Les protéases
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1. Généralités

2. Principales sources de protéases

3. Classification des protéases

a. Classification selon l'Enzyme Commission (EC)

b. Classification selon les [homologies / similarités] de [séquences / structures] & quelques bases de données

c. Classification des protéases du point du mécanisme catalytique

4. Le site de fixation du polypeptide substrat des protéases à sérine

5. Les zymogènes : précurseur des protéases

6. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

a. Formation d'un acyl-enzyme - "burst"

b. Formalisme cinétique

 

c. Le mécanisme "Ping Pong"

d. Synthèse peptidique par les protéases

7. Les protéases intramembranaires

8. Les protéases intramembranaires des protéines prénylées à motif CAAX

a. La protéase Ste24p

b. La protéase Rce1 ("Ras and a-factor converting enzyme 1")

9. Les protéasomes 26S, 19S et 20S

10. Les machineries protéolytiques de la famille [AAA+ / ATPase]

11. La protéase ATP-dépendante bactérienne ClpXP

12. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Généralités

Les protéases sont les enzymes qui hydrolysent la liaison peptidique établie entre 2 acides aminés d'une chaîne polypeptidique (peptides et protéines).

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis biochimej

Autres appellations des protéases : peptidases, protéinases ou enzymes protéolytiques.

On conçoit la particularité de ces enzymes puisque leurs substrats sont des macromolécules biologiques de même nature.

Rappel de certaines caractéristiques des protéines :

  • il existe une grande dynamique de la synthèse des protéines : le rapport entre les protéines les moins abondantes et les plus abondantes dans une cellule dépasse 106 pour atteindre 1012 dans le sérum.
  • les protéines ont des demi-vies trés variables : ornithine décarboxylase 11 min - tryptophanne oxygénase 2 h - myosine 30 j.
  • 20 acides aminés sont principalement utilisés dans la composition des protéines. Cependant, on en a recensé près de 340 : hydroxyproline (collagène), hypusine, β-acides aminés (isoserine), γ-acides aminés (statine), ω-acides aminés (ε-acide aminocaproique, 11-acid amino-undécaoïque), citrulline, isovaline, pseudoleucine, desmosine, norvaline, diéthylglycine, ...
  • chaque acide aminé possède une chaîne latérale avec des propriétés physico - chimiques particulières (charge, volume, hydrophobicité, hydrophilicité, ...)
  • Le pourcentage des acides aminés dans les chaînes polypeptidiques est très variable :

acide amine amino acid percentahe protein protease biochimej

Source : Uniprot

  • les protéines peuvent contenir de quelques dizaines d'acides aminés (les toxines) à quelques milliers comme la calossine ! Les protéines ont donc des masses molaires de quelques kDa à quelques centaines de kDa.
  • (presque) toutes les combinaisons d'enchaînement de ces acides aminés sont possibles en théorie (mais loin d'être toutes "sélectionnées" par la nature)
  • les protéines sont sous forme de monomère (une chaîne polypeptidique) ou de polymères (plusieurs chaînes polypeptidiques identiques ou non). Ces structures quaternaires peuvent contenir des dizaines de sous-unités (pyruvate déshydrogénase).
  • le rayon moyen d'une protéine repliée (assimilée à une sphère dans le cas des protéines dites globulaires) est d'environ 40 Å. Cependant, les protéines peuvent être très allongées (collagène) ou adopter des structures tri-dimensionnelles très particulières comme la calmoduline.

Les protéases sont étudiées depuis des décennies :

  • les premiers clichés de diffraction des rayons X d'une protéine globulaire sont ceux de la pepsine et les protéases ou leurs inhibiteurs ont été 5 des 12 premières structures tridimensionnelles déposées dans la PDB
  • les protéases sont des cibles majeures de médicaments et des enzymes "archétypale" pour l'enseignement de l'enzymologie
  • les protéases sont des outils majeurs en biologie moléculaire

Les protéases sont classées en 6 groupes : aspartate-, cystéine-, glutamate-, métallo-, sérine- et thréonine-protéases. Elles constituent l'une des plus vastes familles d'enzymes et on estime que 2% des gènes du génome humain codent des protéases (soit environ 550 gènes) :

  • 191 gènes : métallo-protéases
  • 178 gènes : protéases à sérine
  • 161 gènes : protéases à cystéine
  • 27 gènes : protéases à thréonine
  • 21 gènes : protéases à acide aspartique

Caractérisées par une grande diversité structurale et fonctionnelle, les protéases assument une très vaste gamme de fonctions cellulaires qui vont du recyclage des protéines intracellulaires à la digestion des nutriements, en passant par l'amplification de cascades au sein du système immunitaire.

Exemples et application :

  • La trypsine est l'une des protéases digestives les plus importantes chez la plupart des vertébrés. Elle est biosynthétisée dans les cellules acineuses du pancréas et est libérée par le canal pancréatique dans le tractus gastro-intestinal. Après activation par l'entérokinase ou par autocatalyse, elle hydrolyse (avec la chymotrypsine et l'élastase) les protéines alimentaires en peptides. Les peptides qui en résultent sont à leur tour hydrolysés par diverses exopeptidases et les petits fragments gastro-duodénaux sont ensuite absorbés par l'intestin.
  • La trypsine peut aussi activer le récepteur de l'insuline par protéolyse limitée de son domaine extracellulaire et ainsi provoquer une réaction semblable à celle induite par l'insuline, en absence d'insuline.
  • La trypsine peut également servir de molécule de signalisation indirecte en hydrolysant et donc en activant les récepteurs activés par la protéinase ("proteinase-activated receptors" - PARs). PARs est une famille de récepteurs couplés aux protéines G qui sont activés par différentes protéases : PAR-2 est activé par la trypsine ou la tryptase des mastocytes / PAR-1 et PAR-3 sont activés par la thrombine.
  • La désumoylation des protéines est catalysée par des protéases SUMO qui ont donc un rôle important dans divers mécanismes cellulaires allant de la transcription et la division cellulaire à la biogénèse des ribosomes.
  • La trypsine est actuellement la protéase la plus fréquemment utilisée en protéomique du fait de sa spécificité d'hydrolyse stricte : elle hydrolyse la liaison peptidique du côté C-terminal de l'arginine et de la lysine. Dans les protéines humaines, cette hydrolyse se traduit par une moyenne de 61 peptides. Les peptides sont composés de 1 à 2374 acides aminés (moyenne : 9 acides aminés / écart type : 15 acides aminés). La taille moyenne des peptides générés et la présence d'un acide aminé basique en position C-terminale de ces peptides (qui améliore leur ionisation positive), sont 2 paramètres très favorables à l'emploi de la trypsine pour l'analyse de ces peptides en spectromètrie de masse.

Les protéases se distinguent notablement par certaines de leurs propriétés :

  • certaines sont des petites protéines (20 à 30 kDa) et composées essentiellement du domaine catalytique seul (exemple : les cathepsines à cystéine
  • certaines peuvent être des complexes protéiques énormes à plusieurs domaines (exemples : le protéasome et la tripeptidyl peptidase I)
  • la spécificité des protéases peut être hautement sélective (exemples : les protéases de la cascade de coagulation de sang qui activent la protéine qui suit dans la cascade ou les caspases et la granzyme B - hydrolyse après Asp)
  • à l'inverse, certaines protéases sont très peu spécifiques (exemples : les cathepsines et le protéasome, la plupart des exopeptidases)

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Recherche de médicaments axés sur les protéases

On estime que 5 à 10 % de toutes les cibles pharmaceutiques des médicaments en cours de développement sont des protéases.

  • Les inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine humaine (EC 3.4.15.1) comme le captopril, ont servi depuis de nombreuses années dans le traitement des troubles cardiovasculaires, l'hypertension et l'insuffisance cardiaque. Les ventes mondiales des antihypertenseurs qui agissent sur les protéases du système rénine-angiotensine représentent plus de 6 milliards $.
  • Les inhibiteurs de la protéase du VIH (ritonavir, atazananvir et tipranavir) ont eu un rôle clé dans le traitement de l'infection par le VIH depuis leur emploi dans les années 1990.
  • Les ventes mondiales actuelles d'inhibiteurs de protéases telles que le facteur Xa et la thrombine représentent environ 1 milliard $ ont atteint 3,5 milliards $ en 2014.

Le contrôle qualité du bon repliement des protéines

Le réseau de contrôle de la qualité des protéines utilise des protéines chaperonnes qui aident des protéines à se replier dans leur conformation native, ou préviennent un mauvais repliement ou "réactivent" des protéines mal repliées et agrégées.

protease membrane controle qualite quality proteasome lysosome chaperon proteolysis biochimej

Les chaînes polypeptidiques biosynthétisées se replient dans leur structure native de manière co-traductionnelle avec ou sans aide de protéines chaperonnes (1).

Cependant, une fraction des chaînes polypeptidiques peuvent être libérées des ribosomes dans une conformation non native (2). Certaines d'entre elles adoptent alors leur conformation native spontanément ou à l'aide de protéines chaperonnes (3).

D'autres n'adoptent pas la conformation native et s'agrègent (5). Des conditions de stress cellulaire (choc thermique, stress oxydatif, certaines pathologies, ...) peuvent induire une dénaturation de protéines correctement repliées (4) qui peuvent également s'agréger et devenir inactives. Ce processus peut être réversé par des protéines chaperonnes (6, 3).

Chez les Eucaryotes, les Archées et certaines bactéries, il existe un processus hautement sélectif et régulé qui se déroule dans le noyau et le cytoplasme et qui nécessite de l'énergie (hydrolyse de l'ATP) : il s'agit du système protéolytique ubiquitine-protéasome (7).

Des systèmes protéolytiques chez les bactéries ou dans certains compartiments des Eucaryotes (lysosome, peroxysome, mitochondrie, ...) hydrolysent les protéines mal repliées, des protéines membranaires, des protéines extracellulaires et des protéines caractérisées par de trés longs temps de demi-vie (8).

Exemple : les protéases Lon (EC = 3.4.21.53 - MEROPS : famille S16 - clan SJ) sont des protéases à sérine ATP-dépendantes qui hydrolysent sélectivement les protéines anormales ou mutées (mal repliées) et certaines protéines régulatrices à demi-vie courte.

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2. Principales sources de protéases

Actuellement, le marché mondial des ventes d'enzymes industrielles est supérieur à 3 milliards de dollars et les protéases représentent environ 60 % des ventes totales.

Protéases animales : les protéases d'origine animale les plus familières sont la chymotrypsine, la trypsine pancréatique, l'élastase, la pepsine, la rennine.

  • La trypsine est la principale enzyme digestive de l'intestin responsable de l'hydrolyse des protéines alimentaires.
  • La chymotrypsine est préparée à partir d'extraits pancréatiques d'animaux : sa préparation à l'état pur est coûteuse et elle est utilisée principalement dans les applications de diagnostiques et d'analyses.
  • La pepsine est une protéase acide que l'on trouve dans l'estomac de presque tous les vertébrés.
  • La présure est une protéase similaire à la pepsine. Elle est biosynthétisée sous forme de précurseur inactif dans l'estomac de beaucoup de mammifères. Elle est convertie en rennine active par l'action de la pepsine. Elle est largement utilisée dans l'industrie laitière pour produire le caillé stable avec une bonne saveur.

Protéases de plantes : papaïne, bromélaine, kératinases et ficine sont certaines des protéases les plus connues. Leurs productions à partir de sources végétales est un processus chronophage. D'autant plus que la concentration des protéases dans les tissus est généralement basse.

  • La papaïne est (active entre pH 5 et 9) est extraite du latex des fruits de la papaye Carica.
  • La bromélaine est préparée à partir des tiges et du jus d'ananas.

Protéases microbiennes : la communauté microbienne est privilégiée par rapport aux animaux et aux plantes pour la production de protéases à grande échelle, en raison de leur croissance rapide et de la simplicité de leur cycle de vie pour la génération de nouvelles enzymes recombinantes avec des propriétés modifiées. Les protéases microbiennes représentent les 2/3 de la production commerciale de protéases et jouent un rôle capital dans les détergents, l'industrie pharmaceutique, l'industrie agricole et du cuir.

Les protéases alcalines sont le groupe majeur des protéases produites par les bactéries, les champignons, les levures et les actinomycètes.

Protéases fongiques : on leur porte un intérêt croissant en raison de la forte diversité et spécificité de substrat et de leur stabilité dans des conditions extrêmes. Elle présentent l'avantage d'être purifiées du mycélium par simple filtration. Les protéases fongiques peuvent être produites par processus de fermentation à l'état solide. Les protéases fongiques sont également utilisés en permettant de modifier les protéines alimentaires.

Protéases alcalines bactériennes : elles ont une grande importance commerciale dans les industries de blanchisserie, alimentaires, du cuir et de la soie en raison de leur forte production et de leur forte activité à pH alcalin (pH 8 à pH 12), avec une température optimale entre 50°C et 70°C. Ces propriétés expliquent leur utilisation dans l'industrie des détergents.

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3. Classification des protéases

a. Classification selon l'Enzyme Commission (EC)

La classification établie par la commission des enzymes de l'Union Internationale de Biochimie et de Biologie Moléculaire (sigle anglais "IUBMB") a été établie sur des critères de spécificité.

La nomenclature des enzymes s'écrit de manière générale sous la forme : E.C. X.X.X.X.

La liste de toutes les enzymes, leur nomenclature et leur identifiant EC est décrite à : Enzyme Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions


Le premier "X" correspond aux 6 types de réactions catalysées par les enzymes. 1er X Réaction catalysée exemple de coenzyme impliqué
X = 1 : oxydoréductases (E. C. 1.X.X.X) oxydoréduction NAD(P)+
X = 2 : transférases (E. C. 2.X.X.X) transfert de groupes phosphate de pyridoxal
X = 3 : hydrolases (E. C. 3.X.X.X) hydrolyse aucun
X = 4 : lyases (E. C. 4.X.X.X) addition de groupe à des atomes engagés dans des doubles liaisons pyrophosphate de thiamine
X = 5 : isomérases (E. C. 5.X.X.X) isomérisation (de position de groupe ou de fonction) phosphate de pyridoxal
X = 6 : ligases (E. C. 6.X.X.X) condensation de deux molécules ATP
Remarque : dans les banques de données, on trouve une catégorie "Autres" ; exemples : kinases, phosphoprotéines, "Mutator transposons".

Exemples d'hydrolases agissant sur la liaison peptidique
Les liens renvoient vers le descriptif détaillé de chaque protéase (fichiers EXPASY)
EC 3.4.11 - Aminopeptidases EC 3.4.13 - Dipeptidases EC 3.4.14 - Dipeptidyl-peptidases et tripeptidyl-peptidases EC 3.4.15 - Peptidyl-dipeptidases
3.4.11.1 Leucyl aminopeptidase
3.4.11.2 Membrane alanyl aminopeptidase
3.4.11.3 Cystinyl aminopeptidase
3.4.11.4 Tripeptide aminopeptidase
3.4.11.5 Prolyl aminopeptidase
3.4.11.6 Aminopeptidase B
3.4.11.7 Glutamyl aminopeptidase
3.4.11.9 Xaa-Pro aminopeptidase
3.4.11.10 Bacterial leucyl aminopeptidase
3.4.11.13 Clostridial aminopeptidase
3.4.11.14 Cytosol alanyl aminopeptidase
3.4.11.15 Aminopeptidase Y
3.4.11.16 Xaa-Trp aminopeptidase
3.4.11.17 Tryptophanyl aminopeptidase
3.4.11.18 Methionyl aminopeptidase
3.4.11.19 D-stereospecific aminopeptidase
3.4.11.20 Aminopeptidase Ey
3.4.11.21 Aspartyl aminopeptidase
3.4.11.22 Aminopeptidase I
3.4.11.23 PepB aminopeptidase
3.4.11.24 Aminopeptidase S
3.4.11.25 Beta-peptidyl aminopeptidase
3.4.11.26 Intermediate cleaving peptidase 55
3.4.13.4 Xaa-Arg dipeptidase
3.4.13.5 Xaa-methyl-His dipeptidase
3.4.13.7 Glu-Glu dipeptidase
3.4.13.9 Xaa-Pro dipeptidase
3.4.13.12 Met-Xaa dipeptidase
3.4.13.17 Non-stereospecific dipeptidase
3.4.13.18 Cytosol nonspecific dipeptidase
3.4.13.19 Membrane dipeptidase
3.4.13.20 Beta-Ala-His dipeptidase
3.4.13.21 Dipeptidase E
3.4.13.22 D-Ala-D-Ala dipeptidase
3.4.14.1 Dipeptidyl-peptidase I
3.4.14.2 Dipeptidyl-peptidase II
3.4.14.4 Dipeptidyl-peptidase III
3.4.14.5 Dipeptidyl-peptidase IV
3.4.14.6 Dipeptidyl-dipeptidase
3.4.14.9 Tripeptidyl-peptidase I
3.4.14.10 Tripeptidyl-peptidase II
3.4.14.11 Xaa-Pro dipeptidyl-peptidase
3.4.14.12 Xaa-Xaa-Pro tripeptidyl-peptidase
3.4.15.1 Peptidyl-dipeptidase A
3.4.15.4 Peptidyl-dipeptidase B
3.4.15.5 Peptidyl-dipeptidase Dcp
3.4.15.6 Cyanophycinase
EC 3.4.16 - Serine-type carboxypeptidases EC 3.4.17 - Métallo-carboxypeptidases EC 3.4.18 - Cysteine-type carboxypeptidase EC 3.4.19 - peptidases oméga
3.4.16.2 Lysosomal Pro-Xaa carboxypeptidase.
3.4.16.4 Serine-type D-Ala-D-Ala carboxypeptidase
3.4.16.5 Carboxypeptidase C
3.4.16.6 Carboxypeptidase D
3.4.17.1 Carboxypeptidase A
3.4.17.2 Carboxypeptidase B
3.4.17.3 Lysine carboxypeptidase
3.4.17.4 Gly-Xaa carboxypeptidase
3.4.17.6 Alanine carboxypeptidase
3.4.17.8 Muramoylpentapeptide carboxypeptidase.
3.4.17.10 Carboxypeptidase E
3.4.17.11 Glutamate carboxypeptidase
3.4.17.12 Carboxypeptidase M
3.4.17.13 Muramoyltetrapeptide carboxypeptidase
3.4.17.14 Zinc D-Ala-D-Ala carboxypeptidase
3.4.17.15 Carboxypeptidase A2
3.4.17.16 Membrane Pro-Xaa carboxypeptidase
3.4.17.17 Tubulinyl-Tyr carboxypeptidase
3.4.17.18 Carboxypeptidase T
3.4.17.19 Carboxypeptidase Taq
3.4.17.20 Carboxypeptidase U
3.4.17.21 Glutamate carboxypeptidase II
3.4.17.22 Metallocarboxypeptidase D
3.4.17.23 Angiotensin-converting enzyme 2
3.4.18.1 Cathepsine X 3.4.19.1 Acylaminoacyl-peptidase
3.4.19.2 Peptidyl-glycinamidase
3.4.19.3 Pyroglutamyl-peptidase I
3.4.19.5 Beta-aspartyl-peptidase
3.4.19.6 Pyroglutamyl-peptidase II
3.4.19.7 N-formylmethionyl-peptidase
3.4.19.9 Gamma-glutamyl hydrolase
3.4.19.11 Gamma-D-glutamyl-meso-diaminopimelate peptidase
3.4.19.12 Ubiquitinyl hydrolase 1
3.4.19.13 Glutathione hydrolase
3.4.19.14 Leukotriene-C(4) hydrolase
EC 3.4.21 - endopeptidases à sérine EC 3.4.22 - endopeptidases à cysteine EC 3.4.23 - endopeptidases à acide aspartique EC 3.4.24 - Métallo-endopeptidases
3.4.21.1 Chymotrypsine
3.4.21.3 Metridine
3.4.21.4 Trypsine
3.4.21.5 Thrombine
3.4.21.6 Facteur de coagulation
3.4.21.7 Plasmine
3.4.21.10 Acrosine
3.4.21.12 Alpha-lytic endopeptidase
3.4.21.20 Cathepsine
3.4.21.25 Cucumisine
3.4.21.26 Prolyl oligopeptidase
3.4.21.32 Brachyurine
3.4.21.34 Kallikreine
3.4.21.36 Elastase pancréatique
3.4.21.39 Chymase
3.4.21.45 Complement factor
3.4.21.48 Cerevisine
3.4.21.49 Hypodermine
3.4.21.50 Lysyl endopeptidase
3.4.21.61 Kexine
3.4.21.62 Subtilisine
3.4.21.64 Peptidase K
3.4.21.65 Thermomycoline
3.4.21.69 Protein C
3.4.21.75 Furine
3.4.21.79 Granzyme
3.4.21.80 Streptogrisine
3.4.21.82 Glutamyl endopeptidase II
3.4.21.90 Togavirine
3.4.21.91 Flavivirine
3.4.21.96 Lactocepine
3.4.21.97 Assembline
3.4.21.98 Hepacivirine
3.4.21.99 Spermosine
3.4.21.100 Sedolisine
3.4.21.101 Xanthomonalisine
3.4.21.102 C-terminal processing peptidase
3.4.21.105 Rhomboid protease
3.4.21.106 Hepsine
3.4.21.109 Matriptase
3.4.21.112 Site-1 protease
3.4.21.120 Oviductine
3.4.22.1 Cathepsine B
3.4.22.2 Papaine
3.4.22.3 Ficaine
3.4.22.6 Chymopapaine
3.4.22.7 Asclepaine
3.4.22.8 Clostripaine
3.4.22.10 Streptopaine
3.4.22.14 Actinidaine
3.4.22.15 Cathepsine L
3.4.22.16 Cathepsine H
3.4.22.24 Cathepsine T
3.4.22.25 Glycyl endopeptidase
3.4.22.27 Cathepsine S
3.4.22.28 Picornaine 3C
3.4.22.30 Caricaine
3.4.22.31 Ananaine
3.4.22.32 Bromelaine
3.4.22.34 Legumaine
3.4.22.35 Histolysaine
3.4.22.36 Caspase 1
3.4.22.37 Gingipain R
3.4.22.39 Adenaine
3.4.22.40 Bleomycin hydrolase
3.4.22.41 Cathepsine F
3.4.22.42 Cathepsine O
3.4.22.43 Cathepsine V
3.4.22.47 Gingipaine K
3.4.22.48 Staphopaine
3.4.22.51 Cruzipaine
3.4.22.52 à 3.4.22.54 Calpaine 1 à Calpaine 3
3.4.22.55 à 3.4.22.64 Caspase 2 à Caspase 11
3.4.22.66 Calicivirine
3.4.22.67 Zingipaine
3.4.22.70 Sortase A
3.4.23.1 Pepsine A
3.4.23.2 Pepsine B
3.4.23.3 Gastricsine
3.4.23.4 Chymosine
3.4.23.5 Cathepsine D
3.4.23.12 Nepenthesine
3.4.23.15 Renine
3.4.23.16 HIV-1 retropepsine
3.4.23.17 Pro-opiomelanocortine converting enzyme
3.4.23.18 Aspergillopepsine I
3.4.23.20 Penicillopepsine
3.4.23.21 Rhizopuspepsine
3.4.23.22 Endothiapepsine
3.4.23.23 Mucorpepsine
3.4.23.24 Candidapepsine
3.4.23.25 Saccharopepsine
3.4.23.26 Rhodotorulapepsine
3.4.23.28 Acrocylinedropepsine
3.4.23.29 Polyporopepsine
3.4.23.30 Pycnoporopepsine
3.4.23.31 Scytalidopepsine A
3.4.23.32 Scytalidopepsine B
3.4.23.34 Cathepsine E
3.4.23.35 Barrierpepsine
3.4.23.36 Signal peptidase II
3.4.23.38 Plasmepsine
3.4.23.40 Phytepsine
3.4.23.41 Yapsine
3.4.23.42 Thermopsine
3.4.23.43 Prepiline peptidase
3.4.23.44 Nodavirus endopeptidase
3.4.23.45 Memapsine
3.4.23.47 HIV-2 retropepsine
3.4.23.48 Activateur du plasminogen Pla
3.4.23.49 Omptine
3.4.23.52 Preflagelline peptidase
3.4.24.1 Atrolysine A
3.4.24.3 Collagenase
3.4.24.6 Leucolysine
3.4.24.11 Neprilysine
3.4.24.12 Envelysine
3.4.24.13 IgA-specific metalloendopeptidase
3.4.24.14 Procollagen N-endopeptidase
3.4.24.16 Neurolysine
3.4.24.17 Stromelysine
3.4.24.18 Meprine A
3.4.24.21 Astacine
3.4.24.23 Matrilysine
3.4.24.24 Gelatinease A
3.4.24.25 Vibriolysine
3.4.24.26 Pseudolysine
3.4.24.27 Thermolysine
3.4.24.28 Bacillolysine
3.4.24.29 Aureolysine
3.4.24.30 Coccolysine
3.4.24.31 Mycolysine
3.4.24.32 Beta-lytic metalloendopeptidase
3.4.24.43 Atroxase
3.4.24.44 Atrolysine
3.4.24.46 Adamalysine
3.4.24.47 Horrilysine
3.4.24.48 Ruberlysine
3.4.24.49 Bothropasine
3.4.24.50 Bothrolysine
3.4.24.51 Ophiolysine
3.4.24.54 Mucrolysine
3.4.24.55 Pitrilysine
3.4.24.56 inesulysine
3.4.24.57 O-sialoglycoproteine endopeptidase
3.4.24.58 Russellysine
3.4.24.61 Nardilysine
3.4.24.62 Magnolysine
3.4.24.68 Tentoxilysine
3.4.24.69 Bontoxilysine
3.4.24.71 Endotheline-convertineg enzyme 1
3.4.24.72 Fibrolase
3.4.24.73 Jararhagine
3.4.24.75 Lysostaphine
3.4.24.76 Flavastacine
3.4.24.79 Pappalysine
3.4.24.80 Membrane-type matrix metalloproteinease-1
3.4.24.83 Anthrax lethal factor endopeptidase
3.4.24.84 Ste24 endopeptidase
3.4.24.85 S2P endopeptidase
EC 3.4.25 - endopeptidases à thréonine 3.4.25.1 Complexe du proteasome
3.4.25.2 HslU-HslV peptidase

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b. Classification selon les [homologies / similarités] de [séquences / structures] & quelques bases de données

Famille : groupe de protéases dans lequel chaque membre possède une relation évolutive avec au moins un autre membre, soit sur l'ensemble de la séquence en acides aminé, soit au moins dans la partie de la séquence liées à l'activité catalytique. Chaque famille est identifié par une lettre majuscule qui représente le type catalytique (S : sérine, T : thréonine ; C : cystéine, A : aspartate, M : métallo, U : inconnu), suivi d'un numéro unique.

Clan : groupe de familles considérées comme ayant des ancêtres communs. Les membres sont le plus souvent regroupés par similitudes de structure tertiaire, mais l'ordre des résidus catalytiques dans la séquence peut être utilisé.

Chaque clan est identifié par 2 lettres majuscules : la première lettre spécifie le type de catalyse (comme pour les familles) / la deuxième lettre est propre au clan.

  • Exemple : chymotrypsine, trypsine ===> famille = S01 (A) / clan = PA (S). P signifie "Protéases à nucléophile mixte" et A indique que c'était le premier clan identifié (il y a eu ensuite les clans PB, PC, PD et PE).
  • Définition des clans : voir Expasy
  • Voir convergence et divergence des protéases

clan protease chymotrypsin MEROPS proteolysis beta barrel structure protein biochimej

Source : Wikipedia

Figure ci-dessus : homologie structurale au sein de la superfamille des protéases du clan PA (clan PA : "Proteases of mixed nucleophile, superfamily A"). Le double tonneau β qui caractérise cette superfamille est en rouge. Exemples : chymotrypsine (PDB 1GG6), thrombine (1MKX), protéase du chloroplaste (4FLN).

Le clan PA contient les protéases à sérine et les protéases à cystéine. On trouve des protéases du clan PA chez les plantes, les animaux, les champignons, les eubactéries, les archées et les virus.

Le clan PA est un exemple :

  • d'évolution convergente dans l'utilisation d'une triade catalytique pour l'hydrolyse
  • d'évolution extrêmement divergente des sites actifs d'enzymes

La base de données MEROPS classe les protéases sur la base de leur similarité structurale. Elle s'impose progressivement comme la base de données de référence des peptidases et de leurs inhibiteurs.

  • plus de 413.000 séquences
  • 61 clans
  • 245 familles

Exemple : élastase pancréatique 1 ===> code MEROPS = S01.153.

Base de données PFAM - Exemples de familles de protéases :

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c. Classification des protéases du point du mécanisme catalytique

Elles se répartissent en 4 grandes classes :

  • les protéases à sérine et à cystéine suivent un mécanisme à 2 étapes en utilisant d'abord ce type d'acide aminé (respectivement) pour promouvoir une attaque nucléophile de la liaison peptidique par un autre acide aminé du site actif.
  • les métallo-protéases et les protéases à acide aspartique (ou aspartyl-protéases) suivent un mécanisme à 1 étape où une molécule d'eau est directement activée pour jouer le rôle de nucléophile.
  • toutefois, l'ensemble du processus de l'hydrolyse de la liaison peptidique est essentiellement la même pour toutes les classes de protéases.

a. Le mécanisme des protéases à sérine : voir le cours sur le site actif des enzymes.

b. Le mécanisme des protéases à cystéine est semblable à celui des protéases à sérine par l'utilisation d'un groupement nucléophile et la formation d'un complexe covalent [enzyme-substrat]. Le nucléophile est l'atome de soufre d'une cystéine (c'est un atome d'oxygène d'une sérine dans le cas des protéases à sérine). Dans la papaine, les groupements NH du squelette carboné de Gln 19 et Cys 25 forment le trou oxyanion.

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis biochimej

c. Les protéases à acide aspartique contiennent 2 Asp qui agissent selon un mécanisme [acide-base] général. Une molécule d'eau coordonnée par les 2 Asp est activée par l'élimination d'un proton, ce qui permet à cette molécule d'eau polarisée d'attaquer le carbone carbonyle de la liaison peptidique. L'état de transition tétraédrique qui résulte de cette attaque nucléophile semble non chargé, contrairement à l'oxyanion formé lors de la catalyse par les protéases à sérine et à cystéine.

d. Les métallo-protéases utilisent un métal coordonné (souvent le zinc) dans leur mécanisme catalytique. Dans beaucoup de métalloprotéases solubles (comme la thermolysine et les métallo-protéases de la matrice), cette coordination s'effectue avec 3 His ou 2 His et 1 chaîne latérale acide. Une molécule d'eau est un ligand supplémentaire du zinc. Cette molécule d'eau établit une liaison hydrogène avec un Glu qui lui arrache un proton et permet ainsi l'attaque. L'ion zinc stabilise l'oxyanion.

Voir une animation du mécanisme catalytique des protéases à sérine.

Visualisation de l'élastase pancréatique de Sus scrofa à une résolution de 1,65 Å

Code PDB : 3EST

Les 3 acides aminés His 57, Asp 102 et Ser 195 forment la triade catalytique.

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4. Le site de fixation du polypeptide substrat des protéases à sérine

Le coeur du site de fixation du polypeptide substrat est la chaîne des carbones α des acides aminés 214 à 216 qui forment un feuillet β antiparallèle avec la chaîne des carbones α des acides aminés P1 à P3 du substrat.

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis biochimej

Dans la chymotrypsine, des liaisons hydrogènes sont établies entre :

  • l'oxygène carbonyle de Ser 214 et le groupement NH de l'acide aminé du substrat P1
  • le groupement NH de Trp 215 et le groupement carbonyle de l'acide aminé du substrat P3
  • le groupement carbonyle de Gly 216 et le groupement NH de l'acide aminé du substrat P3

Ces interactions sont une caractéristique générale des protéases à sérine de type chymotrypsine et sont cruciales pour l'hydrolyse du substrat.

Il est à noter que les acides aminés 214 à 216 forment une partie du sous-site S1 et que le groupement carbonyle de Ser 214 forme une liaison hydrogène avec His 57: il existe donc un lien structural direct entre le site de fixation du polypeptide substrat, le sous-site S1 et les acides aminés de la triade catalytique.

Les boucles inhibitrices des protéines inhibiteurs des protéases sont bloquées dans la conformation étendue requise pour former le feuillet β antiparallèle avec le site de fixation du polypeptide substrat. Cette conformation étendue est observée dans de nombreux complexes [protéase-inhibiteur], y compris les complexes formés avec des analogues de l'état de transition et des peptidyl-acyl-enzymes.

La conformation étendue inclue les acides aminés P3 à P'3, voire le groupement NH de l'acide aminé 218 et l'oxygène carbonyle en P5 comme dans le cas de l'élastase. La structure en feuillet β oriente les chaînes latérales du polypeptide substrat dans des directions alternées.

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Exemples de complexes [protéase - inhibiteur]

Figures ci-dessous : les structures tridimensionnelles des protéases sont représentées en rubans jaunes avec la surface accessible au solvant en vert pâle.
Les éléments de structure secondaire des inhibiteurs sont en bleu (feuillets β), en rouge (hélices α) et en magenta (coudes).
Les types d'inhibition sont indiqués entre parenthèses.

structure protease site actif serine aspartate metalloprotease proteolysis inhibiteur inhibitor chymotrypsin biochimej

Source : Otlewski et al. (2005)

(A) Exemples de complexes [protéase à sérine - inhibiteur] : (1) trypsine - CMTI (PDB 1PPE) / (2) trypsine - α1-antitrypsine (PDB 1EZX) / (3) α-thrombine - haemedine (PDB 1E0F)
(B) Exemples de complexes [protéase à cystéine - inhibiteur] : (1) cathepsine H - stefine A (PDB 1NB5), (2) caspase 7 - XIAP (PDB 1I51), (3) caspase 8 - p35 (PDB 1I4E)

structure protease site actif serine aspartate metalloprotease proteolysis inhibiteur inhibitor chymotrypsin biochimej

Source : Otlewski et al. (2005)

(C) Exemples de complexes [métalloprotéase - inhibiteur] : (1) métalloprotease de Serratia marcescens - inhibiteur de Erwinia chrysanthemi (PDB 1SMP), (2) MMP-1 de type membranaire - TIMP-2 (PDB 1BQQ), (3) carboxypeptidase A2 humaine - LCI (PDB 1DTD)
(D) Exemples de complexes [protéase à acide aspartique - inhibiteur] : (1) pepsine porcine - PI-3 (PDB 1F34), protéinase A - IA3 (PDB 1DPJ)

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Le sous-site S1

Le sous-site S1 de fixation du substrat des protéases à sérine de type chymotrypsine est une poche située à côté de Ser195 et formée par les acides aminés 189-192, 214-216 et 224-228. La spécificité de reconnaissance du substrat est généralement déterminée par les acides aminés de l'enzyme situés aux positions 189, 216 et 226.

  • la spécificité de la chymotrypsine est corrélée à l'hydrophobicité de l'acide aminé du substrat P1: par exemple, Phe en P1 est 50.000 fois mieux fixée que Ala. En effet, les acides aminés de la chymotrypsine Ser189, Gly216 et Gly226 créent une poche hydrophobe responsable de cette préférence pour la fixation d'acides aminés hydrophobes du substrat.
  • dans le cas de la trypsine, les acides aminés Asp189, Gly216 et Gly226 créent un sous-site S1 chargé négativement qui rend compte de la spécificité de cette enzyme pour les substrats qui contiennent Arg ou Lys en P1.
  • l'élastase préfère les substrats avec des petits acides aminés aliphatiques en P1: en effet, le sous-site S1 de l'élastase est plus petit que celui de la chymotrypsine et celui de la trypsine du fait de la présence de Val216 et Thr226.
  • la spécificité de la granzyme B pour les acides aminés acides en P1 est liée à Arg226.

Les sous-sites S2-Sn

Les sous-sites S2-S3 de la chymotrypsine sont peu discriminants vis-à-vis du polypeptide substrat, en accord avec la fonction de protéase digestive de chymotrypsine.

  • le sous-site S2 est un sillon hydrophobe peu profond, délimité par His57, Trp215 et Leu99 : la spécificité de S2 est corrélée avec à l'hydrophobicité de la chaîne latérale de P2.
  • le sous-site S3 de la chymotrypsine a peu de spécificité et peut même accommoder des acides aminés de la série D.

Les sous-sites S2-Sn des autres protéases à sérine peuvent être, au contraire, des déterminants majeurs de leur spécificité, comme l'élastase par exemple pour laquelle l'interaction S3/P3 est dominante ou l'entérokinase (appelée aussi entéropeptidase) qui reconnaît la séquence P1 à P5 [Asp-Asp-Asp-Asp-Lys] avec une extrême précision.

Les sous-sites S'1-S'3

Les interactions entre le groupe partant du substrat et les sous-sites S'1-S'n sont en général déduites des structures des protéines inhibiteurs qui ne contiennent pas les acides aminés optimaux P'1-P'n.

  • la chymotrypsine préfère les substrats avec P'1 = Arg ou Lys du fait des interactions électrostatiques avec Asp35 et Asp64.
  • une liaison hydrogène entre le groupement amide NH de l'acide aminé P'2 et l'oxygène carbonyle de Phe41 est une caractéristique constante des interactions [S'/P'].

Voir un descriptif détaillé de la spécificité de reconnaissance du polypeptide substrat d'un très grand nombre de protéases et des règles d'hydrolyse : "PeptideCutter" (Expasy).

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5. Les zymogènes : précurseur des protéases

En 1876 - 1877, Wilhelm Kühne a découvert la trypsine dans le liquide pancréatique de l'intestin de boeuf au cours de ses études sur la digestion intermédiaire des protéines dans le tractus gastro-intestinal. Il a conclu que la trypsine était initialement inactive puis convertie en sa forme active.

Cette observation est à la base de la notion de précurseur inactif des protéases que l'on appelle zymogène et de l'activation de ce zymogène qui peut être auto-catalytique ou catalysée par d'autres protéases.

On distingue :

  • les zymogènes où le site actif est déjà formé mais stériquement bloqué par le propeptide (exemples : protéases à cystéine du type papaïne ou la procathepsine B, certaines protéases à acide aspartique et métalloprotéases)
  • les zymogènes où le site actif n'est pas formé et sa formation nécessite un réarrangement conformationnels (exemples : protéases à sérine du type chymotrypsine, caspases)

La taille du fragment hydrolysé varie d'un dipeptide (exemples : les granzymes, le trypsinogène) à des domaines entiers (exemples : cathepsines à cystéine, furine). Les pro-domaines de ces dernières sont censés agir également comme des chaperonnes intramoléculaires et sont nécessaires au trafic cellulaire de ces enzymes.

Les enzymes protéolytiques sont biosynthétisées sous forme de précurseur inactif que l'on appelle le zymogène (exemples de zymogènes de protéases à sérine : chymotrypsinogène, trypsinogène, pro-élastase) dont la séquence polypeptidique contient une extrémité N-terminale qui est ultérieurement (auto-)hydrolysée.

protease activation zymogene chymotrypsinogen trypsinogen trypsine aspartate metalloprotease proteolysis biochimej

  • l'entéropeptidase active le trypsinogène dans l'intestin (pH 5 - 6) en clivant la séquence [DDDDKI]. L'activation du trypsinogène en trypsine se poursuit de manière auto-catalytique.
  • l'activation du chymotrypsinogène en π-chymotrypsine puis en α-chymotrypsine est un cas particulier : les dipeptides [14 -15] et [147 - 148] sont éliminés et 3 sous-chaînes polypeptidiques sont liées par des ponts disulfure.

Parfois, les protéases sont activées avec l'aide de complexes d'activation (exemples : certaines caspases situées en amont de cascades qui sont activées par DISC ("Death-Inducing Signalling Complex"), l'apoptosome, l'inflammasome, certaines protéases à sérine du plasma sanguin).

Il existe des exceptions où la protéolyse n'est pas nécessaire pour l'activation, par exemples :

  • l'activation allostérique du facteur VII par d'autres facteurs tissulaires qui convertissent une protéase peu/pas active en une protéase très active
  • la caspase 8 et la caspase 9 (protéases à cystéine pro-apoptotique) dont l'activation est induite par dimérisation

L'oligomérisation est un facteur important de l'activité enzymatique de certaines protéases : en effet, certaines sont inactives sous forme de monomère voire n'existent que sous forme d'oligomères comme le protéasome, la β-tryptase, la bléomycine hydrolase, les méprines ou la cathepsine C.

L'inhibiteur tissulaire des métalloprotéases (TIMP-2 - "Tissue Inhibitor of MetalloProteases") est un cas très particulier : en plus de sa fonction inhibitrice, il peut participer à l'activation de MMP-2 ("Matrix MetalloProteinase-2" ou collagénase de type IV ou gélatinase A) par formation d'un complexe tri-moléculaire avec MT1-MMP ("Membrane Type 1-Matrix MetalloProteinase" - endopeptidase à zinc de type I transmembranaire) au sein duquel [TIMP-2/MT1-MMP] sert de récepteur pour réguler l'activation de MMP-2.

Le domaine d'activation de zymogène

Quatre segments de la chaîne polypeptidique sont déformés dans les zymogènes de la chymotrypsine et de la trypsine : les 19 premiers acides aminés N-terminaux, les acides aminés 142 à 152, 184 à 193 et 216 à 223. Ces quatre segments sont appelés collectivement domaine d'activation et ils incluent le sous-site S1 et le le trou oxyanion, ce qui explique la faible activité du zymogène.

L'hydrolyse des 15 premiers acides aminés N-terminaux active le zymogène et fait apparaître un nouvel acide aminé N-terminal (Ile 16 pour la chymotrypsine, Val 16 pour l'élastase) qui forme un pont salin (enfoui dans la protéine) avec Asp 194. Ces événements induisent des changements locaux de conformation : le sous-site S1 et le le trou oxyanion sont formés, créant ainsi la forme active de la protéase.

Voir une animation JMol : "Proteolytic cleavage of chymotrypsinogen by trypsin produces chymotrypsin".

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6. Mécanisme catalytique des protéases à sérine

a. Formation d'un acyl-enzyme

En 1953 - 1954, Brian Hartley et B. Kilby ont étudié la cinétique d'hydrolyse par la chymotrypsine en utilisant comme substrat le p-nitrophényl acétate (NPA) et le p-nitrophényléthyl carbonate (NPC), deux esters qui ressemblent à un acide aminé aromatique.

L'hydrolyse du groupe carbonyle de ce composé forme l'acétate et le p-nitrophénol qui absorbe à 400 nm (coloration jaune), et dont la concentration peut donc être mesurée par simple mesure spectrophotométrique.

Ils ont constaté que la réaction avec ce substrat se déroule en 2 étapes :

  • 1ère étape : le groupe p-nitrophénol est libéré rapidement, mais le groupe acétate reste lié à l'enzyme par covalence.
  • 2ème étape : L'enzyme réagit avec l'eau et le groupe acétate est libéré de l'enzyme. Cette étape est plus lente et nécessaire avant que l'enzyme catalyse un autre cycle de réaction.

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease biochimej

Source : Hartley & Kilby (1954)

Texte original de la figure : "In all measurements of the hydrolysis of NPA or NPC by chymotrypsin, it was observed that the extrapolated linear hydrolysis plot did not pass through the origin at zero time (Fig. 7). This suggested that the slow linear hydrolysis was preceded by a rapid initial reaction."

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease biochimej

Source : Hartley & Kilby (1954)

Texte original de la figure : "The linear portion of these curves gave rates proportional to enzyme concentration. In Fig. 8, the intercepts obtained by extrapolating the linear hydrolysis to zero time are plotted against enzyme concentration. The intercept is proportional to enzyme concentration. Such values are consistent, within experimental error, with a rapid initial reaction liberating 1 mole nitrophenol/mole enzyme."


Paramètres cinétiques de l'hydrolyse par la chymotrypsine de dérivés du N-acétyl-L-Trp (N-acétyl-L-Trp-X)
groupement X  kcat (s-1) KM (μM)
-O-CH2-CH3 27 0.097
-O-CH3 28 0.095
-p-nitrophénol 31 0.002
-NH2 0.026 7.3

Influence de la nature du groupement partant sur l'hydrolyse par la chymotrypsine

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease biochimej

Paramètre Acétyl-Tyr-Gly-amide Acétyl-Tyr-O éthyl-ester
kcat (s-1) 0,50 193
KM (M) 0,023 0,0007
kcat/KM (M-1.s-1) 21,7 275.700

On observe une formation trés rapide de p-nitrophénol durant l'état pré-stationnaire : c'est ce que l'on appelle le jet ou "burst" (figure ci-dessous et figure 7 ci-dessus).

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease burst jet lag latence biochimej

Cette phase est suivie d'une formation plus lente de p-nitrophénol à l'état stationnaire. Au bout d'un temps appelé temps de latence (ou "lag"), on observe la formation d'acétate.

L'étape d'hydrolyse est la plus lente : c'est l'étape limitante.

La cinétique d'apparition des 2 produits reflète la formation rapide d'une forme intermédiaire de l'enzyme : l'acyl-enzyme.

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease burst biochimej

b. Formalisme cinétique

Le mécanisme réactionnel s'écrit :

                 k1                             k2                                k3
E + S <=====> ES ------------------> E*S ---------> E + P2
                k-1              + libération de P1                + H2O

Hypothèse de l'état stationnaire : d[E*S]/dt = 0 ===> (k2 . [ES]) - (k3 . [E*S]) = 0
Conservation de la matière : [E0] = [E] + [ES] + [E*S]
Vitesse d'apparition de P2 :       vi   =   k3 . [E*S]
                                      [S0]
 vi  =  kcat . [E0]  .  --------------
                                KMapp + [S0]

Paramètres cinétiques :

              k2 . k3
kcat =  ---------
              k2 + k3

                     k3
KMapp = [ --------- ]  .  KM
                 k2 + k3

  • k2 : constante de vitesse d'acylation
  • k3 : constante de vitesse de désacylation

Si k2 << k3 : l'étape limitante est l'acylation - dans ce cas : kcat = k2 et KMapp = KM

Si k2 >> k3 : l'étape limitante est la désacylation - dans ce cas : kcat = k3 et KMapp = (k3/k2) KM

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c. Le mécanisme "Ping Pong"

Voir un cours sur les cinétiques à 2 (ou plus) substrats.

Exemples d'enzymes qui suivent un mécanisme "Ping Pong" :

  • les oxydoréductases (exemple : thiorédoxine peroxydase)
  • les transférases (exemple : acylneuraminate cytydilyltransférase)
  • les protéases à sérine

Ce mécanisme est aussi appelé réaction à double déplacement : un ou plusieurs produits sont libérés avant que tous les substrats se soient fixés à l'enzyme (figure ci-dessous - selon la représentation de William Cleland) :

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease ping pong biochimej

  • le 1er substrat A se fixe sur la forme E de l'enzyme, qui devient E* (par exemple par transfert d'un groupe chimique de A au site actif) puis le 1er produit P est libéré
  • c'est alors seulement que le 2nd substrat B se fixe sur E* ce qui régénére la forme non modifiée E

Une caractéristique fondamentale de ce type de mécanisme est donc l'existence d'une forme intermédiaire E* de l'enzyme, chimiquement modifiée : l'acyl-enzyme.

Dans le cas des protéases à sérine :

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease ping pong biochimej

  • l'intermédiaire E* est un acyl-enzyme formé par l'attaque du résidu sérine du site actif sur une liaison peptidique du substrat protéique.
  • le résultat de cette étape d'acylation est la formation du premier intermédiaire tétrahédrique dont la structure est probablement semblable à celle de l'état de transition (ES#) avec un oxygène carbonyle négatif appelé l'oxyanion.
  • le site actif fixe plus fortement l'oxyanion qu'il ne fixe le groupement carbonyle original du substrat : l'état de transition est ainsi stabilisé.

Voir un détail structural du mécanisme catalytique des protéases à sérine et la formation des acyl-enzymes.

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d. Synthèse peptidique par les protéases

Il y a plus de 100 ans, van't Hoff (1898) a souligné la possibilité de formation enzymatique de la liaison peptidique par réversion de la réaction d'hydrolyse des protéases. Depuis lors, la synthèse catalysée par les protéases a été largement établie.

Des petits peptides synthétisés par voie enzymatique sont utilisés pour la nutrition humaine ou animale et aussi comme produits agrochimiques ou pharmaceutiques.

Exemples : l'aspartame (édulcorant non calorique), la kyotorphine, l'angiotensine, l'enképhaline et la dynorphine et quelques dipeptides ou tripeptides de nutritionnels.

La synthèse de peptides par des protéases s'effectue selon 2 mécanismes : le contrôle thermodynamique et le contrôle cinétique.

La synthèse de peptides thermodynamiquement contrôlée ("Thermodynamically Controlled Synthesis" - TCS) avec des protéases représente l'inverse de l'hydrolyse de la liaison peptidique.

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease synthesis synthese biochimej

Kion : constante d'équilibre d'ionisation
Kcon : constante d'équilibre de conversion

En effet, selon le principe de réversibilité microscopique, la formation et l'hydrolyse de la liaison peptidique suivent le même mécanisme et mettent en jeu les mêmes intermédiaires.

La formation de l'intermédiaire acyle à partir d'un acide carboxylique est une réaction très lente et représente l'étape limitante de la TCS.

Le contrôle cinétique de la synthèse des peptides ("Kinetically Controlled Synthesis" - KCS)

  • EH : enzyme libre
  • AC-X : substrat donneur d'acyle
  • [E...AC-X] : complexe acyl-enzyme
  • HX : groupe libéré
  • AC-E : intermédiaire acyl-enzyme
  • HN : substrat accepteur (nucléophile)
  • Ac-N : produit de synthèse (peptide)
  • Ac-OH : produit d'hydrolyse du donneur d'acyle

acylenzyme acyl chymotrypsine burst catalytic mechanism serine protease synthesis synthese biochimej

Comme le montre le schéma, le donneur d'acyle (qui doit être activé sous forme d'un ester, d'une amide ou d'un nitrile) se fixe en premier à l'enzyme pour former un complexe [enzyme- substrat] tétrahedrique [E...AC-X] qui à son tour forme l'acyl-enzyme intermédiaire covalent [Ac-E].

Cet intermédiaire subit une attaque nucléophile par l'eau ou par un nucléophile (HN) qui peut être une amine, un alcool ou un thiol, en compétition avec l'eau pour la réaction de désacylation.

La réussite de la réaction de synthèse dépend des cinétiques de ces réactions nucléophiles, ce qui explique la notion de contrôle cinétique de ce type de synthèse.

A l'inverse de la stratégie TCS, seules les protéases à sérine ou à cystéine peuvent être utilisés pour la stratégie KCS, car dans ce cas, l'enzyme agit comme une transférase et catalyse le transfert d'un groupement acyle du donneur d'acyle à des acides aminés nucléophiles.

Généralement, la stratégie KCS est plus rapide et nécessite un rapport [enzyme/substrat] plus faible que la stratégie TCS parce que le donneur d'acyle est sous forme d'un acide carboxylique activé.

Il est souhaitable que le produit peptidique de la réaction soit retiré du milieu réactionnel pour éviter une hydrolyse secondaire indésirable. Le rendement en peptide synthétisé dépend du rapport apparent des constantes de vitesse des activités [transférase / hydrolase] et de la vitesse à laquelle le produit peptidique est hydrolysé.

Les protéases les plus utilisées dans la stratégie KCS sont la thermolysine, la papaïne, la trypsine et l'α-chymotrypsine avec des des rapport d'activités [transférase / hydrolase] de l'ordre de 102-104.

Voir : Guzman et al. (2007) "Peptide synthesis: chemical or enzymatic" Elec. J. Biotechnol. 10, 279 - 314

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7. Les protéases intramembranaires

L'étude des protéases est entrée dans une nouvelle phase avec la découverte de protéases intramembranaires qui catalysent l'hydrolyse de la liaison peptidique dans les membranes. Jusqu'à lors, on croyait les réactions hydrolytiques restreintes aux seules enzymes cytosolubles.

La protéolyse intramembranaire fournit une stratégie simple et irréversible pour la signalisation : le clivage et la libération de domaines protéiques attachés à la membrane. Ces domaines peuvent, par exemple, pénétrer dans le noyau et agir comme facteurs de transcription ou être excrétés afin d'activer les récepteurs de cellules voisines.

La protéolyse intramembranaire a été décrite pour la première fois comme une activité essentielle dans l'homéostasie des stérols :

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis

Source : Erez et al. (2009)

Le domaine cytoplasmique de la protéine de fixation de l'élément de régulation des stérols des mammifères ("mammalian Sterol Regulatory Element-Binding Protein" - mSREBP) est attaché par un segment transmembranaire à la membrane du réticulum endoplasmique.

Lorsque le niveaux de cholestérol de la cellule chute, mSREBP est transportée vers l'appareil de Golgi où deux métallo-protéases intramembranaires ("Site-1 Protease" - S1P puis "Site-2 Protease" - S2P) clivent son domaine cytoplasmique.

Le domaine cytoplasmique (bHLH) ainsi libéré est dirigé vers le noyau, où il active les gènes de la synthèse du cholestérol et des acides gras.

Plusieurs protéases intramembranaires ont depuis été identifiées et elles constituent 3 groupes :

  • les métallo-protéases à zinc S2P ("Site-2 Protease")
  • les protéases à sérine rhomboïdes
  • 2 protéases à acides aspartiques : la peptidase de peptide signal (SPP) et la préséniline

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8. Les protéases intramembranaires des protéines prénylées à motif CAAX

Voir un cours sur la prénylation.

Un grand nombre de protéines (superfamille RAS des petites GTPases, les lamines du noyau, la sous-unité γ des GTPases hétérotrimériques et plusieurs protéines kinases et protéines phosphatases) qui ont un motif C-terminal CAAX (C : Cys, A : un acide aminé aliphatique, X : n'importe quel acide aminé) subissent des modifications post-traductionnelles par des lipides (prénylation) isoprénoïdes (groupes farnésyl ou géranyl-géranyl).

Ces groupes sont attachés à la cystéine. L'isoprènylation est suivie par l'hydrolyse des acides aminés AAX et la méthylation de la cystéine prénylée.

La biogénèse des protéines prénylées à motif CAAX nécessite un routage à partir de la membrane du réticulum endoplasmique (RE). Bien que la maturation des protéines prénylées à motif CAAX ait lieu au niveau de cette membrane, ces protéines sont destinées à d'autres types de membranes (plasmique par exemple).

Le transport des protéines prénylées à motif CAAX telles que Ras de la membrane du RE vers la membrane plasmique peut impliquer l'un des 3 mécanismes suivants :

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis lamin prenylation CAAX reticulum

Source : Schmidt et al. (1998)

  • (1) la translocation par diffusion au travers du cytoplasme
  • (2) le transport le long de la face cytoplasmique d'organites comme ceux de la voie de sécrétion
  • (3) le transport via une protéine, un lipide ou un transporteur vésiculaire non encore identifiés

Actuellement, on a identifié 2 protéases intramembranaires des protéines prénylées à motif CAAX.

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a. La protéase Ste24p

Remarque préalable : diverses appellations de Ste24p (EC 3.4.24.84) selon l'origine

  • SmSte24p : Ste24p de Saccharomyces mikatae
  • ScSte24p : Ste24p de Saccharomyces cerevisiae
  • ZMPSTE24 : Ste24p de Homo sapiens - (PDB 4AW6) - Voir Quigley et al., 2013 (détermination de la structure tridimensionnelle et du mécanisme catalytique)
  • SmSte24p est identique à 96% et 37% avec ScSte24p et ZMPSTE24, respectivement.

Ste24p est une métallo-protéase à zinc (endopeptidase de type I).

Elle a un rôle spécifique dans la maturation de la prélamine A (précurseur de la lamine A, protéine filament intermédiaire du noyau) chez les Eucaryotes et du facteur a chez la levure.

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis lamin

Source : Pryor et al. (2013)

SmSte24p de la levure Saccharomyces mikatae est une protéine intégrale de la membrane composée de 7 hélices transmembranaires (de 28 à 44 acides aminés) avec des écarts jusqu'à 10 Å de diamètre entre les hélices (figure ci-dessous).

  • Ces hélices entourent une grande cavité (environ 14.000 Å3) contenue presque complètement à l'intérieur de la membrane. Cette cavité est suffisante pour contenir une protéine de 10 kDa ou 450 molécules d'eau.
  • Les hélices III à VII sont déformées ou fortement courbées, les hélices III et IV contenant des proline au niveau des déformations.
  • L'hélice VI contient le motif HEXXH, signature des métallo-protéases à zinc.
  • Deux boucles entre les hélices II et III et entre les hélices VI et VII, contiennent des hélices α courtes composées de 12 et 7 acides aminés, respectivement.

Figure ci-dessous : structure de la protéase SmSte24p de la levure Saccharomyces mikatae.

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis

Source : Pryor et al. (2013)

La surface de la protéine exposée au cytoplasme contient 2 domaines supplémentaires :

  • le domaine L5D [hélice α / feuillet β / boucle 5] de 70 acides aminés
  • le domaine C-terminal CTD en hélices α de 44 acides aminés
  • ces 2 domaines bouchent les grands écarts entre les hélices V et VI et entre les hélices VII et I, respectivement, et coiffent la surface exposée au cytoplasme de la protéine

Actuellement, les acides aminés du site actif de SmSte24p ne sont pas clairement définis. C'est essentiellement par comparaison / superposition de la structure de SmSte24p avec celle de la thermolysine (l'une des métallo-protéases à zinc solubles les mieux caractérisées tant sur le plan structural que mécanistique) que l'on peut émettre des hypothèses quant à la nature des acides aminés de SmSte24p impliqués dans la catalyse.

En effet, la comparaison du site actif de la thermolysine avec le site de fixation du zinc de Ste24p révèle une congruence structuralle étonnante pour la quasi-totalité des acides aminés impliqués dans la coordination du zinc, dans la catalyse et dans la reconnaissance du substrat.

Ainsi, le site actif de SmSte24p contient le motif [H297EXXH301] au sein de l'hélice VI, le glutamate catalytique (E390) et les acides aminés du site de fixation du substrat (N263, A264, H434 et R440).

Ces hypothèses sont corroborées par les mutations de H297, E298 ou H301 qui diminuent l'activité enzymatique de SmSte24p.

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Mécanisme catalytique supposé de la protéase SmSte24p

Actuellement, le mécanisme de l'hydrolyse s'appuie sur l'hypothèse d'un processus d'insertion du substrat, de sa translocation puis de l'éjection du premier produit.

Le sillon de fixation du substrat, formé par L5D et CTD, se situe sur la face exposée au cytoplasme de la cavité interne transmembranaire de SmSte24p. Ce sillon, presque coplanaire à la surface de la membrane a une longueur d'environ 40 Å et traverse la cavité (figure ci-dessous).

Figure A ci-dessous : le fort degré de similitude entre les sites actifs de SmSte24p et de la thermolysine suggère que la polarité (direction N- vers C-) des substrats respectifs est identique dans les deux enzymes. En conséquence, les substrats de SmSte24p seraient orientés dans le sillon avec leurs extrémités C-terminale pointant vers l'embouchure située entre les hélices I et VII et leurs extrémités N-terminale pointant vers l'embouchure située entre les hélices V et VI.

Figure ci-dessous : mécanisme catalytique proposé pour SmSte24p.

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis

Source : Pryor et al. (2013)

Figure B : l'étoile rouge indique le site d'hydrolyse du motif CAAX.

Figure C : translocation du substrat qui suit cette hydrolyse, puis évacuation du produit d'hydrolyse par l'embouchure située entre les hélices I et VII et enfin positionnement du deuxième site d'hydrolyse.

La consommation d'une molécule d'eau à chaque acte catalytique suggère que la cavité interne volumineuse constitue un "réservoir d'eau", maximisant ainsi la concentration effective de l'eau et augmentant la catalyse des protéines prénylées à motif CAAX.

D'autres protéases intramembranaires adoptent des mécanismes d'accès de l'eau au site catalytique différents.

  • la sérine catalytique des protéases rhomboïdes est sitée à la base d'une cavité périplasmique accessible en forme d'entonnoir qui peut être fermée.
  • l'atome de zinc de S2P est accessible au cytoplasme par un étroit chenal perméable à l'eau formé dans la conformation fermée au substrat de l'enzyme.

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b. La protéase Rce1 ("Ras and a-factor converting enzyme 1")

Elle a été identifiée chez Saccharomyces cerevisiae : elle serait l'un des premiers membres identifiés d'une classe de protéases intramembranaires à glutamate (endopeptidase de type II - EC 3.4.22) du réticulum endoplasmique. Sa spécificité est beaucoup plus large dans la maturation de toutes les protéines prénylées à motif CAAX.

Rce1 appartient à la famille ABI ("ABortive Infection") des protéases intramembranaires potentielles et possède des homologues dans les 3 règnes du vivant. La famille ABI est définie par trois motifs conservés qui constituent leur site catalytique.

  • famille: Abi (PF02517)
  • MEROPS : famille M79
  • INTERPRO : CAAX amino terminal protease (IPR003675)

Rce1 contient 8 hélices α transmembranaires dont la structure et celle de son site catalytique sont différentes des autres protéases intramembranaires.

Le domaine ABI contient environ 100 acides aminés qui correspondent aux hélices α transmembranaires TM4 à TM7. Ces quatre hélices forment un faisceau d'hélices antiparallèles (symétrie d'ordre 2) entouré par les hélices moins conservées TM1, TM2, TM3 et TM8.

7 hélices α transmembranaires forment une large cavité catalytique conique (d'un volume d'environ 1400 Å3) qui accomode les protéines prénylées à motif CAAX. Les acides aminés catalytiques (E140, H173, H227 et N231) sont situés dans la partie supérieure de cette cavité, à environ 10 Å à l'intérieur de la membrane.

Figure ci-dessous : structure de la protéase Rce1

  • La figure indique en particulier les chaînes latérales des 5 acides aminés conservés du domaine ABI (et de R145) et l'eau catalytique (W en rouge).
  • Les hélices α transmembranaires TM4, TM5, TM6 et TM7 (en violet) constituent le domaine ABI (en violet).
  • Acides aminés du trou oxyanion residues : H227 et N231 (non montrés).

protease membrane site actif aspartate glutamate metalloprotease helice catalyse proteolysis

Source : Manolaridis et al. (2013)

Cette conformation des hélices α transmembranaires permet un accès illimité du solvant du cytoplasme jusqu'au site catalytique de cette cavité. Un côté de la cavité est ouvert côté membrane par un espace situé entre TM2 et TM4. L'accès au périplasme (la lumière du réticulum endoplasmique) est bloqué par l'acide aminé conservé R145, qui interagit avec T210 et acide aminé conservé E141.

Le modèle structural actuel propose que le groupe farnésyle se fixe sur un site situé à l'ouverture de 2 hélices α transmembranaires, positionnant ainsi la liaison peptidique à hydrolyser à côté d'une molécule d'eau nucléophile activée par Glu140.

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12. Liens Internet et références bibliographiques

The MEROPS database : information resource for peptidases (also termed proteases, proteinases and proteolytic enzymes) and the proteins that inhibit them

PROSPER: Protease substrate specificity webserver

Serine Proteases

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