Application des molécules biologiques et des enzymes dans l'industrie - Biochimie et enzymologie industrielle
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1. Introduction

2. Synthèse de métabolites pour l'industrie par les micro-organismes

3. Culture en batch

4. Enzymologie industrielle

5. Enzymes immobilisées

6. Nanoparticules : applications thérapeutiques de l'interférence ARN

7. Les senseurs biologiques

8. Les détergents et tensioactifs

 

9. Les micro-algues et les biofuels

10. Les modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome pour des applications industrielles et médicales

11. Synthèse "artificielle" et ingénierie

a. Les acides nucléiques artificiels - "synthetic genetics"

b. Machine "artificielle" de synthèse peptidique

c. Ingénierie du métabolisme pour la production d'acides gras oméga-3

12. Liens Internet et références bibliographiques

 

Introduction

Les bio-plastiques et les bio-fuels

Actuellement, presque tous les plastiques sont synthétisés à partir d'énergies non-renouvelables (gaz naturel et pétrole). La production mondiale de plastiques en 2010 a été supérieure à 265 millions de tonnes, soit 8% de la consommation mondiale de pétrole.

Les bio-plastiques :

  • ont pour source la biomasse qui est renouvelable
  • ont, pour beaucoup, comme molécules précurseurs, des métabolites monomères synthètisables par des enzymes dans des organismes modifiés ou non
  • réduisent la dépendance aux formes d'énergies non-renouvelables
  • ont un impact positif sur le cycle du carbone puisqu'ils consomment du CO2 pour la culture de cette biomasse

La demande globale de bio-plastiques devrait tripler d'ici 2015 pour dépasser 1 million de tonnes par an et représenter un marché d'environ 3 milliards de dollars.

Exemple d'entreprise "verte" : Seeds Genomics Biofuels

Principaux domaines d'utilisation des enzymes dans l'industrie

  • l'industrie des détergents (exemple d'application potentielle : des détergents qui contiendraient des enzymes fonctionnelles à 100°C)
  • l'industrie de l'amidon
  • l'agroalimentaire (alimentation humaine et animale)
  • la chimie fine
  • le secteur de la santé
  • les domaines de l'analyse et des capteurs

Les nouveaux domaines en "omique" et l'ingénièrie métabolique

ont contribué au développement de l'ingénièrie métabolique ("metabolic engineering") afin de transformer des organismes vivants pour produire ou transformer des composés organiques d'intérêt industriel ("microbial cell factories").

metabolic engineering industrial process biotechnology biochimej

Source : Curran & Alper (2012)

Exemples de précurseurs de produits industriels ou pharmaceutiques synthétisés par des micro-organismes modifiés

  • introduction de fragments d'ADN de 36.000 paires de bases codant pour 20 enzymes et/ou protéines impliquées dans le catabolisme d'alginate pour la production de bio-carburant à partir d'algues (Wargacki et al., 2012).
  • dérivés d'intérêt pharmaceutique :
    1. l'anti-oxydant naringenine (produite par Escherichia coli)
    2. l'anti-cholestérol lovastatine, précurseur de la simvastatine (produite par Aspergillus terrus)
    3. production par Saccharomyces cerevisiae de l'acide artemisinique (terpenoide), précurseur de l'artémisinine utilisée contre la malaria
  • synthèse de butanediols
  • le 1,3-propanediol est naturellement produit pas certaines bactéries lors de la fermentation du glycérol. Il utilisé pour la synthèse de poly-methylène terephthalate (vendu sous le nom déposé "Soron" par DuPont).
  • la diamine putrescine, utilisée pour la synthèse du nylon 4,6, a été produite par Escherichia coli après déletion d'un gène (rpoS) codant un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress.
  • synthèse des monomères 3-hydroxypropionate et 3-hydroxybuyrate et leurs polymères et co-polymères respectifs.
  • synthèse des polymères bactériens poly-hydroxy-alkanoates.

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2. Synthèse de métabolites pour l'industrie par les micro-organismes

Un grand nombre de métabolites sont des éléments de base (ou précurseurs) pour la synthèse de bio-polymères ou de bio-plastiques d'intérêt industriel. On peut citer : l'acide adipique, l'acide fumarique, l'acide glucarique, l'acide malique, l'acide succinique.

Le succinate (acide succinique) est un produit central pour :

  • l'industrie alimentaire
  • l'industrie pharmaceutique
  • la fabrication de surfactants et de détergents
  • les plastiques biodégradables
  • les solvants "verts"
  • les additifs pour stimuler la croissance des animaux et des plantes

succinate fermentation industrial process biotechnology biochimej

Source : Zeikus et al. (1999)

N-Methylpyrrolidone : recommandé pour remplacer le chlorure de methylène (des millions de tonnes utilisées par an) comme solvant : moins volatile, il peut être capturé et recyclé sans rejet toxique dans l'atmosphère.

1,4-Butanediol : solvant industriel et matériel de base pour la fabrication de résines (polybutylène téréphthalate).

c-Butyrolactone : intermédiaire chimique et constituant de dissolvants de peinture et de produits textiles (matériel de base des dérivés pyrrolidone).

Acide adipique : précurseur du nylon 6,6. Matériel de base pour la fabrication de lubrifiants, de mousses et d'aliments.

Tétrahydrofurane : solvant et constituant clé d'adhésifs, d'encre d'impression et de bandes magnétiques.

Le succinate est un métabolite formé par les micro-ogranismes, les animaux et les plantes.

Exemples :

  • bactéries gastro-intestinales telles que Escherichia coli, Pectinatus sp., Bacteroides sp.
  • bactéries de ruminants telles que Ruminococcus avefaciens, Actinobacillus succinogenes, Bacteroides amylophilus, Prevotella ruminicola, Succcinimonas amylolytica, Succinivibrio dextrinisolvens, Wolinella succinogenes et Cytophaga succinicans
  • les Lactobacillus dans certaines conditions

Un très grand nombre de micro-ogranismes anaérobies ou facultatifs produisent le succinate comme métabolite terminal de leur voie de fermentation.

La fermentation du succinate présente de nombreux avantages. En particulier, sur le plan écologique, elle consomme du CO2. A titre de comparaison, la fermentation de l'éthanol produit 2 moles de CO2.

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Synthèse industrielle d'acide succinique par fermentation

Les carbohydrates sont hydrolysés par voie enzymatique, mélangés avec d'autres aliments et injectés en continu dans un fermenteur. Le CO2 est injecté dans le fermenteur (figure ci-dessous).

La fermentation est arrêtée par addition de NaOH, ce qui forme du succinate de sodium soluble.

Après micro-filtration pour éliminer les débris cellulaires, une unité d'électrodialyse pour le déssalage ("batch desalting electrodialysis unit") est utilisée pour séparer les espèces ioniques (le succinate de sodium) des sucres (non ioniques) et des protéines et polysaccharides.

Figure ci-dessous : Exemple de technologie pour la fabrication et la commercialisation de l'acide succinique par [acidification par électrodialyse et cristallisation] simultanées et [acidification par résines d'échange d'ions et cristallisation] simultanées.

succinic succinate fermentation industrial process biotechnology electrodialysis membrane biochimej

Source : Zeikus et al. (1999)

  • CSL : "corn steep liquor"
  • ED : "electrodialyzed"
  • CIP : "cleaning-in-place"

Une série de résines d'échange d'ions et de membranes bipolaires convertissent le succinate de sodium en acide succinique. Une membrane cationique est employée pour que les ions sodium s'associent aux ions hydroxyle (formation d'hydroxide de sodium ré-utilisé dans le fermenteur). L'acide succinique est purifié par cristallisation.

Synthèse d'acide malique par des souches de levure génétiquement modifiées

L'acide malique est aussi un "bloc de construction" (précurseur) de beaucoup de produits industriels.

De nombreuses bactéries ou levures peuvent produire l'acide malique. Par exemple : Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli , Rhizopus arrhizus, Paecilomyces varioti, Schizophyllum commune

Une voie prometteuse de formation de malate à partir du glucose in vivo, est la carboxylation du pyruvate suivie de la réduction de l'oxaloacetate en malate. Cette voie est neutre du point de vue rédox et de l'ATP, elle fixe du CO2 et a un rendement théorique maximum de 2 moles de malate par mole de glucose.

Figure ci-dessous : 4 voies possibles pour la production de malate chez Saccharomyces cerevisiae, en utilisant l'oxaloacetate et/ou l'acétyl-CoA comme précurseurs.

succinate glyoxylate fermentation metabolic engineering biotechnology biochimej

Source : Zelle et al. (2008)

  • (I) Réduction directe de l'oxaloacétate (OAA)
  • (II) Oxydation du citrate (CIT) via le cycle de Krebs ("tricarboxilic acids cycle" - TCA)
  • (III) Formation de malate (MAL) à partir de l'acétyl-CoA (C2) via la voie cyclique du glyoxylate
  • (IV) Formation de malate à partir de l'acétyl-CoA et de l'oxaloacétate via la voie non cyclique du glyoxylate

Légende figure ci-dessus :

  • ICI, isocitrate; AKG, α-cétoglutarate; SUCC, succinyl-CoA; SUC, succinate; FUM, fumarate
  • Yspmax : rendement théorique maximum en moles de malate par mole de glucose

Une souche de Saccharomyces cerevisiae ("glucose-tolerant, C2-independent pyruvate decarboxylase-negative S. cerevisiae strain") manipulée génétiquement ("engineered strain") a été élaborée.

Les 3 modifications apportées sont :

  • sur-expression de la pyruvate carboxylase codée par PYC2
  • haut niveau d'expression d'un allele du gène MDH3 dont la protéine pour laquelle il code, la malate déshydrogénase, a été ré-adressée vers le cytosol par délétion de la séquence C-terminale d'adressage au peroxisome
  • expression du gène SpMAE1 de Schizosaccharomyces pombe codant le transporteur du malate

En conditions de culture "batch" ("glucose-grown batch culture"), l'introduction simultanée des 3 modifications a débouché sur :

  • un titre en malate de 59 g/litre
  • un rendement de 0.42 moles de malate par mole de glucose

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3. Culture en batch

Paramètre Agitation radiale Agitation axiale
Efficacité mélange gaz - liquide +++ +
Efficacité mélange solide - liquide + +++
Cisaillement +++ +
Application Culture de micro-organismes Culture de cellules animales

Formalisme mathématique de la croissance bactérienne

Modélisation de l’évolution d’une colonie bactérienne - système d’équations différentielles de Yves Cherruault.

Equation Modelisation evolution colonie bacterienne biochimej

  • k est une constante d’échanges identifiée par les données expérimentales
  • X et S sont respectivement la concentration de la biomasse et du substrat dans le milieu nutritif
  • V est l’entrée de substrat
  • U(t) est une fonction de contrôle (qui peut correspondre par exemple à la concentration de l’éthanol dans un processus de fermentation alcoolique)
  • µ(t) est une fonction non linéaire qui définit l’échange entre le compartiment bactérien X et le milieu de culture S

Source : Cherruault Y. (1998) "Modèles et méthodes mathématiques pour les sciences du vivant" - PUF

La fonction non linéaire µ(t) est calculée selon la loi de Monod, qui a pour expression :

croissance bacterienne loi Monod biochimej

Autre formulation

Les microorganismes poussent selon une loi exponentielle quand elles sont cultivées dans un environnement optimal : concentration des cellules = CC = C0 . eµt

La loi de Monod permet de déterminer le taux de croissance µ en faisant une analogie avec les sytèmes enzymatiques et en particulier l'équation de Henri-Michaelis-Menten : µ = µmax . [CS / (KM + CS)]

  • CS la concentration en substrat limitant (celui que l'on étudie en général)
  • KM est la concentration en substrat telle que µ = µmax/2

Les équations de Teissier et de Moser sont utiles pour lisser le début ou la fin des courbes de croissance :

  • équation de Teissier : vitesse de croissance = µmax . [1 - exp (- CS / k)] . CC
  • équation de Moser : vitesse de croissance = (µmax . CS) / (1 + k . CS)

k et λ sont des constantes empiriques.

Un chemostat "chemical environment is static" est un type de bio-réacteur dans lequel poussent en continu et de manière controlée, des micro-organismes (bactéries, phytoplancton).

bioreacteur chemostat bacterial growth batch biochimej

Source : Bacterial Chemostat Model

Il existe 3 principaux modes de fonctionnement :

  • en "batch" : l'entrée et la sortie sont nulles. On assiste à une croissance exponentielle des organismes.
  • en "fed batch" : la sortie est nulle. C'est le mode de fonctionnement utilisé quand on veut contrôler la population.
  • en continu : les débits de sortie et d'entrée sont égaux. Le volume est donc constant dans la chambre.

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4. Enzymologie industrielle

Les enzymes sont utilisées dans l'industrie quand des catalyseurs extrêmement spécifiques sont nécessaires.

Cependant, l'emploi des enzymes est en général limité par rapport aux nombres de réactions pour lesquelles la nature les a élaborées comme catalyseur, en particulier du fait de leur instabilité structurale (dénaturation) en présence de solvants organiques, aux pH extrêmes ou à hautes températures.

En conséquence, l'ingénierie des protéines est un domaine de recherche très actif afin de créer de nouvelles enzymes aux propriétés originales qui catalysent des réactions qui ne se produisent pas dans la nature.

Exemples des enzymes d'organismes extrêmophiles

Les enzymes et les composés organiques issus d'organismes extrêmophiles drainent un marché mondial potentiel de 17 milliards de dollars (source : Diversa).

La filière pharmaceutique reprèsenterait 5 milliards de dollars. Voir une liste d'enzymes d'extrêmophiles utilisées en biotechnologie.

Le séquençage complet du génome de bactéries et d'archaebactéries offre de très larges perspectives. Sur les dizaines de génomes microbiens complètement séquencés, un grand nombre appartiennent à des hyperthermophiles ou à des archaebactéries issues de milieux extrêmes.

Les enzymes d'organismes extrêmophiles catalysent des réactions dans des conditions qui sont, en général, non standard (par rapport aux enzymes "usuelles").

Certaines de ces enzymes maintiennent leur enveloppe d'hydratation et demeurent actives en solution même quand l'eau ambiante est limitante (par exemple, en présence de fortes concentrations ioniques) ou à basse température quand l'eau est proche du point de congélation. Ces enzymes maintiennent leur enveloppe d'hydratation du fait d'une plus grande densité de charges à leur surface et des mouvements moléculaires accrus.

Ces propriétés permettent à certaines enzymes d'extrêmophiles de fonctionner dans des solvants organiques, ce qui permet de développer des catalyseurs biologiques en conditions non aqueuses.

L'industrie agro-limentaire

L'industrie agroalimentaire utilise des polysaccharides (d'origine végétale ou de micro-organismes) pour améliorer ou modifier les propriétés rhéologiques des produits finis :

  • propriétés stabilisantes ou épaississantes : l'amidon, la cellulose, les hémicellulose et le xanthane.
  • propriétés gélifiantes : les carraghénanes, les pectines et les alginates (susceptibles d'avoir aussi des propriétés stabilisantes et épaississantes en fonction de leur concentration)

Dans l'industrie agro-alimentaire, l'amidation est utilisée :

  • pour greffer des acides aminés essentiels sur les protéines
  • pour protéger les groupements ε-aminés contre la réaction de Maillard

Dans le domaine de la santé, des recherches actuelles ont pour but :

  • l'étude de l'inhibition de la PAM afin de mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques
  • la compréhension du mécanisme d'action des enzymes de maturation des précurseurs hormonaux

Application Enzymes utilisées Utilisations
Traitement de la nourriture

Amylases fongiques et de plantes

Production de sucres à partir d'amidon : fabrication de sirops.
Boulangerie : fermentation de sucres par les levures pour produire le dioxyde de carbone qui lève la pâte.

Protéases

Les fabricants de biscuit les utilisent pour baisser la teneur en protéines de la farine.
Pré-digestion des aliments pour bébés.

Cellulases, pectinases Clarification des jus de fruit.
Papaïne Attendrit la viande pour la cuisson.
Brasserie Les enzymes de l'orge sont libérées pendant le stade d'écrasement lors de la fabrication de la bière. Elles dégradent l'amidon et les protéines pour produire des sucres simples, des acides aminés et des peptides utilisés par la levure pour la fermentation.

Enzymes d'orge produites industriellement :
Amylase, glucanases, protéases
Bétaglucanases et arabinoxylanases
Amyloglucosidase et pullulanases
Protéases
Acétolactate décarboxylase

Largement utilisées dans le brassage pour remplacer les enzymes naturelles de l'orge.
Découpent les polysaccharides et les protéines du malt.
Améliorent les caractéristiques du moût ("wort") et la filtration de la bière.
Bière de faible calorie et ajustage de la fermentabilité.
Enlèvent le trouble produit pendant l'entreposage de la bière.
Augmente l'efficacité de la fermentation en réduisant la formation de diacétyle.
Industrie laitière

Rennine extraite de l'estomac de jeunes animaux ruminants (exemple : veaux, agneaux)
Enzymes produites par voie microbienne
Lipases
lactases

Hydrolyse des protéines lors de la fabrication de fromage.
Utilisation croissante dans l'industrie laitière.
Production du Roquefort : améliore le mûrissement de la moisissure bleue.
Hydrolyse du lactose en glucose et galactose.
Industrie de l'amidon

Amylases, amyloglucosidases et glucoamylases
Glucose isomérase

Convertissent l'amidon en glucose et différents sirops.
Convertit le glucose en fructose pour produire des sirops à partir de féculents. Ces sirops ont des propriétés adoucissantes et des valeurs calorifiques plus basses que le saccharose pour le même niveau de douceur.

Industrie du papier Amylases, xylanases, cellulases et ligninases Hydrolysent l'amidon pour baisser la viscosité du papier et aider à sa découpe et à son surfaçage.
Les xylanases réduisent la quantité d'agents chimiques nécessaires au blanchiement; les cellulases lissent les fibres, améliorent le drainage de l'eau et facilitent l'enlèvement de l'encre; les ligninases hydrolysent la lignine pour adoucir le papier.
Industrie du carburant biologique Cellulases et ligninases

Hydrolyse de la cellulose dans les sucres fermentables lors de la production d'éthanol à partir de la cellulose.
Récupération des résidus de lignine.

Détergents biologiques Protéases excrétées par les bactéries
Amylases
Lipases
Cellulases
Pré-trempage et applications liquides directes pour enlever les taches des vêtements d'origine protéique.
Détergents pour enlever les résidus d'amidon résistants.
Utilisé pour enlever les taches grasses et huileuses.
Utilisé dans les adoucissants biologiques.
Nettoyants de lentilles de contact
Industrie du caoutchouc
Industrie photographique
Protéases
Catalase
Ficine (protéase)
Désinfectant protéique.
Production d'oxygène à partir du peroxyde pour transformer le latex en mousse.
Dissolution de la gélatine des films et récupération de l'argent.
Biologie moléculaire Enzymes de restriction, DNA ligases, DNA polymérases, ... Manipulation de l'ADN, PCR, ... (génétique, pharmacologie, agriculture, médecine légale, ...).

Voir : "Enzyme - Industrial applications".

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5. Enzymes immobilisées

L'un des principaux avantages des enzymes immobilisées est leur ré-utilisation.

De plus, leur stabilité structurale est augmentée : celà permet d'effectuer des réactions à des températures plus élevées que dans le cas de l'enzyme libre en solution.

En revanche, leur activité est parfois diminuée car une partie des sites actifs peuvent être masqués.

Exemples d'enzymes immobilisées commercialisées :

  • "Novozyme 435®" (Novozymes) : lipase immobilisée de Candida antarctica sur résine acrylique. A ne pas confondre avec" lipase from Candida antarctica type B" - CALB.
  • "Novozym 539® HP F" : protéase de Bacillus
  • "Lipozyme® TL IM" (Novozymes) : lipase immobilisée de Thermomyces lanuginosus

a. Exemples de méthodes d'immobilisation

  • adsoprtion sur résine
  • supports : liaisons ioniques ou covalentes, chélation
  • réticulation ("cross-linking") : réactifs bifonctionnels ou multifonctionnels (glutaraldéhyde, bis-diazobenzidine, hexamethylene di-isocyanate)
  • par "piège" ("entrapment") : enzyme incorporée dans le réseau d'un gel semi-perméable ou dans une membrane polymère semi-perméable (collagène, polyacrylamide, ...)
  • par encapsulation ou inclusion : aerogel de silice, fibres

Enzyme immobilise immobilized cross linking CLEA entrapment biochimej

Comparaison de différentes méthodes d'immobilisation
Caractéristiques Adsorption Liaisons ioniques Liaisons covalentes "Cross-linking" "Piège" ("Entrapment")
Préparation Facile Facile Difficile Difficile Difficile
Coût Faible Faible Elevé Modéré Faible
Forces des liaisons Faible Modérées Fortes Fortes Fortes
Régénération Oui Oui Non Non Non
Perte d'enzyme Oui ------------- Non ------------- Oui
Activité enzymatique Faible Elevée Elevée Modérée Elevée
Gamme d'applications Etroite Modérée Modérée Etroite Large
Effets de matrice Oui ------------- Oui ------------- Oui
Protection contre les microbes Non ------------- Non ------------- Oui

b. Auto-immobilisation ("cross-linking self-immobilisation")

Elle s'effectue via des interactions entre molécules d'enzyme ("enzyme cross-linking") : il n'y a pas besoin d'une matrice pour l'immobilisation (coût réduit) et l'activité volumétrique est augmentée.

Il existe différentes techniques de "cross-linking" :

  • CLEA : Cross-Linked Enzyme Aggregates
  • CSDE : Cross-Linked Spray Dried Enzyme
  • CLEC : Cross-Linked Enzyme Crystals
  • CLES : Cross-Linked Enzyme from Solution

Enzyme immobilise immobilized spherezyme biochimej

Source : "Spherezymes" - Brady et al. (2008)

La synthèse d'antibiotiques est un exemple d'application des enzymes immobilisées dans l'industrie pharmaceutique.

La penicillinase (β-lactamase - EC 3.5.2.6) immobilisée est utilisée pour la conversion de la penicilline-G ou V en acide 6-amino penicillanique (6-APA).

L'ampicilline est produite à partir du 6-APA avec la penicilline G amidase (EC 3.5.1.11) immobilisée (CLEA).

Enzyme immobilise immobilized penicilline amidase CLEA biochimej

c. Immobilisation sur cellulose modifiée

L'introduction de groupements méthacryloxy dans la cellulose (papier) est effectuée avec un couplage à base de silane (meilleure hydrophobicié / papier sec et mouillé plus résistant).

Une lipase a été immobilisée sur ce type de papier. Au cours de l'étape de trans-esterification (en milieu non aqueux - conditions "batch") entre le 1-phényléthanol et le vinyl acétate pour former du 1-phényléthylacétate, la lipase immobilisée a une forte activité catalytique, une bonne sélectivité et un fort taux de ré-utilisation.

Les groupements méthacryloxy introduits dans la cellulose semblent jouer un rôle clé dans l'hyperactivation de la lipase.

Enzyme immobilise immobilized methacrylate biochimej

Source : Koga et al. (2012)

La formation de 1-phényléthylacétate est encore plus élevée dans des conditions de réaction en flux continu : les microstructures poreuses interconnectées du papier sont donc compatibles avec le flux de la solution de réactants.

Ce type d'immobilisation d'enzymes semblent prometteur pour une catalyse "verte".

d. Immobilisation sur nanocomposites super-paramagnétiques

Immobilisation au glutaraldéhyde de la glucoamylase sur des nanoparticules super-paramagnétiques.

Figure ci-dessous : schéma de la glucoamylase immobilisée sur des nanoparticules Fe3O4 Clays (ci-dessous) et de la stratégie pour régénérer le support.

Enzyme immobilise immobilized penicilline amidase CLEA glucoamylase magnetic nanoparticle biochimej

nanoparticule superparamagnetique biochimej

Source des figures : Zhao et al. (2011)

Exemples d'applications des enzymes immobilisées dans l'industrie pharmaceutique
  • Production de corticostéroïdes
  • Production d'acides aminés
  • Production de L-DOPA (L-3,4-dihydroxy-phénylalanine)
  • Exemples d'autres molécules produites par des enzymes immobilisées
  • La prednisolone est produite à partir de la cortisone avec des enzymes immobilisées extraites de Curcuria lanata.
  • La L-aspartase-4-décarboxylase immobilisée permet la conversion de l'asparte en alanine.
  • La β-tyrosinase immobilisée permet la synthèse de L-DOPA (traitement de la maladie de Parkinson).
  • coenzyme-A, pro-insuline, interleukine-2, anticorps monoclonaux, prostaglandines, anthraquinone, bacitracine, nikkomycine ...
Exemples d'applications d'enzymes immobilisées dans le diagnostique médical
  • troubles musculaires
  • infarctus du myocarde
  • hépatite
  • empoisemment par des dérivés organo-phosphoriques
  • analyse d'antigènes-anticorps
Exemples d'applications des enzymes immobilisées dans l'industrie
  • Céphalosporine amidase
  • Amino acylase
  • Aspartase
  • Fumarase
  • Aspartase β-décarboxylase
  • Nitrile hydratase
  • Glucose isomérase
  • Lipase
  • glutaryl-7-ACA ===> 7-ACA (ACA = acide 7-amino céphalosporanique)
  • D,L - acide aminé acylé ===> L - acide aminé
  • acide fumarique ===> acide aspartique
  • acide fumarique ===> acide malique
  • acide aspartique ===> alanine
  • acrylonitrile ===> acrylamide
  • glucose ===> sirop à fort taux de fructose
  • Rac-1-phenyléthylamine ===> (S)-1-phenyléthylamine
Les enzymes immobilisées sont aussi utilisées comme biosenseurs (mesure de la concentration de molécules dans les fluides corporels - voir ci-dessous).

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6. Nanoparticules : applications thérapeutiques de l'interférence ARN

L'une des restrictions dans l'utilisation clinique des ARN interférents émane de leur temps de vie très court car ils sont rapidement dégradés par les nucléases du sérum ou des fluides extracellulaires.

Les courts ARN double brins interférants sont donc instables et il génère des effets secondaires indésirables (stimulation du système immunitaire, sécrétion de cytokines inflammatoires, ...) s'ils sont administrés systématiquement, raison pour laquelle il n'y a pas ou peu de thérapie clinique à base d'interférence ARN.

Il faut donc mettre au point des systèmes qui permettent :

  • de délivrer spécifiquement et efficacement des petits ARN interférents
  • au type de cellules ciblées
  • en optimisant leur dispersion cytosolique
  • sans qu'ils soient dégradés

Vecteur administration siRNA miRNA RNAi therapy therapie nanoparticule biochimej

Source : Roche

L'empaquetage

Des "protocellules" - nanoparticules à base de silice mésoporeuse (exemples : "Mobil Crystalline Materials" - MCM-41 / "Santa Barbara Amorphous" - SBA-15) recouvertes d'une bicouches lipidique.

 

spanosome protocellule nanoparticule nanoparticle nanoparticle siRNA miRNA RNAi therapy therapie biochimej

Source : Ashley et al. (2012)

Elles sont 10 à 100 fois plus stables que les nanoparticules à base de bicouches lipidiques. Les protocellules chargées en siRNA se fixent spécifiquement aux cellules via un peptide de ciblage.

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7. Les senseurs biologiques

Les senseurs reconnaîssent sélectivement des molécules chimiques ou biologiques. Les senseurs polymères sont parfois appelés "nez artificiels" dans la littérature.

La reconnaissance des molécules par les senseurs est convertie en un signal électrique, optique, calorimètrique, accoustique, magnétique.

L'amplitude du signal généré est proportionnelle à la concentration en composé détecté : on peut donc faire des dosages quantitatifs.

Quelques exemples d'applications des senseurs :

  • diagnostic médical ou identification de mutations génétiques (détection d’ADN et de protéines)
  • identification de pathogènes infectieux
  • dosage du taux de sucres dans le sang
  • étude de l’activité enzymatique
  • détection ou dosage de molécules de trinitrotoluène (TNT), d'ions de métaux de transition néfastes

a. Utilisation des senseurs polymères comme senseurs biochimiques

Les polymères conjugués (figure ci-contre) peuvent être des senseurs luminescents de molécules biologiques.

Polymere conjugue senseur biosensor biochimej

Avantages des senseurs polymères fluorescents pour la détection de molécules biologiques :

  • temps d'analyse plus courts
  • sensibilités élevées
  • marges d'erreur minimes

Senseur d'avidine : l'un des premiers senseurs biochimiques.

Il est basé sur le greffage d'un groupe biotine à une molécule de viologène (dérivé de la 4,4'-bipyridine) mélangé à un polymère conjugué anionique dérivé du PPV (figure ci-dessus).

  • les groupements anioniques augmentent la solubilité dans l'eau (caractéristique clé d'un biosenseur).
  • les composés biotine-viologène sont chargés positivement et les chaînes polymères sont chargées négativement.

Viologene polymere conjugue senseur biosenseur biosensor bipyridine biochimej

En absence d'avidine : un complexe se forme entre les composés [biotine-viologène] et les chaînes polymères. La luminescence du polymère est supprimée (transfert d'électron par "quenching").

En présence d'avidine : le couple avidine - biotine possède l'une des constantes de dissociation les plus faibles. Il se forme donc un nouveau complexe entre les composés [biotine-viologène] et l'avidine.

Les chaînes polymères sont libérées et se fixent aux sites actifs des protéines présentes en solution : la luminescence du polymère est recouvrée.

Viologene polymere conjugue senseur biosenseur biosensor biochimej

Source : Senseurs chimiques et biologiques basés sur des polymères conjugués

Senseur de protéases

L'activité des protéases peut être étudiée avec des senseurs polymères dont le principe est semblable à celui du senseur avidine :

  • le polymère conjugué anionique est un dérivé du PPE
  • une chaîne polypeptidique cationique sur laquelle est fixée une molécule piège à son extrémité

Comme dans le cas du senseur avidine, la solution aqueuse n’est pas luminescente initialement. Les protéases introduites dans le milieu hydrolysent des liaisons peptidiques spécifiques de la chaîne polypeptidique, les molécules pièges sont alors relarguées en solution et la luminescence est rétablie.

Les senseurs de protéases peuvent détecter des concentrations nanomolaires d'enzymes (exemple : la thrombine) en quelques minutes.

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b. Biosenseur électrique : détection de courant au travers d'une couche de cellules

Ce type de biosenseur ("electrical biosensor" ou "impedance-based biosensor") est utilisé pour l'étude de processus cellulaires.

Il est constitué d'un substrat, d'une électrode et d'une couche de cellules au contact de l'électrode (figure ci-dessous).

Des fibroblastes cultivés sur une électrode constituée par un film extrêmement fin d'or permettent de mesurer l'impédance d'un très faible courant alternatif. Les changements d'impédance sont mesurés en temps réel et les fluctuations d'impédance sont dépendantes de la concentration en ATP et de la polymèrisation de l'actine.

Figure ci-dessous : les cellules sont cultivées à la surface d'un réseau de micro-électrodes d'or. Un très faible courant alternatif à fréquence variable est appliqué à la couche de cellules et les courant extracellulaire et transcellulaire sont mesurés.

Electric senseur impedance biosenseur biosensor courant alternatif biochimej

Source : Zhang & Xie (2012)

De nombreux processus cellulaires ont ainsi été étudiés : l'adhésion cellulaire, les changements de morphologie des cellules et la mort cellulaire.

c. Biosenseur optique : récepteur couplé à une protéine G (RCPG)

Ce type de biosenseur ("optical biosensor" ou "resonant waveguide grating biosensor" - RWGB) utilisent des structures "râpeuses" au fond de plaques à microtitres (figure ci-dessous).

Figure ci-contre : Les cellules sont cultivés à la surface du biosenseur.

Les changements de concentration des macromolécules biologiques sont mesurées.

RCPG recepteur protein G senseur biosenseur biosensor resonant waveguide grating RWG biochimej

Source : Zhang & Xie (2012)

Quand elle est illuminée par une lumière à large spectre ou monochromatique, cette surface réfléchit une lumière caractéristique de l'indice de réfraction du milieu ambiant, donc des propriétés physiques de la couche de cellules avec laquelle elle est en contact.

Le décalage de l'angle de résonance ou de la longueur d'onde réfléchie est mesurée.

Quand un RCPG est activé, il déclenche la transduction du signal perçu, ce qui entraîne des changements de concentration des macromolécules biologiques impliquées dans la voie de signalisation concernée.

Si ces changements s'opèrent à une distance inférieure à 200 nm de la surface de contact, les modifications de l'indice de réfraction sont détectés.

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d. Voie non conventionnelle de la signalisation par les RCPG : "2ème vague" d'activation via les endosomes

RCPG recepteur couple proteine G arrestine endosome biosenseur biosensor biochimej

Source : Irannejad et al. (2013)

La voie classique ou principale de la transduction du signal médié par les récepteurs couplés à une protéine G (RCPG) est celle qui met en jeu les RCPG liés à la membrane plasmique.

La difficulté majeure pour étayer la ou les voie(s) moins conventionnelle(s), après internalisation de RCPG dans des endosomes, est l'absence de méthodes d'analyse qui fournissent des preuves expérimentales à l'échelle sub-cellulaire.

En d'autres termes, il est difficile de prouver que les RCPG localisés dans les endosomes sont encore actifs.

Une preuve expérimentale qui renforce cette hypothèse a récemment été apportée par l'utilisation de senseurs conformationnels biologiques appelés nano-anticorps ("nanobodies" - "conformation-specific single-domain antibodies"), qui sont les plus petits fragments d'anticorps entièrement fonctionnels, naturellement produits chez le chameau.

Du fait de leur petite taille (15 kDa) et de leur flexibilité, ils accèdent à des régions de protéines que les anticorps ne peuvent pas atteindre. Ils ont notamment été employés pour stabiliser les formes actives des couples [RCPG - protéine G] afin de les cristalliser (Steyaert & Kobilka, 2011) .

Cette technique a été employée pour sonder directement l'activation du récepteur β2-adrénergique (β2AR) associé à une protéine G de la classe Gs qui stimulent la production de l'AMPc dans des cellules de mammifère.

Deux nano-anticorps ont été utilisés : Nb80 qui se fixe à β2AR et Nb37 qui se fixe à la forme Gs dépourvue du nucléotide.

Modèle décrivant 2 phases d'activation de [β2AR - Gs]

biosenseur biosensor RCPG recepteur couple proteine G amp cyclique arrestine endosome biochimej

Source : Lohse & Calebiro (2013)

1ère phase : au niveau de la membrane plasmique qui résulte en un premier accroissement du taux d'AMPc.

il y aurait ensuite formation d'invaginations (recouvertes de clathrine) de la membrane : interaction du récepteur avec la β-arrestine, activation d'enzyme ERK et autres signaux non conventionnels.

2ème phase : après internalisation du récepteur dans les vésicules sous forme d'endosomes. C'est la "2ème vague" impliquant la protéine Gs, qui résulte en un second accroissement du taux d'AMPc.

L'agoniste adrénergique isoprénaline active le récepteur et la protéine G dans la membrane plasmique, comme prévu, mais aussi dans la membrane de l'endosome précoce.

Les récepteurs internalisés dans des endosomes contribuent à la réponse AMPc globale quelques minutes après application de l'agoniste.

e. Exemples de biosenseurs utilisant la GFP ("Green Fluorescent Protein")

L'ammoniac est une source d'azote fondamentale et un intermédiaire du métabolisme. L'absorption de l'ammoniac est médiée par des transporteurs dont le fonctionnement n'est pas encore décrypté.

Des senseurs permettent la mesure de l'activité in vivo de ces transporteurs. La technique repose sur l'insertion, par permutation circulaire, de la GFP à des positions critiques pour la conformation des transporteurs.

Ces senseurs ont été développés chez Arabidopsis ("AmTrac") et chez la levure ("MepTrac"). L'addition d'ammonium à des levures exprimant ces senseurs déclenche des changements d'intensité de fluorescence proportionnels à la concentration. Ces changements sont corrélés à l'activité du transporteur.

Voir De Michele et al. (2013).

L'activité neuronale, en particulier la transmission des pulse électriques (potentiels d'action des neurones) provoque des changements de concentration intracellulaire du calcium libre. Des senseurs permettent l'imagerie de l'évolution du calcium dans les neurones individuels et le suivi de l'activité neuronale à toutes les échelles (de grandes populations neuronales aux compartiments intracellulaires dans une cellule).

Parmi les senseurs de calcium les plus populaires, les GCaMPs (GCaMP2 GCaMP3 et GCaMP5) contiennent la GFP lié au domaine de fixation du calcium de la calmoduline (CaM).

biosenseur biosensor GCaMP calcium GFP Green Fluorescent Protein biochimej

Source : Akerboom et al. (2012)

La fixation du calcium sur ce complexe induit un changement de conformation de la calmoduline, ce qui entraîne un changement de fluorescence de la GFP.

f. Exemples d'entreprises

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8. Les détergents et tensioactifs

a. Les détergents

L'utilisation des enzymes dans l'industrie des détergents représente l'application industrielle la plus importante à la fois en termes de valeur et de quantité. Il suffit de penser aux lessives.

Les enzymes les plus utilisées sont les protéases, mais beaucoup d'autres hydrolases peuvent également être ajoutées aux préparations pour aider à l'élimination de taches très diverses.

Les marques de lessive les plus performantes combinent protéases, amylases, lipases et cellulases pour augmenter l'efficacité du lavage. Chacune de ces enzymes est capable d'attaquer un type particulier de tache ou de salissure.

Le fait d'inclure plusieurs types d'activité enzymatique dans le détergent permet ainsi d'éliminer des salissures contenant différentes substances. Par exemple, une tache alimentaire peut contenir des protéines, des lipides et de l'amidon.


Constituant Composition (%)
Sodium tripolyphosphate (adoucisseur d'eau, décrassage)
Remplacé à terme par du carbonate de sodium plus des protéases, pour des raisons écologiques
38
Sodium alcane sulphonate (tensioactif) 25
Sodium perborate tetrahydrate (agent oxydant) 25
Sodium alcane carboxylates (savon) 3
Sodium sulphate (adoucisseur d'eau) 2,5
Sodium carboxyméthyle cellulose (agent décrassant) 1,6
Sodium métasilicate (liant, épaississant) 1,0
Protéase de Bacillus (3% active)
Les enzymes ne représentent qu'un très faible pourcentage dans la composition des détergents.
0,8
Agent fluorescent 0,3
Agent anti-moisissure et parfum trace
Source : LSBU

Les efforts de l'industrie pour modifier les enzymes qui entrent dans la composition des détergents portent, entre autre, sur un accroissement de leur stabilité à la châleur, à des pH alcalins et à d'autres conditions sévères.

En effet, une fois relarguées des granules dans lesquelles elles sont conditionnées, les enzymes doivent résister :

  • aux tensioactifs non ioniques
  • aux savons
  • aux agents oxydants (exemple : le sodium perborate qui génère du peroxide d'hydrogéne)
  • aux agents qui augmente l'aspect "lumineux"
  • aux autres composés plus ou moins actifs
  • et ce à des pH compris entre 8.0 et 10.5
  • enfin, l'incorporaton d'enzymes a pour but une efficacité à des températures moins élevées (économie d'énergie). Cependant, les enzymes doivent rester actives jusqu'à 60°C.

Enzymes utilisées dans les détergents

Elles sont produites par des souches de Bacillus, principalement par 2 entreprises.

  • Novo Industri A/S (par sa filliale Novozyme) produit et fournit 3 protéases :
    1. l'alcalase à partir de B. licheniformis
    2. l'esperase à partir d'une souche alcalophile de B. licheniformis
    3. la savinase à partir d'une souche alcalophile de B. amyloliquefaciens
  • Gist-Brocades (groupe DSM) produit et fournit la maxatase à partir de B. licheniformis

L'alcalase et la maxatase sont 2 protéase de la famille de la subtilisine (EC 3.4.21.62). Elles sont recommandées pour un usage de 10 à 65°C et un pH de 7 à 10.5.

La savinase et l'esperase peuvent être utilisées jusqu'à pH 11 et 12, respectivement.

L'α-amylase présente dans les détergents est un variant de type termamyle ("European patent specification - EP 1 423 513 B1") utilisée aussi dans la fabrication de sirops à base de glucose. Cette α-amylase est particulièrement efficace pour les détergents de machine à laver la vaisselle et les taches de féculants.

Choix des protéases à sérine

Toutes ces enzymes protéolytiques sont des endoprotéases à sérine non spécifiques.

En effet seules les protéases à serine peuvent être utilisées dans la formulation des détergents

  • les thiol-protéases (comme la papaïne) serait oxydée par les agents oxydants
  • les métalloprotéases (comme la thermolysine) perdraient leur cofacteur métallique par complexation avec les adoucisseurs d'eau ou les ions hydroxyle

Cependant, lune des améliorations récentes dans la composition des détergents est l'introduction d'une cellulase d'origine fongique, stable aux pH alcalins, dans les lessives textiles pour le coton.

  • au cours du lavage, de petites fibres sont soulevées de la surface du fil de coton ce qui a pour conséquence de modifier le sens de l'étoffe et de réduire le brillant des couleurs.
  • le traitement par la cellulase élimine ces petites fibres, sans endommager les fibres principales, et restaure ainsi l'aspect original de l'étoffe.

b. Les agents tensioactifs

Les tensioactifs ou agents de surface ("surfactant") modifient la tension superficielle entre les surfaces des molécules.

Ce sont des molécules amphiphiles : une partie hydrophobe et une partie polaire ou chargée

  • les tensioactifs non ioniques ont une charge nette nulle et ne s'ionise pas dans l'eau
    1. les tensioactifs à liaison ester (R-CO-O-R'). Exemple : Triton 100X, Nonidet P-40, Brij 35, Tween 80
    2. Tensioactifs à liaison éther (R-O-R'). Exemple : éthers d'alcool
    3. Tensioactifs à liaison amide (R-CO-NH-R'). Exemple la série des "Comperlan"
  • les tensioactifs cationiques libèrent un cation dans l'eau
  • les tensioactifs anioniques libèrent un anion dans l'eau
  • les tensioactifs zwitterioniques ou amphotères : ils contiennent un groupement acide et basique et libèrent un anion ou un cation selon le pH

Figure ci-dessous : Les différents types de tensioactifs.

detergent tensioactif ionique zwitterionique biochimej

Le caractère hydrophile ou hydrophobe prédominant d'un tensioactif est caractérisé par la balance hydrophile/lipophile ("Hydrophilic-lipophilic balance" - HLB).

L'échelle varie de 0 à 20 (méthode de Griffin) :

  • 0 correspond à une molécule complètement lipophile (hydrophobe) molecule
  • 20 correspond à une molécule complètement hydrophile
  • la méthode de a été ultèrieurement affinée (méthode de Davies)

Voir un développement du calcul HLB.

Production de tensioactif par les bactéries ("Microbial biosurfactants")

Deux souches de Pseudomonas aeruginosa (GS9-119 et DS10-129) capables de dégrader les huiles, ont été utilisées pour la synthèse d'un biotensioactif : le rhamnolipide (biodégradable, non toxique, utilisation potentielle en cosmètique, source de rhamnose).

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9. Les microalgues et les biofuels

Voir une excellente revue : Taher et al., 2011.

Les microalgues sont des organismes photosynthétiques que l'on trouve dans un très grand nombre d'environnements : eau salée ou douce, dans les terres arides, dans la neige, les prairies.

Le NREL ("National Renewable Energy Laboratory" - Colorado, USA) contient une collection de 3.000 souches d'algues analysées et caractérisées.

Elles sont soit :

  • autotrophes : ces microalgues ne recquièrent que du CO2, de la lumière et des sels.
  • héterotrophes : ces microalgues recquièrent une source de carbone organique (comme le glucose) et bien d'autres nutriements.

Enfin les microalgues peuvent être phototrophes (utilisation de la lumière solaire comme seule source d'énergie) ou chimiotrophes.

Le biodiesel semble un carburant prometteur pour remplacer le diesel dérivé du pétrole. Cependant, l'utilisation des huiles extraites des récoltes est en compétition avec leur utilisation comme nourriture et ne peut pas satisfaire la demande mondiale.

En revanche, les microalgues qui ont un meilleur rendement en huile par hectare, semblent une source suffisante pour remplacer le diesel (pétrole) fossile.

Comparaison des sources d'énergie
Caractéristiques Pétrole Bio-éthanol Huiles d'algues ("Oil")
Ressources Non renouvelable (pétrole / huiles fossiles) Renouvelable : plantes cultivées Renouvelable (algues vertes)
Empreinte carbone (émission de CO2) Très élevée Modérée Faible
Déchêts / effets indésirables Pollution / déchêts toxiques / émission de fumées toxiques Pollution / déchêts biologiques / odeurs Produits valorisés / déchêts biologiques / fumées
Efficacité Elevée Moyenne Très élevée
Sécurité Inflammable / toxique / explosif Inflammable / neurotoxique / corrosif Faiblement inflammable / non toxique
Extraction Très coûteuse (prospection, extraction, transport, raffinement) Coûteuse (fertiliseur, culture, transport, fermentation, distillation) Très peu coûteuse
Production Limitée (Pic de Hubbert ?) Limitée (fertilisants, fermes, terres et eau disponibles) Limitée (eau et terres ensoleillées disponibles)
Distribution Très centralisée (raffineries) Modérément centralisée (bio-réacteurs & fermes) Décentralisée
Impact écologique Pollution de l'air, des sols et de la mer / grande utilisation d'eau Pollution des sols (engrais, insecticides), de l'air (odeurs), de l'eau (rejet d'eau souillée) / grande utilisation d'eau / déforestation / destruction de l'habitat Pas de pollution des sols / pollution modérée de l'air (odeurs) / utilisation d'eau recyclée ou souillée possible / utilisation de terres arides
Impact socio-économique Instabilité politique (conflits) / hautement subventionnée Augmentation critique du prix des récoltes (compétition nourriture / biofuel) / hautement subventionnée Aucun / pas encore subventionnée
Source : SGT

Les microalgues sont une source de biofuels renouvelables :

  • le méthane via la digestion anaérobique des microalgues
  • le biodiesel dérivé de leurs huiles
  • le biohydrogène via la "photobioproduction"

Il y a plus de 60 ans qu'on a pris conscience du potentiel énergétique des microalgues. Mais les crises économiques, les prises de conscience environnementales et la fin annoncée des ressources énergétique fossiles non renouvelables ont relancé l'intérêt pour ces ressources renouvelables.

Les avantages des microalgues :

  • croissance rapide : le temps de doublement de la biomasse n'est que de 3.5 heures pendant la phase exponentielle
  • un contenu en huiles de 20 to 50% de la masse sèche de la biomasse (voir le tableau ci-dessus)
  • l'aptitude à pousser sur des terres non arables, non adaptées à l'agriculture : pas de compétition avec les terres destinées aux récoltes pour la nourriture
  • l'aptitude à pousser sur des sols à forte salinité : forte réduction des besoins en eau douce
  • récoltes régulières à cycles courts
  • haute efficacité photosynthétique du fait d'une structure cellulaire simple en comparaison des végétaux supérieurs
  • forte consommation de CO2 ("fixateur" de CO2)
  • rendement à l'hectare sans comparaison avec les espèces végétales cultivées :
    1. microalgues : environ 137.000 litres / hectare pour une surface de 2 Mha
    2. blé : environ 170 litres / hectare pour une surface de 1500 Mha
    3. huile de palme : environ 6.000 litres / hectare pour une surface de 45 Mha
Microalgue Contenu en huile (% poids sec de la biomasse)
Botryococcus braunii 25–80
Chlorella protothecoides 23–30
Chlorella vulgaris 14–40
Crypthecodinium cohnii 20
Cylindrotheca sp. 16–37
Dunaliella salina 14–20
Neochloris oleoabundans 35–65
Nitzschia sp. 45–47
Phaeodactylum tricornutum 20–30
Schizochytrium sp. 50–77
Spirulina maxima 4–9
Tetraselmis suecia 15–23
Source : Taher et al. (2011)

a. Culture dans des étangs ("microalgal open-ponds" - systèmes ouverts)

microalgue biofuel biodiesel culture pond energie renouvelable biochimej

Source : "BionomicFuel.com"

Il s'agit de canaux de circulation en boucle dont le courant est assuré par des pales. Ces installations ont des tailles très diverses mais peuvent atteindre des surfaces colossales.

microalgue biofuel biodiesel culture pond energie renouvelable biochimej

Source : "Make Biofuel"

Avantages

  • elles sont simples et peu chères
  • les opérations sont faciles

Inconvénients

  • conditions de lumière et de température difficiles à contrôler
  • faible production de biomasse
  • évaporation et contaminations

Figure ci-dessous : Schéma de la production de microalgues en système ouvert.

microalgue biofuel biodiesel culture pond energie renouvelable biochimej

Source : "Seambiotic Ltd."

Exemples d'entreprises :

b. Culture dans des photobioréacteurs ("photobioreactors" - systèmes fermés)

Un photobioréacteur est une série de containers (tubes, plaques) en plastique ou en verre. Le diamètre des tubes (10 cm maximum) ou l'épaisseur des plaques est capitale pour éviter l'accumulation d'O2 et donc l'inhibition de la photosynthèse.

microalgue biofuel biodiesel photobioreactor bioreacteur energie renouvelable biochimej

Source : Abdel-Raouf et al. (2012)

Avantages

  • conditions de culture plus faciles à contrôler
  • plus grand rapport surface/volume de culture
  • prévention de l'évaporation et des contaminations
  • pénètration de la lumière de tous les côtés ce qui augment la densité des cellules

Inconvénients

  • les photobioréacteurs sont plus côuteux en matériel et en énergie
  • détérioration du plastique sous l'effet des UV
  • besoin de nettoyage fréquents des biofilms qui se forment
  • l'agitation et les échanges gazeux y sont moins efficaces
  • les cultures à grande échelle en photobioréacteurs posent donc davantage de problème

Le choix de la méthode de production de biomasse de microalgues dépend donc des caractéristiques de la souche sélectionnée (notamment le taux de lipides, souche photo-autotrophe ou hétérotrophe) et de l'adéquation avec les procédés industriels en aval.

Bien évidemment tous les paramètres physico-chimiques (pH, température, apport de CO2, salinité de l'eau, sources d'azote, intensité lumineuse, ...) entrent en ligne de compte.

c. La récolte des microalgues

Les méthodes de récolte sont :

  • filtration
  • sédimentation
  • centrifugation

Chacune présente des avantages et des inconvénients.

Quelle que soit la méthode, elle est souvent précédée d'une flocculation (formation d'aggrégats à partir des cellules dispersées). Les microalgues ont un diamètre de 3 à 30 μm.

Pour des raisons de côut et d'énergie, la récolte se fait souvent en 2 étapes (concentration à 2 - 7% puis concentration à 15 - 25% ).

d. Extraction des huiles des microalgues

C'est une étape critique dans le processus global de la production de biofuel. Quatre méthodes existent :

  • presse
  • extraction à l'hexane
  • extraction à l'eau à l'état subcritique
  • extraction avec des fluides supercritiques

Parmi les différentes méthodes, on peut citer celle qui utilise une lipase immobilisée et le dioxyde de carbone à l'état supercritique ("supercritical carbon dioxide" - SC-CO2) comme solvant d'extraction et milieu réactionnel (Taher et al., 2011).

Température critique du dioxyde de carbone : 31,1°C / pression critiquedioxyde de carbone : 72,8 bar.

Le dioxyde de carbone à l'état supercritique présente de nombreux avantages. En effet, c'est un solvant :

  • non toxique
  • chimiquement stable
  • peu coûteux
  • aisément séparable des produits d'hydrolyse

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10. Les modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome pour des applications industrielles et médicales

Voir un cours sur les modèles de reconstruction métabolique à l'échelle d'un génome (MRMEG).

Les MRMEG sont des outils de plus en plus performants pour exploiter les micro-organismes comme des usines cellulaires afin de produire durablement des produits chimiques et pharmaceutiques.


Quelques exemples d'applications en biotechnologies industrielles
1. Production
de Nourriture
et Ingénierie

Dans l'industrie alimentaire et celle des boissons, des MRMEG ont été développés pour étudier et améliorer la formation de sous-produits de fermentation de bactéries lactiques.
De plus, ces bactéries produisent des bactériocines, des exo-polysaccharides, des polyols, des vitamines B et des composés qui peuvent affecter la texture, le goût et la conservation de la nourriture.

Quelques exemples :

  • Lactobacillus plantarum est utilisé dans les fermentations industrielles de nourriture.
  • Streptococcus thermophilus est communément utilisé dans la production de yaourt et de fromages impliquant de hautes températures de cuisson.
  • Lactococcus lactis a des applications dans la production in situ de goût, de texture et de composants nutritifs favorables à la santé. Les MRMEG de L. lactis prédisent des modifications pour un accroissement de la production de diacétyle, un composant du goût dans les produits laitiers.
2. Production
de biofuels

a. Acétone, butanol et éthanol :

b. Les méthanogènes :

  • Methanosarcina barkeri est un méthanogène anaérobie qui convertit des substrats à faible teneur en carbone en méthane. Il peut dégrader des ordures industrielles, agricoles et toxiques contenant de grandes quantités de matière organique.
  • La production mutualisée de méthane a été étudiée avec le couple [Desulfovibrio vulgaris / Methanococcus maripaludis].
3. Applications
en bio-remédiation

La bio-remédiation profite de la capacité d'un microbe de réduire et potentiellement d'éliminer les effets toxiques de polluants de l'environnement.

  • Acinetobacter baylyi est une bactérie du sol inoffensive qui dégrade des polluants et produit des lipases, des protéases, des bio-émulsifiants, de la cyanophycine et des biopolymères.
  • Geobacter metallireducens réduit le fer ferreux (FeIII) et est utilisé dans la bio-remédiation de l'uranium, du plutonium, du technétium ... Sa capacité à produire des pili conducteur est utile pour récolter l'électricité de déchets organiques et comme biocatalyseur pour des applications de piles à combustible microbiennes.
  • Geobacter sulfurreducens a des applications industrielles semblables à G. metallireducens.
4. Organismes
photosynthétiques

Les algues marines Chlamydomonas reinhardtii sont généralement utilisées pour le biocarburant et la production debio-hydrogène.

Halobacterium salinarum est une archée halophile extrême capable de survivre avec la lumière comme seule source d'énergie. Elle produit de la bactério-rhodopsine (une pompe à proton dont l'énergie provient de la lumière), seule structure connue capable d'effectuer une photosynthèse non-chlorophyllienne. La bactério-rhodopsine a des applications dans la sécurité optique, le stockage de données optiques et la création d'hologramme. H. salinarum peut aussi conserver l'énergie (comme une batterie) en utilisant un fort gradient de potassium.

Synechocystis sp. est une cyanobactérie d'eau douce. C'est un organisme potentiellement producteur de biocarburant qui pourrait convertir le CO2 en produits à base de carbone.


Quelques exemples d'applications en biotechnologies médicales
1. Production de
médicaments et
de nutriments

Des MRMEG ont été développés pour Mannheimia succiniciproducens et pour Corynebacterium glutamicum pour optimiser leur production de succinate.
Corynebacterium glutamicum est utilisée dans l'industrie pour produire des acides aminés (en particulier la L-lysine et le L-glutamate). Ce micro-organisme peut aussi produire de l'éthanol et des acides organiques en conditions anaérobies.

Bacillus subtilis est l'un procaryotes les mieux caractérisés. C'est un organisme important sur le plan industriel : en effet, il est capable de produire des antibiotiques, des enzymes de haute qualité et des protéines, des nucléosides et des vitamines.

Streptomyces coelicolor produit aussi des antibiotiques, ainsi que des métabolites secondaires tels que les immuno-suppresseurs et des agents anticancéreux. Il a été montré expérimentalement chez diverses souches de Streptomyces, qu'accroître l'approvisionnement en métabolites primaires (ceux directement impliqués dans le fonctionnement cellulaire et la croissance) - via une diminution du flux des voies métaboliques primaires - conduit à une augmentation de la production de métabolites secondaires (exemples : acétate, acétaldéhyde, éthanol, formiate, proline, ...).

2. Détection de
cibles
anti-pathogènes

Les MRMEG appliqués aux pathogènes ont principalement pour but d'identifier des cibles thérapeutiques qui inhiberaient ceratines fonctions cellulaires.
Par exemple, la modélisation de Staphylococcus aureus, une bactérie qui infecte plusieurs régions du corps, a pour but d'élucider l'origine de sa résistance aux antibiotiques (maladies nocosomiales) et d'identifier de nouvelles cibles pour des médicaments.

a. Pathogènes respiratoires

  • Haemophilus influenzae provoque des otites mais aussi des infections aigus et chroniques des voies respiratoires.
  • Mycobacterium tuberculosis est à l'origine de maladies humaines dans le tiers monde, tuant plusieurs millions de personnes par an.
    2 MRMEG ont été développés en 2007 pour M. tuberculosis : GSMN-TB ("Genome-Scale Metabolic Network of M. tuberculosis") et iNJ661.
  • Pseudomonas aeruginosa forme des bio-films dans un environnement pauvre en oxygène : c'est l'une des causes d'infections chroniques des poumons de patients atteints de fibrose kystique.

b. Pathogènes gastro-intestinaux

c. Pathogènes qui infectent d'autres systèmes

  • Neisseria meningitidis provoque la méningite et la septicémie méningococcique.
  • Yersinia pestis infecte le système lymphatique et provoque la peste bubonique, une maladie sans vaccin qui touche des milliers de personnes chaque année.
  • Leishmania major (protozoaire) : agent de la leishmaniose cutanée chez les mammifères
  • Mycoplasma genitalium : sexuellement transmissible et qui provoque des urétrites non gonococciques chez les hommes, des maladies inflammatoires de l'appareil génital chez les femmes.
  • Les pathogènes oraux pour l'homme comme Porphyromonas gingivalis sont la principale cause de maladies carieuses et parodontales. Les lipopolysaccharides présents dans la membrane externe bactérienne activent le système immunitaire humain. Un MRMEG développé pour P. gingivalis a identifié plusieurs déletions de gène empêchant la production de ces lipopolysaccharides.

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11. Synthèse "artificielle" et ingénierie

a. Les acides nucléiques artificiels - "synthetic genetics"

La capacité chimique à synthétiser des oligomères d'ADN couplés a des procédures enzymatiques pour l'assemblage de gènes et leur amplification semble une source d'innovation et d'évolution apparemment inépuisable.

L'implantation des constructions d'ADN synthétiques qui en résultent dans des chromosomes et des épisomes de micro-organismes et de plantes (pour des application dans l'agriculture, l'énergie et la chimie) a engendré une prolifération de séquences génétiques artificielles.

Dans la littérature, le terme XNA (acides nucléiques xeno - terme proposé par Herdewijn & Marlière) décrit ces polymères génétiques synthétiques.

Les modifications de la structure chimique tripartite des acides nucléiques, avec des dérivés des bases azotées, du squelette carboné et du ribofuranose sont possibles. Certains de ces produits peuvent former des duplex d'acides nucléiques, peuvent être utilisés pour le stockage de l'information. Ils pourraient aussi avoir des implications dans l'évolution.

  • La première séquence d'acide nucléique conçue et construite pour être propagée in vivo a été un gène synthétique de 77 bases codant un suppresseur d'ARNt. Il a été inséré, répliqué et exprimé dans des cellules de levure (Khorana, 1971).
  • En 2008, un chromosome bactérien complet de 582970 paires de bases a été synthétisé par étapes d'assemblage hiérarchique dans des chromosomes artificiels de procaryotes puis d'eucaryotes. Ce chromosome synthétique devrait maintenant s'emparer de la commande génétique d'une bactérie : Mycoplasma genitalium.
  • 2013 : la technologie de stockage de l'information de demain ? Codage de 2 images, de 26 secondes du discours de M. Luther-King et de l'article de Watson et Crick dans de l'ADN : conçu, vérifié, synthétisé puis décrypté sans erreur (Goldman et al., 2013). Une possibilité de stockage quasi sans limite, moins chère, moins coûteuse en énergie et peut-être plus fiable que n'importe quel support physique ?

b. Machine "artificielle" de synthèse peptidique

Les ribosomes synthétisent les protéines en polymérisant (liaison peptidique) les acides aminés dans un ordre déterminé par les ARN messagers.

Des chercheurs ont créé une "machine artificielle de synthèse peptidique" : elle se déplace le long d'un chapelet de molécules, ramasse les acides aminés qui bloquent sa trajectoire, afin de synthétiser un peptide selon une séquence spécifique.

Peptide synthesis artificial machine rotaxane biochimej

Source : Lewandowski et al. (2013)

La structure chimique est basée sur un rotaxane, un anneau moléculaire enfilé sur un axe moléculaire.

L'anneau porte un groupe thiolate qui enlève de manière itérative les acides aminés dans l'ordre codé par le brin et les transfère vers un site l'élongation du peptide par ligature chimique.

La synthèse est obtenue avec 1018 "machines moléculaires" agissant en parallèle. Le processus génère des quantités de peptide de l'ordre du milligramme avec une séquence unique confirmée par spectrométrie de masse.

c. Ingénierie du métabolisme pour la production d'acides gras oméga-3

La disponibilité des formes oméga-3 de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et de l'acide docosahexaénoïque (DHA) (deux acides gras) est actuellement limitée. En effet, actuellement ces formes sont principalement produites par l'industrie de la pêche maritime qui ne peut suivre le rythme lié à la croissance du marché pour ces produits.

Une source non animale durable d'EPA et de DHA est nécessaire.

L'ingénierie du métabolisme de la levure oléagineuse Yarrowia lipolytica a permis de construire une souche qui produit l'EPA à un taux de 15 % du poids sec. Les lipides obtenus par ingénierie représentent 56,6% d'EPA et moins de 5% en poids d'acides gras saturés, pourcentages le plus élevé et le plus bas, respectivement, de toutes les sources connues d'EPA.

L'inactivation du gène PEX10 de la biogénèse des peroxysomes était cruciale pour l'obtention de rendements élevés d'EPA et peut augmenter les rendements d'autres lipides commercialement importants.

Figure ci-dessous : schéma des voies métaboliques aérobies natives et modifiées de la biosynthèse de l'EPA.

  • la voie native chez Yarrowia lipolytica est indiquée dans le cadre gris
  • la voie Δ-9 modifiée par ingénierie et sentier pour la biosynthèse EPA est indiquée dans le cadre jaune

Fatty acid synthesis eicosapentaenoic docosahexaenoic acid engineered yeast biochimej

Source : Xue et al. (2013)

La désaturase Δ-17 a une forte activité de conversion ARA en EPA et une faible activité de conversion de l'acide linoléique (LA) en ALA, de l'EDA en ETrA et du DGLA (acide dihomo-γ-linolénique / C20:3n – 6) en ETA.

GLA : acide γ-linolénique (C18:3n – 6)
STA : acide stéaridonique


Exemples d'acides gras
Carbone Doubles liaisons Position des doubles liaisons Nom commun Nom IUPAC Point de fusion
12 0 C12:0 laurate
(acide laurique)
dodécanoate
(acide dodécanoique)
43°C
14 0 C14:0 myristate tétradécanoate 52°C
16 0 C16:0 palmitate hexadécanoate 63°C
18 0 C18:0 stéarate octadécanoate 70°C
20 0 C20:0 arachidate icosanoate 75°C
22 0 C22:0 béhénate docosanoate 81°C
24 0 C24:0 lignocérate tétracosanoate 84°C
16 1 C16:1 Δ9 palmitoléate cis9-hexadécénoate - 0,5°C
18 1 (végétaux) C18:1 Δ9 (acide gras ω-9) oléate cis9-octadécénoate 13°C
18 2 (végétaux) C18:2 Δ9,12 (acide gras ω-6) linoléate cis,cis9,12-octadécadiénoate - 9°C
18 3 (végétaux) C18:3 Δ9,12,15 (acide gras ω-3) linolénate all-cis9,12,15-octadécatriénoate - 17°C
18 4 (végétaux) C18:4 Δ6,9,12,15 (acide gras ω-3) stéaridonate all-cis6,9,12,15-octadécatétraénoate ------
20 4 (animaux) C20:4 Δ5,8,11,14 (acide gras ω-6) arachidonate all-cis5,8,11,14-icosatétraénoate - 49°C
20 5 (poisson) C20:5 Δ5,8,11,14,17(acide gras ω-3) eicosapentaénoate all-cis5,8,11,14,17-eicosapentaénoate ------
22 5 (animaux) C22:5 Δ4,7,10,13,16 (acide gras ω-6)
C22:5 Δ7,10,13,16,19 (acide gras ω-3)
acide osbond
clupanodonate
all-cis4,7,10,13,16-docosapentaénoate
all-cis7,10,13,16,19-docosapentaénoate
------
22 6 (animaux) C22:6 Δ4,7,10,13,16,19 (acide gras ω-3) cervonate all-cis4,7,10,13,16,19-docosahexaenoate - 44°C
24 6 C24:6 Δ6,9,12,15,18,21 (acide gras ω-3) nisinate all-cis6,9,12,15,18,21-tétracosahexaénoate ------

 

12. Liens Internet et références bibliographiques

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Yves Cherruault (1998) "Modèles et méthodes mathématiques pour les sciences du vivant" - P.U.F. - ISBN : 2-13-048978-8

Techniques de l'ingénieur : "Réacteurs enzymatiques et fermenteurs"

Quiz : "Génie fermentaire : culture en batch"

Wikipedia : "Industrial applications"

Biochimie agroalimentaire - Université de Lille

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"L'amidon" (trés bon site pédagogique avec des quizz)

"Enzymes Used in the Dairy Industry"

Techniques de l'ingénieur : "Senseurs chimiques et biologiques basés sur des polymères conjugués"

GEPEA : Génie des procédés - Environnement - Agroalimentaire

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