Puces à ADN : analyse de l'article de Seki et al. (2002)

Sommaire
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1. Caractéristiques et apports de l'étude

2. Obtention d'ADNc pleine longeur ("full-length cDNA")

3. Caractéristiques de la puce

4. Vérification des données issues de la puce à ADN par Northern blot

 

5. Résultats généraux

6. Exemple de résultats concernant un gène inductible par l'acide abcissique (ABA)

7. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Caractéristiques et apports de l'étude

a. Travail collossal en amont (voir Seki et al. (2001) : construction de plusieurs banques d'ADNc pleine longueur d'Arabidopsis thaliana ===> fabrication d'une puce contenant 7000 ADNc pleine longueur.

Ces ADNc pleine longueur ont été isolés à partir d'une série de banques d'ADNc obtenues (voir article p284 - "Results and discussion") :

  • avec la plante non stressée
  • avec la plante stressée après un traitement à l'ABA, au froid, à la sècheresse (déshydratation)
  • à différents stades de développement : de la graine en germination à la la graine mature

Remarques :

  • Actuellement plus de 155.000 ADNc pleine longueur (60% des gènes prédits chez Arabidopsis thaliana) dans la base de données du consortium "RIKEN".
  • RIKEN : abréviation de "RIkagaku KENkyüjo" (Centres de recherche scientifique Japonais)
  • RAFL = "RIKEN Arabidopsis Full-Length".

b. Dans cet article :

  • Ils ont étudié les effets de différents stress (voir un cours) :
    1. acide abcissique (ABA)
    2. sècheresse ("drought")
    3. froid ("cold")
    4. forte salinité ("high salinity")
  • Ils ont obtenu un profil d'expression : étude cinétique (6 temps) de 0 à 24 heures d'application de ces stress.
Résumé des conditions d'études avec les puces à ADN
Sondes fixées Cibles hybridées (ARN messagers extraits)

Plusieurs banques d'ADNc pleine longueur construites à partir d'Arabidopsis thaliana

  • dans différentes conditions de stress
  • à différents stades de développement : de la graine en germination à la graine mature

===> obtention de 7000 ADNc pleine longueur pour la fabrication des puces à ADN.

Issu d'un travail préliminaire ===> voir Seki et al. (2001).

ARN messagers d'Arabidopsis thaliana (3 semaines de culture)

  • isolés après application de différents stress
  • à différents temps d'application ===> étude cinétique

Voir article p 283 - "Materials and methods".

c. Travail exigeant : seuls les gènes ayant un rapport d'expression supérieur à 5 [(log2(r)] sont analysés.

d. Travail trés précieux pour la communauté scientifique :

  • fabrication de puces à ADNc pleine longueur
  • analyse des effets croisés de 4 stress abiotiques
  • étude cinétique (6 temps) : variation du taux de transcription en fonction du temps
  • étude directe ou indirecte de séquences de promoteurs et de séquences de régulation post-transcriptionnelle par comparaison à des séquences d'ADNc pleine longueur et des séquences des gènes d'Arabidopsis thaliana
  • identification de 22 gènes codant des facteurs de transcription régulant la transcription de gènes impliqués dans des voies de transduction du signal de l'ABA
  • éléments de description des interactions entre les gènes impliqués dans les voies de signalisation liées aux stress étudiés
  • ensemble des données compilées, stockées et accessibles dans la base de données du consortium "RIKEN"

Principaux résultats de cette étude

1. Plusieurs mécanismes de la régulation de la transcription sont impliqués dans la voie de transduction du signal de l'ABA.

2. Il y a :

  • davantage de points communs entre les gènes impliqués dans la voie de signalisation de l'ABA et ceux liées à la sécheresse et à une forte salinité
  • qu'entre la voie de signalisation de l'ABA et celle liée au froid

L'acide abcissique ("abscisic acid" - ABA) a été identifié en 1963 par F. Addicott et ses collaborateur, à partir des feuilles de cotonnier.

C'est une hormone végétale synthétisée par les racines ou les feuilles (à l'intérieur des plastes).

Structure : sesquiterpène - terpène dérivé de l'isoprène, composé en C15.

Acide abcissique

Exemples de rôles physiologiques de l'ABA

  • inhibition de la germination des graines
  • inhibiteur général de la croissance cellulaire
  • régulation de la dormance des bourgeons et des graines
  • régulation de l'abscission des feuilles, des fleurs et des fruits
  • régulation du fonctionnement des stomates en situation de stress

Figure ci-contre : Illustration du rôle de l'ABA dans l'ouverture de canaux ioniques.

Source : Raghavendra et al. (2010)

Canal ionique ABA

Autres rôles de l'ABA

L'ABA est un messager capital de nombreuses voies de transduction du signal en réponse à des stress biotiques et abiotiques (exemple : limiter le stress hydrique en période de sécheresse).

Figure ci-contre : Rôle de l'ABA dans la régulation de la transcription de gènes (activation de facteurs de transcription de type ABI).

Source : Raghavendra et al. (2010)

Role ABA transcription

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2. Obtention d'ADNc pleine longeur ("full-length cDNA") (Carninci et al. - 1996)

Un groupe biotine est fixé sur les groupes diol de la coiffe 5' et de l'extrémité 3' des ARNm. Cette fixation est faite en 2 étapes.

coiffe ADNc pleine longeur

Biotine ADNc pleine longeur

(A) Le premier brin d'ADNc est synthétisé.

La RNAse I hydrolyse les ARN simple brin mais pas les hybrides ARNm / ADNc. La RNAse I enlève les groupes biotine :

  • de l'extrémité 3' de la queue poly(A) de tous les ARNm non protégés par l'amorce pour la transcription inverse
  • de la coiffe 5' des hybrides dont le premier brin ADNc est incomplet

Synthese d'ADNc

(B) Capture des ADNc pleine longueur par des billes magnétiques recouvertes de streptavidine.

Récupération des ADNc fixés aux billes par digestion des ARNm par la RNAse H.

Hybridation d'amorces oligo(dG) au premier brin d'ADNc pour la synthèse du second brin d'ADNc et hybridation avec les adaptateurs.

Capture ADNc

 

 

(C) Synthèse du second brin d'ADNc.

Coupure par les enzymes de restriction XhoI et SacI.

Clonage dans le vecteur Lambda Zap II.

Synthese second brin ADNc

Intérets des ADNc pleine longueur

La comparaison des séquences d'ADNc pleine longueur d'Arabidopsis thaliana (ou de n'importe quel organisme) avec les séquences génomiques (mais aussi les données d'EST) permet :

  • d'obtenir des informations directes ou indirectes sur la structure d'un trés grand nombre de gènes :
    1. séquence codante complète
    2. régions non traduites en 5' et en 3' contenant des séquences d'éléments de régulation post-transcriptionnelle agissant en cis (action d'une molécule sur elle-même) et/ou contenant des motifs de fixation de facteurs agissant en trans.
    3. UTRdb : base de données de régions 5' et 3' non-traduites d'ARNm d'Eucaryotes.
  • d'améliorer l'annotation du génome.
  • Voir un article

Autre intéret d'ADNc pleine longueur : il y a peu d'hybridation croisée ("cross-hybridization") avec des pseudogènes.

Figure ci-contre : schéma simplifié d'un gène Eucaryote et d'un transcrit issu de ce gène.

Les régions non traduites ("UnTranslated Regions") en 5' (5'-UTR) sont davantage conservées entre différentes espèces et ne changent pas beaucoup au sein d'une famille de gènes.

A l'inverse, les régions 3'-UTR sont caractérisées par une plus faible conservation entre différentes espèces.

ADN ARN RNA protein gene messenger ribosome transfert traduction methylguanosine intron exon polyA coiffe cap enhancer silencer tata box promoter promoteur protein synthesis


Eléments agissant en "cis" : séquences consensus de l'ADN située en amont des sites d'initiation de la transcription. Exemple : l'opéron lac.

procaryotes

région -10 ou boîte Pribnow (10 nucléotides avant le site d'initiation de la transcription)
région -35
séquence "opérateur" de l'opéron lactose

TATAAT
TTGACA
-----------

eucaryotes région -10 ou boîte Goldberg-Hogness ou "TATA box" TATAAT
Eléments agissant en "trans" (action d'une molécule sur une autre) : ce sont les facteurs de transcription (protéines) qui se fixent sur ces séquences d'ADN (les éléments agissant en "cis") .

Applications des ADNc pleine longueur

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3. Caractéristiques de la puce

Les 7000 ADNc pleine longueur d'Arabidopsis thaliana déposés sur la puce ont été isolés à partir d'une série de banques d'ANc obtenues (voir article p284 - "Results and discussion") :

  • avec la plante non stressée
  • après un traitement à l'ABA, au froid, à la dessication (déshydratation)
  • et ce, à différents stades de développement (de la germination à la la graine mature)
contrôles positifs ADNc issus des gènes rd et erd gènes d'Arabidopsis thaliana inductibles par la dessication
contrôle interne séquence d'ADN amplifiée par PCR fragment d'ADN du phage lambda
contrôles négatifs fragment d'ADN du gène d'un récepteur nicotinique de la souris (nAChRE)
fragment d'ADN du gène d'un homologue du recepteur de glucocorticoïde de souris
ADN sans aucune homologie avec une quelconque séquence d'Arabidopsis thaliana qui permet d'évaluer toute hybridation non spécifique.

L'intensité de chaque spot reflète le niveau d'expression de chaque gène.

  • contrôle positif : le gène rd29A dont l'expression est induite par le froid donne un signal rouge.
  • contrôle interne (niveau d'expression identique dans toutes les conditions) : le fragment d'ADN du phage lambda (ou de la tubuline dans l'exemple ci-contre) donne un signal jaune.
  • contrôle négatif : aucun signal n'est détecté pour le gène de la souris nAChRE. Aucune cible ne s'est hybridée, le spot est noir.

Intensite de fluorescence puce ADN

Source : Seki et al. (2001)

Ces témoins permettent le calcul des rapports d'intensité de fluorescence (IF) puis la valeur [(log2(r)] entre la condition normale (non stressée) et la condition de stress.

Par exemple, le rapport dans le cas de la dessication est calculé de la manière suivante :

IF de chaque spot d'ADNc en condition de dessication
----------------------------------------------------------------------------------
IF de chaque spot d'ADNc en condition normale
.
---
.
IF du spot d'ADN du phage lambda en condition de dessication
-------------------------------------------------------------------------------------------------
IF du spot d'ADN du phage lambda en condition normale

Le marquage des cibles consiste en l'incorporation de nucléotides portant :

  • soit le fluorophore cyanine 3 (Cy3™) sous forme de Cy3-dUTP
  • soit le fluorophore cyanine 5 (Cy5™) sous forme de Cy5-dUTP

Ces 2 molécules sont les plus classiquement utilisées.

cyanine nom longueur d'onde émission fluorescence couleur
Cy3™ indodicarbocyanine 3-1-O-(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)-phosphoramidite 563 - 570 nm vert
Cy5™ indodicarbocyanine 5-1-O-(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)-phosphoramidite 662 - 670 nm rouge

MMT : groupe 4-monomethoxytrityle

Source : Amersham Biosciences Limited

cyanine 3

cyanine 5

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4. Vérification des données issues de la puce à ADN par Northern blot

Les gènes dont le rapport d'augmentation d'expression (par exemple : dessication / non stressé) est supérieur à 2 fois celui du contrôle positif sont réputés inductibles par le stress considéré.

La seule manière de confirmer ce genre de résultat est de faire un Northern blot à partir des ARNm correspondants aux ADNc candidats.

Parfois, les résultats ne concordent pas et les "faux-positifs" issus de la puce à ADN peuvent être dûs aux biais suivants :

  • une faible expression des gènes considérés
  • un bruit de fond élevé
  • de la poussière sur le spot de la puce
  • des cibles de mauvaise qualité

Figure ci-contre, comparaison des données issues de la puce à ADN et des résultats du Northern blot.

Conditions testées :

  • témoin non stressé
  • 2 temps de dessication et de froid (2h et 10h)
  • gène induit par un stress et sous le contrôle du facteur de transcription 35S: DREB1A (promoteur CaMV 35S de plantes transgéniques)

Les rapports d'augmentation d'expression sont indiqués en dessous de chaque autoradiographie.

Voir N° accession GenBank : AB044404 - cold acclimation protein WCOR413

Comparaison puce ADN et Northern blot

Source : Seki et al. (2001)

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5. Résultats généraux

Diagramme de John Venn (1834-1923) : schémas géométriques utilisés pour représenter des relations logico-mathématiques.

Exemple : 245 gènes induits par l'ABA = 41 gènes + 71 gènes + 19 gènes + 114 gènes

Diagramme de Venn


stress nombre de gènes dont l'expression augmente nombre de gènes dont l'expression diminue
Nomenclature des ADNc de RIKEN (RAFL : "Riken Arabidopsis Full-Length"): RAFL XX - YY - LettreZZ
ABA

245 gènes
22 codent pour des facteurs de transcription : 1 de la famille DREB / 2 - famille ERF / 5 - famille doigt de zinc / 1 - famille WRKY / 3 - famille MYC/MYB / 1 - famille bHLH / 4 - famille NAC / 2 - famille homéodomaine / 2 - famille bZIP / 1 - autre famille

34
dessication 54 77
froid 299 70 (ou 79 ? - article p. 290)
forte salinité 213 79 (ou 70 ? - article p. 290)

Les facteurs de transcription impliqués dans la réponse aux stress

Chez Arabidopsis, on en dénombre plus de 2000 (> 7% du protéome).

Ils font partie des 58 familles suivantes :

  • AP2/EREBP
  • ABI3/VP1
  • ARF
  • bHLH
  • bZIP
  • HB
  • HSF
  • MYB
  • NAC
  • WRKY

Facteurs transcription lies aux stress

Source : Stress responsive TranscrIption Factor Database

Exemples de bases de données de facteurs de transcription spécifiques des plantes :

  • DATF ("Database of Arabidopsis Transcription Factors")
  • STIFDB ("Stress responsive TranscrIption Factor Database")
  • PlantTFDB ("Plant Transcription Factor Database")

Modele général de la réponse aux stress abiotiques chez les plantes

Les cellules des plantes reçoivent des signaux via maints "senseurs" (peu ou pas encore connus) et ces signaux sont transduits via de nombreuses voies de signalisation dans lesquelles interviennent des hormones, des transducteurs du signal, des régulateurs de la transcription, ...

Les gènes inductibles par les stress sont directement régulés par de nombreux signaux de stress.

Certains gènes inductibles par les stress sont régulés par des facteurs de transcription ("TFs" dans la figure ci-contre) dont l'expression est elle-même induite par les stimuli liés aux stress (cascade de transcription).

Source : Hirayama & Shinozaki (2010)

Stress abiotique plantes

Certains gènes inductibles par les stress codent des protéines dont la fonction est directement impliquée dans la tolérance aux stress.

Certains gènes inductibles par les stress codent des protéines régulatrices (comme les transducteurs du signal) qui, trés probablement, sont impliquées dans des boucles de contrôle en amont ou des boucles de rétro-contrôle ("feedback positive / negative") de la réponse aux stress.

L’épigénétique (figure ci-dessus) est un système de régulation fondamental, au-delà de l’information contenue dans la séquence d'ADN, puisqu'elle étudie les modifications, transmisssibles entre générations et réversibles, de l'expression des gènes sans qu'il y ait altération des séquences (modification et maintien de l’expression d’un gène sans modification de l’ADN).

Quelques exemples de familles de facteurs de transcription

- Famille AP2 (APETALA2) / EREBP ("ethylene-responsive element binding proteins") : ils sont spécifiques des plantes. Ils contiennent un domaine de fixation à l'ADN appelé AP2. La sous-famille de facteurs de transcription DREB ("dehydration responsive element binding proteins") fait partie de cette famille.

- Famille bZIP ("basic leucine zipper") : leur nom vient du fait qu'ils contiennent un domaine de fixation à l'ADN mixte constitué d' une séquence en acides aminés basiques et d'un motif riche en leucine à intervalles réguliers ("leucine zipper"). Les facteurs de transcription GBF1, GBF2 et GBF3 ("Arabidopsis bZlP family of G-box binding factors") intéragissent avec le motif palindrome "G-box" (CCACGTGG) trouvés dans de nombreux promoteurs de plantes.

- Famille HSF : ("heat shock transcription factor") : ils sont trimériques avec un domaine de fixation à l'ADN qui reconnaît la séquence répétée (nGAAn) et un domaine impliqué dans l'oligomérisation. Ils sont impliqués dans la réponse dite "de choc thermique" et la synthèse d'HSP ("heat shock proteins"). Il existe 3 classes (A, B et C).

Ces facteurs de transcription sont organisés en modules fonctionnels comme le facteur de transcription AtHsfA2 de Arabidopsis.

- Famille WRKY : ils sont ainsi nommés parce qu'ils possèdent un domaine de fixation à l'ADN (du côté N-terminal) qui contient, une ou deux fois, la séquence en acides aminés (quasi invariante) WRKY.

Ils sont classés en fonction du nombre de motif WRKY et de leur motif "zinc-finger-like" : Cx[4,5]Cx[22,23]HxH ou Cx7Cx23HxC.

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6. Exemple de résultats concernant un gène inductible par l'ABA - RAFL cDNAs : "RIKEN Arabidopsis Full-Length cDNAs"

Aller à : RIKEN Database

Choisir "Search Microarray Data" (fenêtre de gauche).

Taper "RAFL09-13-A04" dans la fenêtre.

Item "Select the Experiment", cocher "ABA".

gne Arabidpsis inductible par l'ABA

Tableau de résultats :

"Clone Name" : cliquer sur le lien "RAFL09-13-A04".

Cliquer sur le lien : "View Genome Map".

Carte genome

Locus TAIR : AT1G08920

ARNm : AF367260

Ontologie :

"biological process : involved in monosaccharide transport, response to abscisic acid stimulus, response to salt stress, response to water deprivation".

"cellular component : located in membrane, plant-type vacuole membrane".

"molecular function : has carbohydrate transporter activity" - accession : GO:0015144

proteine de transport du sucre

L'ensemble correspond à la signature d'une protéine de transport du sucre, riche en hélices transmembranaires.

Accession : AAK56249

 

7. Liens Internet et références bibliographiques

Plant Promoter Database

Database of Orthologous Promoters

The Database of Arabidopsis Transcription Factors

AthaMap : genome-wide map of potential transcription factor and small RNA binding sites in Arabidopsis thaliana

Arabidopsis Gene Regulatory Information Server

Plant TFDB : Plant Transcription Factor Database

DATF: Database of Arabidopsis Transcription Factors

STIFDB : Stress responsive TranscrIption Factor Database

PPdb

DoOP

DATF

AthaMap

AGRIS

PlantTFDB

DATF

STIFDB

Seki et al. (2002) "Monitoring the expression pattern of around 7,000 Arabidopsis genes under ABA treatments using a full-length cDNA microarray" Funct. Integr. Genomics 2, 282 - 291
Carninci et al. (1996) "High-efficiency full-length cDNA cloning by biotinylated CAP trapper" Genomics 37, 327 - 36

Seki et al. (2001) "Monitoring the Expression Pattern of 1300 Arabidopsis Genes under Drought and Cold Stresses by Using a Full-Length cDNA Microarray" Plant Cell 13, 61 - 72

Raghavendra et al. (2010) "ABA perception and signalling" TIBS 15, 395 401

Article

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