisation de l'ubiquitine à une résolution de 1,8 Å.

Cliquer sur les acides aminés.

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

Il existe des protéines appelées "Ubiquitin-like protein" (UBLs) qui marquent également des protéines impliquées dans diverses voies de transduction du signal :

  • "Small Ubiquitin-related MOdifier" (SUMO) : la modification post traductionnelle s'appelle la sumoylation.
  • ISG15 ("Interferon-induced 15 kDa protein") : la modification post traductionnelle s'appelle l'ISGylation.
  • NEDD8 ("Neddylin") : NEDD8 a 60% d'acides aminés identiques à l'ubiquitine.

b. Mécanisme du marquage par l'ubiquitine

Les protéines marquées sont attachées covalamment un grand nombre de molécules d'ubiquitine par un système multi-enzymatique qui contient :

  • l'ubiquitin-activating enzyme (enzyme E1) : 2 enzymes E1 (au moins) ont été mises en évidence chez l'homme.
  • l'ubiquitin-conjugating enzyme (enzyme E2) : le génome des Mammifères code pour plus de 30 enzymes de conjugaison E2.
  • l'ubiquitin-ligating enzyme (enzyme E3). Il existe au moins 500 ligases E3 chez l'homme.
Le mécanisme de marquage est le suivant (figure ci-contre) :

a. Le groupement carboxyle libre de la glycine 76 C-terminale (G76) d'une molécule d'ubiquitine est activé par la cystéine (-SH) du site actif de l'enzyme E1, sous la forme d'une liaison thioester à haut potentiel énergétique. Cette étape requiert de l'énergie (hydrolyse de l'ATP).

b. Cette liaison thioester est ensuite transferée à une cystéine réactive de l'enzyme E2.

c. Finalement, le groupement carboxyle libre de G76 de l'ubiquitine est lié via une liaison amide (isopeptidique) au groupement ε-aminé de la chaîne latérale d'un résidu lysine (K) de la protéine cible à dégrader. Cette étape est catalysée par l'enzyme E3.

d. Si la protéine est déstinée à être dégradée, ce processus est répété. En effet, il faut au moins 4 molécules d'ubiquitine avant que la protéine à dégrader soit dirigée vers le protéasome 26S (voir ci-après) pour y être trés rapidement hydrolysée en peptides de 3 à 24 acides aminés.

e. L'ubiquitine est relarguée avant l'hydrolyse et est recyclée.

mecanisme de marquage des proteines a degrader par l'ubiquitine

Exemple de poly-ubiquitinylation

1 molécule d'ubiquitine est ajoutée à la protéine à dégrader via une liaison isopeptidique entre G76 de l'ubiquitine et le groupement ε-aminé de la chaîne latérale d'un résidu lysine de la protéine à dégrader (figure ci-dessous).

Puis 3 molécules d'ubiquitine sont ajoutées via le même type de liaison entre G76 de l'ubiquitine nouvellement ajoutée et K48 de la molécule d'ubiquitine précédemment ajoutée.

Exemple de poly-ubiquitinylation lysine 48 et glycine 76

Il peut cependant se former différents types de polymères de topologies variées (voir ci-dessous le devenir des chaînes marquées par l'ubiquitine).

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c. Mécanisme de reconnaissance sélective des protéines à marquer

Ce mécanisme mobilise (figure ci-dessous) :

a. Au moins 2 enzymes E1 qui activent l'ubiquitine.

b. Au moins 30 enzymes E2 : chaque enzyme E1 transfère l'ubiquitine plusieurs enzymes E2.

c. Au moins 500 enzymes E3 : dans la plupart des cas, les enzymes E2 transfèrent l'ubiquitine plusieurs enzymes E3 (quelques rares transferts sont spécifiques d'une enzyme E3).

d. Enfin, les enzymes E3 :

  • reconnaissent de manière spécifique les protéines cibles marquer
  • ou reconnaissent des groupes de protéines similaires ayant des motifs structuraux communs
  • l'inverse, certaines protéines cibles marquer sont reconnues par plusieurs enzymes E3 via des motifs structuraux distincts

mecanisme de reconnaissance selective des proteines a marquer par l'ubiquitine pour etre degradee

Source : Aaron Ciechanover (1998)

e. Il est à noter que chez certains organismes, un "facteur E4" a été mis en évidence dans cette cascade de marquage.


d. Les enzymes E3 - "Ubiquitin-protein ligases"

Il existe 3 principaux groupes d'enzymes E3 chez les eukaryotes :

α. le groupe qui contient un domaine structural appelé RING ("Really Interesting New Gene").

Le domaine RING est caractérisé par un motif de type "zinc-finger" dont la séquence consensus est : C-x(2)-C-x(9,39)-C-x(1,3)-H-x(2,3)-C-x(2)-C-x(4,48)-C-x(2)-C où x est n'importe quel acide aminé.

Les ubiquitine-ligases à domaine RING sont très conservées de la levure à l'homme.

mecanisme reconnaissance ubiquitine degradation domaine RING HECT RBR

Source : Deshaies & Joazeiro (2009)

 

β. le groupe qui contient un domaine structural appelé HECT ("Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus").

γ. le groupe qui a une architecture "RING-between-RING" (RBR). Ces enzymes E3 possèdent 2 domaines RING : l'un interagit avec une enzyme de conjuguaison E2 et l'autre possède l'activité ligase comme les enzymes E3 à domaine HECT.

mecanisme reconnaissance ubiquitine degradation domaine RING HECT RBR

Source : Rieser et al. (2013)

e. Le complexe LUBAC

LUBAC ("Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex") est un complexe protéique à activité ubiquitine ligase E3 à domaine "RING-between-RING" qui synthètise des chaînes linéaires de poly-ubiquitines.

C'est un énorme complexe d'environ 600 kDa (figure ci-contre).

mecanisme reconnaissance ubiquitine degradation domaine RING HECT RBR LUBAC

Source : Tokunaga & Iwai (2012)

Le complexe LUBAC est constitué de 3 protéines dont on n'a pas encore déterminé la stoichiométrie :

  • HOIL-1 (ou HOIL-1L ou RBCK1) : "Heme-Oxidized IRP2 ubiquitin Ligase-1" est la sous-unité catalytique de ce complexe.
  • HOIP (ou RNF31) : "HOIL-1-Interacting Protein" est la partie centrale de l'architecture globale de LUBAC.
  • SHARPIN : "SHANK-associated RH domain interacting protein" (ou SIPL1). La région C-terminale a une grande similarité de séquence la région N-terminale de HOIL-1. [SHANK : "SH3 and multiple ANKyrin repeat domain" / RH : "RBCK1 Homology"].

Le 1er domaine NZF1 ("Nuclear protein localisation 4 (Npl4)-Zinc-Finger 1") de HOIP et chacun des domaines NZF de SHARPIN et HOIL-1 sont impliqués dans la fixation à l'ubiquitine.

Les autres domaines sont impliqués dans la formation du complexe LUBAC.

HOIP (partie centrale de LUBAC) se fixe à HOIL-1 et à SHARPIN. L'interaction [HOIP/HOIL-1] et [HOIP/SHARPIN] s'effectue via un domaine structural qui mime la structure de l'ubiquitine : le domaine "UBiquitin-Like" (UBL).

UBA : "UBiquitin-Associated domain"

mecanisme reconnaissance ubiquitine degradation domaine RING HECT RBR LUBAC

Source : Rieser et al. (2013)

L'assemblage des chaînes linéaires de polyubiquitines par LUBAC a 2 caractéristiques :

  • la liaison isopeptidique n'implique pas l'une des lysines de l'ubiquitine. C'est le groupement α-aminé de la méthionine N-terminale d'une molécule d'ubiquitine qui est liée à la Gly C-terminale de la molécule d'ubiquitine suivante dans la chaîne. Ces chaînes sont appelées chaînes liées par M1 ("M1-linked chains").
  • LUBAC a la capacité de déterminer le type de chaîne d'ubiquitines qui doit être formée, une activité qui est en principe dévolue aux enzymes de conjuguaison E2 ("Ubiquitin-conjugating enzymes").

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f. Devenir des protéines selon le type de marquage par l'ubiquitine (mono- et poly-ubiquitinylation greffée ou linéaire)

Les 7 lysines de l'ubiquitine peuvent être utilisées pour le marquage. Cette multiplicité de topologies des chaînes explique en partie la diversité de signaux médiées par le marquage par l'ubiquitine : certaines protéines sont destinées à la dégradation par le protéome et d'autres à des voies de signalisation.

Le devenir du complexe [protéine marquée - molécules d'ubiquitine] dépend notamment :

  • du nombre de monomères d'ubiquitine attachés
  • de la configuration des liaisons entre les molécules d'ubiquitine : chaîne d'ubiquitines greffée ou linéaire

Protéines déstinées à la dégradation

Les chaînes constituées d'au moins 4 molécules d'ubiquitine où G76 d'une molécule d'ubiquitine est attaché à K48 de la molécule d'ubiquitine suivante (voir schéma plus haut) sont dirigées vers le protéasome 26S pour y être dégradées.

chaines constituees d'au moins quatre molecules d'ubiquitine

Protéines déstinées à des voies de signalisation

α. Les protéines mono-ubiquitinylées (fixation d'une molécule d'ubiquitine sur un résidu de la protéine à dégrader) ou multi-mono-ubiquitinylées (fixation d'une molécule d'ubiquitine sur plusieurs résidus de la protéine à dégrader) ne sont pas destinées la dégradation par le protéasome 26S.

Exemples :

  • traffic membranaire
  • modifications des histones H2B : régulation de la transcription
  • modifications des histones H2A : inactivation du chromosome X

β. Les protéines sur lesquelles s'est fixée une courte chaîne de molécules d'ubiquitine liées entre elles par K6 ou par K63 ne sont pas destinées à la dégradation par le protéasome 26S.

Exemples :

  • réparation de l'ADN
  • réponse inflammatoire
  • signalisation cellulaire (transduction du signal via l'activation de kinases)

γ. Illustration de 2 voies d'activation du facteur NF-κB ("Nuclear Factor-κB")

NF-κB est un facteur de transcription activé par de nombreux stimuli tels que les infections virales ou fongiques, les agents pathogènes bactériens, les cytokines proinflammatoires, les agents génotoxiques, les rayons ultraviolet ou le stress oxidatif.

La voie classique (figure ci-contre) est activée par des cytokines inflammatoires comme TNF-α : le résultat est l'activation du complexe IKK (IKKα, IKKβ et NEMO).

Le complexe IKK phosphoryle IκBα, entraînant son marquage par l'ubiquitine et sa dégradation par le protéasome : NF-κB est ainsi libéré.

NF-κB est constitué de p50 et p65 qui sont transloqués dans le noyau où ils activent l'expression de nombreux gènes.

mecanisme reconnaissance ubiquitine degradation domaine RING HECT RBR

Source : Tokunaga & Iwai (2012)

La voie non-classique implique l'activation du dimère IKKα qui phosphoryle p100. p100 est alors maturé en p52 par la voie [ubiquitine / protéasome].

Le facteur NF-κB activé par cette voie non-classique est constitué de p52 et RelB qui sont également transloqués dans le noyau.

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3. Les enzymes de désubiquitinylation

Il existe des dizaines d'enzymes qui catalysent la désubiquitinylation ("DeUBiquitinating enzymes" - DUB).

On recence au moins six groupes de DUB :

  • Ubiquitin C-terminal hydrolases (UCH)
  • Ubiquitin-specific processing proteases (UBP or USP)
  • Jab1/Pad1/MPN-domain-containing metallo enzymes (JAMM)
  • Otu-domain ubiquitin-aldehyde-binding proteins (Otubain)
  • Ataxin-3/Josephin
  • ubiquitin-like proteases (ULP)

Ce sont d'importants régulateurs du système ubiquitine - protéasome.

Ces enzymes :

  • activent les précurseurs d'ubiquitine.
  • vérifient les complexes [protéine dégrader - molécules d'ubiquitine] (activité "proofreading") en enlevant les molécules d'ubiquitine et en vérifiant que la protéine est bien destinée tre dégradée.
  • débarrassent le protéasome 26S (voir ci-dessous) de toute chaîne de (poly)ubiquitine qui inhiberait le processus de dégradation. En effet, ces molécules "libres" d'ubiquitine seraient en compétition pour les sites de fixation de l'ubiquitine avec les complexes entrant [protéine dégrader - molécules d'ubiquitine].

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4. Le protéasome 26S

Les protéasomes sont des complexes protéiques que l'on trouve chez tous les Eucaryotes et les Archées et chez certaines bactéries. Chez les Eucaryotes, les protéasomes sont situés dans le noyau et dans le cytoplasme.

Le protéasome 26S est la forme la plus fréquente du protéasome.

Le protéasome 26S est tellement volumineux (environ 3000 kDa) qu'il s'apparente davantage une particule qu' une molécule. C'est la raison pour laquelle on le désigne par le symbole "S" ou Svedberg, l'unité du coefficient de sédimentation.

Le protéasome 26S est un énorme complexe multi-enzymatique constitué de nombreuses sous-unités.

Il résulte de l'assemblage du protéasome 20S et du protéasome 19S qui met en jeu de l'énergie via l'ATP.

Le proteasome 26S resulte de l'assemblage du proteasome 20S et du proteasome 19S

Source : Julian Adams (2004)

5. Le protéasome 20S

Le protéasome 20S est le coeur protéolytique du protéasome 26S (figure ci-dessous).

Le protéasome 20S est composé de 28 sous-unités arrangées en 4 anneaux heptamériques empilés (α7, β7, β'7, α'7) et l'ensemble adopte une structure cylindrique.

Le protéasome 20S est pourvu de multiples activités peptidases et en constitue la machinerie catalytique. Cette forme fermée en tonneau délimite une cavité interne constituée de 3 compartiments. Ils contiennent les sites actifs qui hydrolysent les liaisons peptidiques des protéines à dégrader (activité protéolytique).

Ces sites actifs sont donc confinés à l'intérieur du protéasome 20S et isolés de l'environnement cellulaire. Ainsi, les protéines de la cellule qui ne doivent pas être dégradées sont protégées d'une dégradation inopportune.

proteasome 20S coeur proteolytique du proteasome 26S

Source : Groll et al.

L'accès des protéines à dégrader au site actif de ce complexe est sous le contrôle des sous-unités α qui ne permettent l'accès qu'aux polypeptides qui ont été préalablement dépliés (voir le protéasome 19S).

Les sous-unités β1, β2 et β5 possèdent l'activité protéolytique et elles hydrolysent la liaison peptidique de manières spécifiques :

  • après des résidus acides dans le cas de β1 : spécificité identique à la caspase - Glu, Asp en position P1 de la liaison peptidique hydrolysée
  • après des résidus basiques dans le cas de β2 : spécificité identique à la trypsine - Arg ou Lys en position P1
  • après des résidus hydrophobes dans le cas de β5 : spécificité identique à la chymotrypsine - Tyr ou Phe en position P1

Les sous-unités β1, β2 et β5 sont synthétisées sous forme de précurseurs activés après protéolyse d'un peptide N-terminal. Ces hydrolases constituent une famille unique de protéase à thréonine.

Les sous-unités β3, β4, β6 et β7 n'ont pas d'activité protéolytique.

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6. Le protéasome 19S

Le protéasome 19S est aussi appelé PA700 ("proteasome activator MW 700") ou "regulatory complex".

Il constitue une coiffe aux extrémités du protéasome 20S en flanquant l'une ou les deux extrémités du protéasome 20S. Il stimule ainsi la dégradation des protéines.

Si la structure du protéasome 20S est connue, celle du protéasome 19S ne l'est pas encore complètement. En effet, les différentes sous-unités du protéasome 19S ont tendance à se dissocier lors des tentatives de purification.

C'est par des approches conjuguées de cristallographie, d'interactions protéine-protéine (double-hybride et réseaux d'interactions) et de cryo-microscopie électronique qu'actuellement on tente de reconstituer l'ensemble de la structure du protéasome 19S.

C'est un complexe constitué d'au moins 19 sous-unités différentes (700 kDa), dont 6 sous-unités qui ont une activité ATPasique (hydrolyse de l'ATP).

Les sous-unités ATPasiques ont un domaine de fixation de l'ATP d'environ 250 à 300 acides aminés.

Ces 6 sous-unités forment un anneau hexamérique qui interagit avec le protéasome 20S.

Source : Sullivan et al. (2003)

Le proteasome 19S ou PA700 ou proteasome activator MW 700

Les rôles du protéasome 19S sont (figure ci-dessous) :

1. La reconnaissance et la fixation de la protéine qui doit tre dégradée.

2. L'élimination des molécules d'ubiquitine (qui sont recyclées) par les sous-unités isopeptidases. Il existe deux classes d'isopeptidases : les "ubiquitin C-terminal hydrolases" (UCH) et les "ubiquitin-specific proteases" (UBP).

3. Le dépliement de la chaîne polypeptidique de la protéine qui doit tre dégradée car le diamètre (1 nm) du "conduit d'entrée" au protéasome 20S et le diamètre de la cavité interne (5 nm) ne permettent pas au protéasome 20S d'encapsuler des protéines repliées : les 6 sous-unités ATPases du protéasome 19S catalysent le dépliement grâce l'énergie produite par l'hydrolyse de l'ATP.

4. L'activation du protéasome : ces ATPases sont également responsables de l'ouverture de la "barrière" qui ferme l'entrée du protéasome 20S et de l'injection des protéines dépliées dans la cavité protéolytique.

Les roles du proteasome 19S

Source : Sullivan et al. (2003)

Pour ce dernier rôle, le protéasome 19S est aussi appelé "Proteasome Activator" (ou PA700).

7. Autres activateurs du protéasome 20S

Il existe d'autre formes qui activent le protéasome 20S mais qui ne fixe pas les protéines ubiquitinylées :

  • le protéasome 11 S ou PA28 (PA26 chez Trypanosoma brucei) constitué de 7 sous-unités identiques ou non de de 28 kDa.
  • le protéasome PA200 constitué d'une seule chaîne polypeptidique de 200 kDa.

Autres activateurs du proteasome 20S

Complexe proteasome 20 s et PA26

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8. Les machineries protéolytiques de la famille [AAA / ATPase]

La famille AAA maintenant appelée AAA+ (ATPases Associée à diverses Activités cellulaires - "ATPases Associated with diverse cellular Activities" - Kunau et al., 1993) est un groupe important d'ATPases présent dans tous les règnes du vivant.

La famille AAA+ est inclue dans la superfamille des NTPases (NTP : nucléosides triphosphates) à boucle P en forme d'anneau (certaines ne possédant pas le domaine SRH).

  • Interpro : "P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase" - IPR027417
  • PFAM : Family AAA (PF00004)

Il y a six clades majeurs dans la famille des protéines à domaines AAA+ : les sous-unités du protéasome, des métalloprotéases, les domaines D1 et D2 des ATPases à 2 domaines AAA, le groupe [MSP1 / katanine / spastine] et BCS1 et ses homologues.

Exemples de rôles biologiques des protéines [AAA / ATPases]

  • Dans tous les organismes, les protéines [AAA / ATPases] sont impliquées dans les processus de dégradation des protéines et de réplication de l'ADN.
  • L'activité de dépliement de la chaîne polypeptidique qui se déroule dans les machineries AAA+ peut également être utilisée pour remodeler les complexes macromoléculaires et re-solubiliser les agrégats protéiques ou de polynucléotides.
  • Chez les Eucaryotes, les protéines [AAA / ATPases] participent aussi à la fusion des membranes, la biogénèse des peroxisomes, la transduction du signal et la régulation de la transcription des gènes.
  • Les dynéines constituent l'une des 3 principales classes de protéines motrices : ce sont des protéines AAA+ qui couplent leur activité ATPase à un mouvement moléculaire le long des microtubules.
  • Chez les bactéries, les champignons et les plantes, les protéines [AAA / ATPases] sont impliquées dans la thermo-tolérance.
  • L'AAA-ATPase NSF ("N-ethylmaleimide-Sensitive Factor") est impliquée dans le désassemblage des complexes SNARE responsable de la fusion des membranes lors du tafic vésiculaire.

Les protéines AAA+ p97 (aussi appelées Cdc48) sont parmi les mieux étudiées.

Les protéines sécrétées mal repliées sont exportées depuis le réticulum endoplasmique (RE) puis dégradées par la voie de dégradation associée au RE (voie ERAD).

Les protéines membranaires ou luminales non fonctionnelles sont extraites du RE puis dégradées dans le cytosol par les protéasomes.

L'extraction et la rétro-translocation de ces protéines est assistée par le complexe [Cdc48p(Ufd1p/Npl4p)] du côté cytosolique de la membrane.

Une fois dans le cytosol, ces protéines sont ubiquitinylées avant dégradation par le protéasome 26S.

cdc48 AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

Source : Eisele et al. (2010)

Les machineries protéolytiques de la famille AAA+ (ClpXP, ClpAP, ClpCP, HslUV, Lon, FtsH, PAN/20 s et le protéasome 26S) assurent un contrôle qualité des protéines et sont des circuits de régulation de toutes les cellules.

AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

Mécanisme de base d'une protéine [AAA / ATPase]

Les machineries protéolytiques de la famille AAA+ sont constituées :

  • d'un compartiment qui contient des protéases, compartiment où leurs sites actifs sont séquestrés dans une chambre intérieure
  • d'un anneau hexamérique d'ATPases AAA+

Source : Sauer & Baker (2011)

AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

Une étiquette de dégradation (appelé "degron") sur une chaîne polypeptidique est reconnue par l'hexamére AAA+ de dépliement ("unfoldase"). Les substrats protéiques sont attachés à l'anneau, soit directement soit par l'intermédiaire de protéines adaptatrices.

Une région non structurée de la chaîne polypeptidique du substrat protéique est engagée dans le pore axial de l'anneau AAA+ et plusieurs cycles de [fixation / hydrolyse] de l'ATP induisent des changements conformationnels qui créent des impulsions de traction.

La chaîne polypeptidique est dénaturée et ces tractions déplacent le polypeptide déplié au travers du pore dans la chambre de dégradation par les peptidases associées.

Structures quaternaires des protéines [AAA/ATPases]

Les ATPases de la famille AAA+ sont caractérisées par 1 ou 2 domaine(s) conservé(s) de fixation de l'ATP d'un type appelé motif AAA.

Le domaine AAA+ contient 2 sous-domaines :

  • un domaine [α/β] N-terminal qui fixe (via un pli Rossman) et hydrolyse des nucléotides. Ce domaine de 200 à 250 acides aminés contient des motifs Walker A [GXXXXGK(T/S)] et Walker B (HyDE) et un domaine SRH ("Second Region of Homology") situé en position C-terminale du motif Walker B. Ce domaine est commun aux membres de la super famille des NTPases à boucle P.
  • un domaine C-terminal riche en hélice α

La plupart des protéines AAA+ possèdent des domaines supplémentaires utilisés pour l'oligomérisation, la fixation du substrat ou la régulation.

Certaines classes de protéines AAA+ ont un domaine N-terminal non-ATPase suivi par 1 ou 2 domaine(s) AAA (D1 et D2 - exemple : Cdc48/p97).

Figure ci-contre : structures des domaines des sous-unités qui forment les sous-familles de protéases FtsH, Lon (sous-familles de LonA et LonB), HslUV, ClpXP, ClpAP, ClpCP et [PAN ("Proteasome-Activating Nucleotidase") / 20S].

Chaque sous-famille contient au moins un "module AAA+" qui se compose d'un petit et d'un grand domaines AAA+ (ClpA et ClpC contiennent 2 "module AAA+").

Les domaines à activité protéase sont liés au "module AAA+" chez Lon et FtsH mais constituent des complexes oligomèriques distincts pour les autres sous-familles.

Chaque groupe de protéases AAA+ contient au moins un domaine auxiliaire spécifique de sa sous-famille, qui sert souvent de site d'ancrage du substrat protéique ou d'adaptateur.

AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

Source : Sauer & Baker (2011)

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9. La protéase ATP-dépendante bactérienne ClpXP

Le protéasome 26S est la seule protéase ATP-dépendante soluble dans le cytosol chez les Eucaryotes.

En revanche, les bactéries possèdent plusieurs protéases ATP-dépendantes comme ClpXP, HslUV et les eubactéries possèdent le système [protéasome - ARC / Mpa] ("AAA ATPase forming Ring-shaped Complexes / Mycobacterial proteasomal ATPase").

Figure ci-contre : comparaison de différentes classes de protéases ATP-dépendantes.

(A) Le protéasome 26S des Eucaryotes composé du protéasome 20S flanquée des sous-unités régulatrices du protéasome 19S.

(B) La protéase bactérienne ClpXP, composée de la protéase ClpP (anneaux en vert foncé) et du moteur [AAA+ / ATPase] ClpX (en rouge). ClpX reconnaît le signal de dégradation (exemple : la séquence peptidique ssrA en vert) qui sert également de site pour l'initiation de la dégradation.

Source : Kraut & Matouschek (2010)

pupylation AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

(C) Le protéasome actino-bactérien, composé d'une particule noyau 20S semblable à celle du protéasome 26S et d'un seul anneau ATPase Mpa (en violet).

Mpa se fixe à la chaîne polypeptidique substrat via une modification covalente : la pupylation ("PUP" en vert clair). La protéine "PUP" contient une région N-terminale non structurée qui sert de site d'initiation de la dégradation.

La pupylation : la Gln C-terminale de protéines (intrinsèquement non structurée) de procaryotes ressemblant à l'ubiquitine (PUP : "Prokaryotic Ubiquitin-like Protein") est désamidée en Glu puis fixée aux protéines destinées à la dégradation.

La protéase ClpXP de Escherichia coli dégrade les protéines portant l'étiquette ssrA qui possède la séquence AANDENYALAA-COOH.

Le dipeptide C-terminal et le groupement carboxyle sont reconnus par le pore ClpX, tandis que les résidus N-terminaux de cette séquence se fixent à SspB, une protéine adaptatrice qui lie également ClpX.

Les contacts "degron-pore", "degron-adaptateur" et "adaptateur-protéase" contribuent tous à la reconnaissance de ClpXP et à la dégradation des protéines portant l'étiquette ssrA.

Source : McGinness et al. (2006)

AAA ATPase ClpXP unfoldase protease proteasome 19S

 

10. Liens Internet et références bibliographiques

"Ubiquitin : molecule of the month" - Protein Data Bank

Excellent site de ressources pédagogiques - Université de Bordeaux : "Ribosomes et protéasomes : la synthèse et la dégradation des protéines"

Cours en ligne : "La voie de dégradation ubiquitine dépendante" - Université Jussieu

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