L'interférence ARN - ("RNA interference" - RNAi) - siRNA & miRNA
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1. Introduction

2. Bref historique de la découverte de l'interférence ARN

3. Les siRNA ("small interfering RNA")

4. Les miRNA ("micro RNA")

5. Le complexe Drosha - Pasha (DGCR8)

6. La RNAse DICER

7. Le complexe RLC ("RISC-loading complex") et le complexe RISC ("RNA-Induced Silencing Complex")

 

8. Rôles supposés des siRNA - miRNA dans l'inhibition de l'initiation de la traduction

a. Cas général

b. Mécanisme d'inhibition de l'initiation de la traduction par les miRNA

9. Structure des protéines Argonaute

10. Le domaine PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille)

11. Applications thérapeutiques de l'interférence ARN

12. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction

L'interférence ARN ("RNA interference") ou RNAi est une voie de régulation du taux d'ARN messagers traduits ou plus précisément de l'expression post-transcriptionnelle des gènes.

Appellations historiques :

  • "cosuppression" chez le pétunia
  • "post transcriptional gene silencing" chez les plantes
  • "quelling"chez les Fungi
  • "RNA interference" (Fire & Mello)

Andrew Fire et Craig Mello ont obtenu le Prix Nobel en 2006 pour l'explication des bases de ce mécanisme ("RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA") chez le nématode Caenorhabditis elegans (travaux publiés en 1998).

Le mécanisme de l'interférence ARN :

  • a été probablement sélectionné au cours de l'évolution pour prémunir les cellules contre l'introduction de gènes (en particulier de virus ou de transposons). Il permet également de nettoyer la cellule d'ARN messagers (ARNm) non fonctionnels.
  • s'est avéré très utile pour décrypter la fonction de gènes chez le nématode puis chez d'autres organismes, notamment les mammifères (Elbashir et al., 2001).

Deux types de petits ARN jouent un rôle central dans le mécanisme de l'interférence ARN:

a. Les siRNA ("small interfering RNA") ou petits ARN interférents :

  • ils sont soit d'origine externe à la cellule cible (ARN double brin exogène de virus), soit propres à la cellule (ARN double brin endogène).
  • ils sont impliqués, entre autre, dans le contrôle de la mobilité des transposons.
  • ils ont une complémentarité parfaite avec la séquence de l'ARNm cible : ils induisent une inhibition (répression) de la transcription par modification de la chromatine ou ils induisent le clivage de l'ARNm cible.

b. Les miRNA ("micro RNA") ou micro ARN :

  • ils sont codés par le propre génome de la cellule (ARN non-codant endogène).
  • ils sont impliqués dans la régulation de la transcription des gènes au niveau post-transcriptionnel. Chez l'homme, on estime que au moins 30% des gènes sont régulés par des miRNA.
  • si ils ont une complémentarité parfaite avec la séquence de l'ARNm cible : ils induisent une inhibition (répression) de la transcription ou ils induisent le clivage de l'ARN messager cible.
  • si ils ont une complémentarité imparfaite avec la séquence de l'ARNm cible : ils induisent une inhibition (répression) de la traduction de l'ARNm cible.

D'autres types de petits ARN interférant jouent des rôles importants dans la régulation de l'expression des gènes. On peut citer :

  • les pi-RNA ("PIWI-associated RNA"), spécifiques semble-t-il des animaux, impliqués dans la suppression de transposons. Ils ont une longueur de 25 à 30 nucléotides et leur formation ne dépend pas de l'enzyme DICER (voir ci-après).
  • les nat-siRNA ("Natural antisense short interfering RNA"). Ils ont une longueur de 21 à 24 nucléotides. Ils sont générés à partir d'ARN messagers complémentaires puis transformés en siRNA.
  • d'autres petits ARN, dont certains ont des structures plus complexes ou sont issus de la conception assistée par ordinateur ("design") :
    1. si-siRNA ("small internally segmented siRNA")
    2. dg-siRNA ("double-guide siRNA")
    3. ta-siRNA ("trans-acting siRNA")
    4. hc-siRNA ("heterochromatic siRNA" )
    5. ra-siRNA ("repeat-associated siRNA")
    6. e-siRNA ("enzymatically prepared siRNA")
    7. a-iRNA ("asymmetric interfering RNA")
    8. a-miRNA ("artificial miRNA") et ss-siRNA ("single-stranded short interfering RNA") : voies prometteuses pour des applications cliniques de l'interférence ARN
    9. ...

Voir l'algorithme pour la synthèse de shRNA ("short hairpin RNA") ou de a-miRNA ("artificial miRNA").

Enfin on peut mesurer l'importance de l'interférence ARN et de ses conséquences dans divers domaines (thérapie, amélioration des plantes, ...) en considérant le nombre de bases de données qui ont trait aux siRNA, miRNA, ...

Schéma ci-dessous : ensemble des mécanismes qui aboutissent à l'interférence entre un ARN simple brin dit interférant (ARNi) avec un ARN messager (ARNm) spécifique.

On aboutit à 2 cas de figure :

  • soit la traduction de l'ARNm cible est inhibée
  • soit l'ARNm est dégradé

Dans les 2 cas, le taux de protéine synthétisée est diminué.

biochimej Voie des ARN interferents RNAi siRNA

Source figure : Qiagen

Les ARN et les petits ARN ("small RNAs" : snRNA, snoRNA, siRNA, miRNA, piRNA, ...) de 20 à 30 nucléotides. Ils participent à divers mécanismes génétiques, physiologiques et métaboliques.

biochimej Petits ARN snRNA snoRNA siRNA miRNA piRNA Piwi interacting RNA

Source : Buckingham S. (2003)

  • sRNAdb : small non-coding regulatory RNAs database for gram-positive bacteria
  • BSRD : Bacterial Small Regulatory RNA Database
  • PsRobot : A web-based plant small RNA meta-analysis toolbox

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2. Bref historique de la découverte de l'interférence ARN

En 1990, Napoli, Lemieux & Jorgensen ont été les premiers à décrire un phénomène d'interférence ARN, sans savoir qu'il s'agissait de ce mécanisme.

L'objectif de leur étude était de déterminer si la chalcone synthase (CHS), une enzyme clé de la biosynthèse des flavonoïdes, est l'enzyme limitante dans la voie de biosynthèse de l'anthocyanine à l'origine de la coloration violette profonde du pétunia.

biochimej petunia RNA interferent siRNA miRNA

Ils ont donc surexprimé la CHS en introduisant dans des pétunias un transgène codant une CHS exogène. Etonnament, 42% des pétunias ont blanchi.

Le niveau de [CHS endogène + CHS introduite] était 50 fois inférieur au niveau de CHS du pétunia de type sauvage.

Cette observation les a menés à émettre l'hypothèse que le transgène était un co-suppresseur ("cosuppressing") du gène CHS endogène.

Le terme "quelling" (étouffement) vient de Romano et Macino (1992) quand ils ont décrit un phénomène identique chez Neurospora crassa.

Les techniques utilisant les ARN antisens pour inhiber la transcription d'un gène firent leur apparition. Un ARN antisens est un ARN complémentaire d'un ARN messager : l'association ARN antisens - ARN messager bloque donc la traduction de l'ARN messager. En 1993, Lee et al. ont montré qu'un petit ARN de Caenorhabditis elegans, LIN-4, régule le déroulement du développement en se fixant à une cible ARN messager, empêchant ainsi sa traduction.

En 1994, Wassenegger et coll. montrèrent que l'introduction d'ARN double brin chez Arabidopsis thaliana méthyle l'ADN correspondant.

En 1998, Fire, Mello et al. ont pensé à la présence de contaminants ARN double brin dans les expériences précédemment décrites.

Ils ont donc fait l'hypothèse que l'élément clé n'est pas l'ARN simple-brin ("single-strand RNA" - ssRNA), mais l'ARN double-brin ("double-strand RNA" - dsRNA).

biochimej Figure article Fire 1998 RNA interferent siRNA miRNA

Source : Montgomery, Xu & Fire (1998)

En travaillant avec le ver nématode C. elegans, ils ont purifié des ssRNA sens et antisens et ont comparé leurs effets à ceux de dsRNA sur le gène unc-22 : l'effet des 2 types de ssRNA a été systématiquement 10 à 100 fois moins efficace que celui du dsRNA.

Le ssRNA sens était efficace uniquement s'il était injecté dans l'animal, suivi de l'injection du ssRNA antisens (et inversement), suggérant que l'hybridation des 2 types de ssRNAs pour former le dsRNA avait lieu in vivo.

Les articles de Fire, Mello et al. publiés en 1998 ont été les premiers à expliquer l'atténuation de l'expression de gènes endogènes.

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L'existence d'intermédiaires dans le mécanisme d'interférence ARN a été suggérée par Hamilton et Baulcombe en 1999. Bien que l'on pensait que le dsRNA devait se dérouler pour que le brin antisens puisse se fixer à l'ARNm, ce brin antisens pleine longueur n'a jamais été découvert. Hamilton et Baulcombe ont donc cherché des formes plus courtes du brin antisens issues du dsRNA. Ils ont émis l'hypothèse que l'ARN antisens sert de guide en se fixant à l'ARN messager cible, induisant ainsi sa dégradation.

Quand Hamilton et Baulcombe ont détecté des brins antisens d'une longueur d'environ 25 nucléotides, ils ont suggéré que cette longueur était nécessaire pour la spécificité du mécanisme RNAi.

L'année suivante, deux équipes ont constaté que des ARN de 21 à 23 nucléotides co-purifaient systématiquement par fractionnement, indiquant que le dsRNA est clivé en intermédiaires plus courts : les petits ARN interférant ("small interfering RNAs") ou siRNAs capables de se fixer à leur cible ARNm homologue, conduisant à la dégradation du transcrit.

En 2000, on a montré que siRNA et miRNA ne sont pas une particularité du ver nématode (ARN lin-4 - nécessaire au passage du dernier stade larvaire au stade adulte, en identifiant un second petit ARN, let-7, hautement conservé (champignons, plantes, mouche, homme, ...), de même que sa longueur - environ 21 nucléotides (Pasquinelli et al., 2000).

Il semblait improbable que le mécanisme RNAi existe chez les vertébrés puisque l'introduction d'ARN dans les cellules de mammifères déclenche une forte réaction antivirale non spécifique, la réponse interféron. En 2001, Elbashir et al. publient un article qui montre que le phénomène existe chez les mammifères.

La mise en évidence de l'interférence ARN chez la drosophile a démontré l'existence d'un complexe protéique qui catalyse la séparation des deux brins de l'ARN interférant : le complexe appelé "RNA-Induced Silencing Complex" ou RISC (Hammond et al., 2000).

biochimej Chronologie RNA interferent siRNA miRNA

Source : Invitrogen

L'endoribonucléase DICER fût décrite pour la première fois en 2001 par Bernstein et al.

L'existence d'autres miRNAs fût confirmé en 2001. Des milliers ont depuis été identifiés (voir les bases de données) .

L'interférence ARN est un mécanisme ancéstral, antérieur à la divergence plantes - ver dans l'évolution. C'est un mécanisme utilisé par les virus pour utiliser la machinerie des cellules hôtes.

Voir une belle animation de la revue "Nature".

Figure ci-dessous : comparaison de divers de mécanisme d'extinction de gène ("gene silencing").

biochimej Comparison of gene silencing strategies

Source : NCBI

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3. Les siRNA ("small interfering RNA")

Précurseurs des siRNA

a. Les long dsRNA ("long double-stranded RNA") : longs ARN double brin parfaitement complémentaires de plus de 200 nucléotides.

Ils peuvent avoir pour origine des séquences répétées - inversées, être issus de la transcription de transgènes ou de transposons.

A l'inverse, ils peuvent être synthétisés par des RNA polymérases RNA-dépendantes qui copient les ARN simple brin.

biochimej Long dsRNA siRNA RNAi interference ARN

Source : Khraiwesh et al. (2012)

b. Les shRNA ("short hairpin RNA") sont exprimés dans la cellule après transfection par des vecteurs viraux (plasmide, lentivirus, adénovirus, rétrovirus, ...).

biochimej shRNA siRNA RNAi interference ARN

Voir : Pan et al. (2012) "A dynamic perspective of RNAi library development" Trends Biotechnol. 30, 206 - 215

Ces précurseurs sont clivés tous les 21 à 25 nucléotides par une ribonucléase de type III appelée DICER ("éminceuse").

Les courts fragments dsRNA obtenus sont appelés petits ARN interférents ("small interfering RNA" - siRNA).

La ribonucléase DICER transfère les siRNA à un complexe multienzymatique : "RNA-Induced Silencing Complex" - RISC.

  • le brin sens du siRNA appelé passager est clivé en 9 + 12 nucléotides
  • le brin antisens appelé guide dirige le complexe RISC vers les ARNm possédant une séquence complémentaire du brin guide.
  • si le siRNA et l'ARNm cible sont parfaitement complémentaires, le complexe RISC hydrolyse l'ARNm qui n'est plus traduit en protéine.
  • si la complémentarité est partielle, l'ARNm n'est pas hydrolysé mais il y a inhibition de la traduction.

Ce mécanisme est donc lié au degré de la complémentarité des séquences [siRNA / cible ARNm] (voir la base de données "RNAi Atlas").

Par ailleurs, l'introduction de dsRNA de plus de 30 nucléotides dans des cellules mammifères active une réponse anti-virale de type interféron qui induit la dégradation non spécifique des ARNm et une réduction générale de la traduction. Rechercher de nouveaux siRNA ("design" / screening") nécessite donc que les ARN synthétisés contiennent moins de 30 nucléotides.

Les travaux de Elbashir et al. ont montré que les siRNA avec un débordement en 3' constitué du dinucléotide UU sont les plus puissants. Il faut donc trouver une séquence de 21 nucléotides dans l'ARNm cible qui commence par un dinucléotide AA. On cherche le codon d'initiation de la transcription (AUG) : toutes séquences commençant par AA (et les 19 nucléotides suivants) constituent un site cible potentiel pour les siRNA.

Modélisation - conception in silico ("design") de siRNA : voir "The RNAi web".

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4. Les miRNA (micro-RNA)

Les miRNA sont d'origine endogène : ils sont synthétisés dans le noyau sous forme de pri-miRNA ("primary-miRNA") à partir des gènes (poly-cistrons) miRNA transcrits par l'ARN polymérase II ou III.

Les pri-miRNA ont une longueur de 500 à 3000 nucléotides.

Ils ont une coiffe en 5' comme l'indique l'existence d'un site de fixation à eIF4E. Le facteur eIF2C2 ("Eukaryotic Translation Initiation Factor-2C2") participe aussi à ce processus.

biochimej Voie des ARN interferents RNAi siRNA shRNA miRNA

Source : Qiagen

Les pri-miRNA ont une structure en épingle à cheveux ("hairpin").

Les extrémités 3' et 5' des pri-miRNA sont alors clivées par un complexe enzymatique formé par Drosha (ribonucléase de type III) et DGCR8 ("DiGeorge syndrome critical region 8").

Les fragments formés (environ 60 à 70 nucléotides - structure en épingle à cheveux) sont appelés pre-miRNA.

Les pre-miRNA sont alors exportés dans le cytoplasme via les exportines 5 (chez les animaux) complexées à la guanine triphosphatase (GTPase) Ran.

La structure de la machinerie d'export [pré-miRNA / exportine 5 / RanGTP] a été obtenue en 2009.

Dans le cytoplasme, les pre-miRNA sont clivés par le complexe DICER/TRBP et la boucle de l'épingle est enlevée.

Figure ci-dessous : voies des ARN interférant : pri-miRNA, pre-miRNA, miRNA et siRNA.

biochimej Voie des ARN interferant premiRNA shRNA miRNA siRNA

Source : Qiagen

Des protéines de type hélicase associées à DICER dissocient le dsRNA en deux ARN simple brin.

On aboutit aux miRNA (21 à 24 nucléotides) qui ont une séquence partiellement complémentaire de la région 3' UTR ("UnTranslated Region") de l'ARNm cible.

Les miRNA ont 2 bases non appariées à l'extrémité 3'.

Le brin fonctionnel ou brin guide des miRNA est chargé sur le complexe RISC auquel s'associe la protéine Argonaute.

Les miRNA ont été identifiés dans tous les règnes (mammifères, drosophile, C. elegans, plantes …).

  • plus de 1000 gènes codant des miRNA ont été identifiés chez l'homme (bioinformatique, approche génétique, séquençage en masse des petits ARN dans la cellule).
  • 60% des gènes codant des protéines contiendraient des séquences cibles de miRNA à l'extrémité 3'UTR.

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siRNA et miRNA chez les plantes

Les siRNA et les miRNA des plantes interviennent dans de nombreux processus : transitions lors du développement, croissance des feuilles, polarité des organes, voie de signalisation par l'auxine, métabolisme des ARN, réponses des plantes aux stress biotiques et abiotiques, ...

La plupart des gènes miRNA :

  • sont des unités transcriptionnelles indépendantes
  • ont le motif canonique "TATA-box" en amont du site de début de transcription
  • sont transcrits par l'ARN polymérase II en pri-miRNA avec une coiffe 5′ et une queue poly-A 3'

biochimej Plant siRNA RNAi interference ARN Ago1

Source : Khraiwesh et al. (2012)

Les miRNA de plantes sont moins abondants que les siRNA.

Dans la littérature , la notation est souvent : miRNA / miRNA* pour miRNA guide / miRNA passager.

  • miRNA de plantes : 20 - 22 nucléotides
  • les miRNA sont chargés sur l'isoforme Argonaute 1 (Ago1 : miRNA-Ago1 : clivage ou inhibition de la traduction
  • une protéine SQUINT et une HSP90 interviennent dans le fonctionnement de Ago1

A ce jour, le décryptage du génome de Arabidopsis thaliana a montré qu'elle possède :

  • 6 gènes codant la RNA polymérases RNA-dépendantes (qui copient les ARN simple brin)
  • 4 gènes orthologues codant l'enzyme "Dicer-like" (DCL1 à DCL4)
  • 10 gènes codant la protéine Argonaute : voir Frank et al. (2012)

Chez la tomate, on a dénombré (Bai et al, 2012) :

  • 6 gènes codant la RNA polymérases RNA-dépendantes (SlRDR)
  • 7 gènes codant l'enzyme "Dicer-like" (SIDCL)
  • 15 gènes codant la protéine Argonaute (SlAGO)

Chez les plantes, le clivage d'un ARNm ciblé par un miRNA peut entraîner la production de siRNA dits "secondaires" qui, à leur tour, peuvent induire une interférence ARN de gène en trans.

Cette voie alternative dépend de la longueur du miRNA et de l'isoforme de la protéine AGO au sein du complexe RISC. Voir Manavella et al. (2012).

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5. Le complexe Drosha - Pasha (DGCR8)

Drosha (EC 3.1.26.3 / Uniprot : Q9NRR4 - homme, Q7KNF1 - Drosophile / PDB : 2KHX ) est une grosse ribonucléase de type III (1320 - 1380 acides aminés selon l'espèce) qui fixe les dsRNA.

Les RNAses de type III ont un motif conservé de 9 acides aminés qui est une signature de leur site catalytique. Drosha en possède deux.

Le domaine de fixation du dsRNA ("dsRNA-Binding Domain" - dsRBD") de Drosha est caractérisé par un repliement αβββα : 1 hélice α (Ser1263 à Thr1271), suivie de 3 feuillets β antiparallèles (Leu1283 à Gly1314), suivie de 1 hélice α (Ile1317 à Lys1331).

Les différents domaines d'enzymes impliquées dans l'interférence ARN.

  • Armitage et SDE3 (plantes) sont des hélicases d'ARN.
  • DCR-1 est une RNAse de type III.

biochimej Les domaines des enzymes impliquees dans l'interference ARN RNAi

Source : Meister & Tuschl (2004)

Drosha forme un complexe enzymatique (appelé "Microprocessor complex") avec DGCR8 ("DiGeorge syndrome critical region 8").

DGCR8 est une dsRBP ("dsRNA-Binding Protein") capable de fixer les fragments simple brin des pri-miRNA :

  • au sein de ce complexe, DGCR8 fonctionne donc comme un point d'ancrage nécessaire pour la reconnaissance des pri-miRNA à la jonction [dsRNA - ssRNA].
  • le domaine de fixation optimise l'orientation de Drosha pour que cette dernière clive 11 nucléotides au-delà du point de jonction afin de relarguer les pre-miRNA.

DGCR8 est connue sous le nom de Pasha chez la Drosophile et Caenorhabditis elegans.

Drosha et Pasha sont localisées dans le noyau.

biochimej Les protéines Drosha et Pasha dans l'interference ARN RNAi

Source : Krol et al. (2010)

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6. La RNAse DICER (EC 3.1.26.3)

La protéine DICER est une endoribonucléase de la famille des RNAses de type III.

DICER1 hydrolyse les pre-miRNA en miRNA et DICER2 hydrolyse les dsRNA en siRNA (de 21 à 25 nucléotides).

DICER (A8BQJ3 - 754 acides aminés) chez Gardia intestinalis contient 2 domaines RNase III et 1 domaine PAZ.

Chez l'homme, DICER (Q9UPY3 - 1922 acides aminés - 219 kDa) contient des domaines supplémentaires : un domaine hélicase, un domaine DUF283 ("Domain of Unknown Function 283") et un domaine de fixation du dsRNA ("dsRNA-Binding Domain" - dsRBD).

biochimej Structure DICER

Le domaine "hélicase" à l'extrémité N-terminale a diverses propriétés potentielles :

  • module auto-inhibiteur
  • il est nécessaire à la formation de certaines classes de petits ARN ("small RNA")
  • il établit des contacts avec les substrats pre-miRNA

Selon certains modèles, ce domaine se trouve dans l'espace à proximité de la boucle pre-miRNA et du coeur RNAse III.

biochimej Structure de DICER RNAse III domaine PAZ

Sources : Sawh & Duchaine (2012) / Lau et al. (2012)

Les domaines RNase IIIb et RNase IIIa clivent, respectivement, l'extrémité 5' et l'extrémité 3' des précurseurs RNA.

L'une des principales difficultés pour déterminer la structure exacte de DICER est sa taille : plus de 200 kDa chez la plupart des espèces.

Les modèles structuraux ne sont donc pas encore définitifs. La cryo-microscopie électronique devrait apporter de plus amples détails.

La distance entre les domaines RNAses III et PAZ est déterminée par la longueur et l'angle de l'hélice appelée connecteur ("ruler helix") (figure ci-dessous).

biochimej Structure de DICER RNAse III domaine PAZ

Source : Macrae et al. (2006)

Des cations magnésium compensent la charge négative du dsRNA et celles des acides aminés de DICER et assurent l'interaction entre la protéine et le dsRNA .

Le site actif de DICER contient une lysine qui semble intervenir dans l'hydrolyse de la liaison phosphodiester du dsRNA.

DICER2 possède une activité ATPase (domaine hélicase). L'hydrolyse de l'ATP est nécessaire pour que DICER2 clive les longs dsRNA.

biochimej Mecanisme catalytique de DICER

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7. Le complexe RLC ("RISC-loading complex") et le complexe RISC ("RNA-Induced Silencing Complex")

Du fait de leur taille, l'essentiel des informations concernant ces complexes provient de leur reconstitution in vitro à partir des protéines individuelles purifiées.

Les études structurales sont essentiellement effectuées par cryomicroscopie électronique ("negative-stain electron microscopy and single-particle analysis").


Aperçu de la composition du complexe nucléasique RLC (appelé aussi "miRNA loading complex" ou miRLC)
Drosophile Homme
  • DICER1
  • R2D2 ou R3D1
  • EIF2C2

[DICER1 / R2D2] clivent les pré-miRNA en miRNA

[DICER1 / R2D2] chargent les miRNA sur [EIF2C2 / Ago2]

  • Dicer
  • TRBP

TRBP est très similaire de Loqs (Drosophile) et de PACT (mammifères).

  • TRBP ou TARBP2 : "HIV-1 transactivation response (TAR) RNA-binding protein")
  • PACT : "Protein activator of PKR kinase"
  • PKR : "interferon-induced protein kinase R"
Les protéines R2D2, R3D1, TRBP, Loqs, PACT sont des "dsRNA-binding proteins".

Elles servent d'intermédiaires entre le domaine PAZ de DICER et le domaine PAZ de la protéine Argonaute lors de la formation du complexe RISC.


Il est difficile de résumer tous les cas de figures (Drosophile, nématode, Homme, mammifères, plantes, ...) et ce d'autant que la composition des complexes varient en fonction de la nature des précurseurs et des différentes isoformes de certaines protéines.

Par exemple, chez la Drosophile :

  • Dicer-1 (Dcr-1) avec Loqs-PB (isoforme PB de Loquacious) clivent les pre-miRNAs en miRNA qui sont chargés sur Ago1.
  • Dicer-2 (Dcr-2) clivent les précurseurs siRNA d'origine exogène et le complexe [Dcr-2 / R2D2] charge les siRNA sur Ago2.
  • Dcr-2 avec Loqs-PD (isoforme PD de Loquacious) clivent les précurseurs siRNA d'origine endogène (transfection virale).

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Formation du complexe RISC ("RNA-Induced Silencing Complex")

Le complexe RISC est composé :

  • d'une protéine de la famille Argonaute (Ago), une endonucléase qui dégrade les ARNm. Ago possède un domaine PAZ pouvant s'apparier avec le domaine PAZ de DICER via les protéines R2D2 (Drosophile), et un domaine PIWI responsable de l'activité endoribonucléase du complexe RISC.
  • d'une hélicase permettant de dissocier les siRNA ou les miRNA double brins.

Le domaine PAZ de DICER du complexe RLC interagit avec le domaine PAZ d'une protéine argonaute (Ago) via R2D2 (ou TRBP) : le duplex siRNA ou miRNA est ainsi chargé sur Ago.

biochimej Formation du complexe RISC

Le pré-complexe RISC formé est inactif.

L'activité hélicase de RISC dissocie les deux brins du siRNA ou du miRNA : seul le brin guide (complémentaire de l'ARNm cible) est conservé au sein du complexe RISC.

Le complexe RISC est alors activé (holo-RISC).

biochimej Formation activation complexe RLC RISC argonaute Ago

Source : Kim et al. (2007)

Le brin passager est dégradé par Ago en 9 + 12 nucléotides.

  • les protéines Ago2 (Drosophile) et AGO2 (homme) désapparient le duplex siRNA ou miRNA et clivent le brin passager
  • les protéine Ago1 et AGO1 désapparient le duplex mais ne clivent pas le brin passager

Le complexe RISC est ensuite dirigé par le brin guide de l'ARN interférant vers l'ARNm cible dont il est complémentaire.

Le devenir de l'ARNm cible n'est pas rigoureusement le même chez les plantes et les animaux. On peut schématiser ce devenir de la manière suivante :

a. Si les siRNA ou miRNA ont une complémentarité parfaite avec la séquence de l'ARNm cible, ils induisent :

  • soit une inhibition (répression) de la transcription par modification de la chromatine.
  • soit le clivage de l'ARN messager cible : celui-ci est clivé au centre du duplex formé entre le brin guide siRNA et le brin de l'ARNm cible à une distance de 10 nucléotides de l'extrémité 5' du brin guide siRNA.

b. Si les miRNA ont une complémentarité imparfaite avec la séquence de l'ARNm cible, ils induisent une inhibition (répression) de la traduction de l'ARN messager cible.

biochimej Degradation siRNA miRNA RNA messenger messager repression transcriptional traductional

Source : Khraiwesh et al. (2012)

biochimej Degradation siRNA miRNA RNA messenger messager repression transcriptional traductional

Source : Bratkovic et al. (2012)

Chez la Drosophile, un nouvel activateur du complexe RISC a été identifié : C3PO ("Component 3 Promoter Of RISC").

Il est lui-même constitué de 2 protéines : Translin/TB-RBP et TRAX ("TRanslin-Associated factor-X").

C3PO est une endonucléase Mg2+-dépendante qui active RISC en éliminant le brin passager clivé par Ago2.

Structures de C3PO et du complexe C3PO-Mn2+ chez l'homme : codes PDB 3PJA et 3QB5, respectivement.

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8. Rôles supposés des siRNA - miRNA dans l'inhibition de l'initiation de la traduction

a. Cas général

Les membres de la superfamille de protéines Argonaute (Ago) sont impliqués dans l'interférence ARN tant au niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel.

Il existe différentes isoformes qui n'ont pas les mêmes spécificités : Ago2 (Drosophile) et AGO2 (Homme) vs. Ago1 (Drosophile) et AGO1, 3 et 4 (Homme).

Les protéines Ago peuvent être divisées en 3 groupes :

  • celles qui fixent les siRNA (dérivés de longs dsARN précurseurs) et les miRNA (dérivés de structures endogènes en épingle à cheveux).
  • celles qui fixent les piRNA (protéines PIWI) : ARN qui sont 2'-0-méthylés à l'extémité 3'.
  • un 3ème groupe qui n'a pour l'instant été décrit que chez les nématodes.

Le complexe [Ago - siRNA] ou [Ago - miRNA] médient ensuite l'inhibition de l'initiation de la traduction de leurs ARNm cibles de plusieurs manières :

biochimej Mode d'action Argonaute sur siRNA ou miRNA

Source : Höck & Meister (2008)

a. la complémentarité du siRNA ou du miRNA (porté par l'Ago) avec l'ARNm cible est parfaite, le complexe [Ago - siRNA] ou [Ago - miRNA] clive l'ARNm (figure de gauche).

b. la complémentarité du miRNA avec l'extrémité 3' non traduite ("3' UTR") de l'ARNm cible est imparfaite, le complexe [Ago - miRNA] :

  • inhibe sa traduction par fixation du miRNA sur une région 3' non codante de l'ARNm (figure du milieu).
  • ou désadényle puis hydrolyse la coiffe ("5' cap" - m7G : 7-méthylguanine) et enfin dégrade l'ARNm cible (figure de droite).

b. Mécanisme d'inhibition de l'initiation de la traduction par les miRNA

eIF-4F est un complexe d'initiation de la traduction composé de 3 sous-unités (eIF-4E, eIF-4A et eIF-4G) et d'au moins 2 facteurs additionnels ("Poly(A)-Binding Protein" ou PABP, Mnk1 ou Mnk2).

Parmi ses rôles, eIF-4F :

  • reconnaît la coiffe et la queue poly-adénylée
  • fixe l'ARNm à la sous-unité 40S du ribosome (recutement)

Le complexe [miRNA - RISC] inhibe l'initiation de la traduction de plusieurs manières :

  • en interférant avec le facteur d'initiation de la traduction eIF-4F
  • en empêchant l'association de la sous-unité 60S du ribosome et donc la formation du complexe ribosomique 80S
  • par ailleurs, l'interaction de la protéine GW182 avec la protéine PABP ("Poly(A)-Binding Protein") qui fixe la queue poly(A), interfère avec la formation de la boucle fermée médiée par l'interaction [eIF4G - PABP]

biochimej Inhibition traduction translation ribosome elongation siRNA miRNA

Source : Fabian et al. (2010)

Le complexe [miRNA-RISC] interagit avec le complexe désadénylase CCR4-NOT1 pour la désadénylation de la queue poly(A) [noté A(n) dans la figure ci-contre].

La désadénylation requière l'interaction de la protéine GW182 avec la protéine PABP qui fixe la queue poly(A).

Après la désadénylation, la coiffe à l'extrémité 5' (m7G) est enlevé par le complexe DCP1-DCP2.

biochimej Mode d'action Argonaute sur siRNA ou miRNA

Source : Fabian et al. (2010)

Légende de la figure ci-dessus :

  • Rectangle noir : phase de lecture ouverte ("open reading frame")
  • CAF1 : "CCR4-Associated Factor 1"
  • CCR4 : "Carbon Catabolite Repression 4 protein"
  • NOT1 : "Negative On TATA-less"

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9. Structure des protéines Argonaute

biochimej Complxe Argonaute ADN

Source : Parker J. (2010)

Ago a la forme de 2 lobes qui contiennent chacun 2 domaines conservés au sein de la famille des protéines Argonaute :

  • le domaine N-terminal.
  • le domaine PAZ qui contient le site de fixation des 2 nucléotides non appariés à l'extrémité 3' du brin guide.

biochimej ctructure schematique de la proteine Argonaute

L'extrémité C-terminale du domaine PIWI adopte un repliement de type RNAse H et possède le site catalytique (Asp-Asp-Asp/His - activité endonucléase). La catalyse est médiée par des ions Mg2+.

Le site de clivage de l'ARNm cible est juxtaposé aux acides aminés du site actif du domaine PIWI.

L'extrémité 5' du brin guide se fixe dans une poche du domaine Mid, et l'extrémité 3′ se fixe au domaine PAZ.

Le clivage requière la formation de liaisons du type Watson-Crick entre le brin guide et l'ARNm cible s'étendant de la position 2 jusqu'au site de clivage (position 10–11) en partant de l'extrémité 5′ du brin guide.

biochimej Mode d'action Argonaute sur siRNA ou miRNA

Source : Liu & Paroo (2010)

Visualisation de Argonaute de Thermus thermophilus complexée à un fragment d'ADN à une résolution de 2,7 Å

Code PDB : 3DLB

Le chargement des structures peut prendre un peu de temps.


10. Le domaine PAZ

Ce domaine (PFAM : PF02170) est trouvé dans les 2 familles de protéines impliquées dans l'interférence post-transcriptionnelle : familles PIWI et DICER (incluant le facteur protéique Carpel).

Le nom du domaine PAZ est ainsi appelé d'après les protéines "Piwi", "Argonaut" et "Zwille".

Le domaine PAZ est composé de 2 sous-domaines :

  • l'un deux est semblable au repliement OB, impliqué dans la fixation d'acides nucléiques simple brin.
  • l'autre est composé d'un coude β suivi d'une hélice α.

Le domaine PAZ peut fixer les 2 nucléotides non appariés en 3' des siRNA et des miRNA : même si ce domaine n'est pas le site principal de fixation au sein de DICER ou du complexe RISC, il contribue à l'incorporation spécifique des siRNA et des miRNA dans la voie de l'interférence ARN.

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11. Applications thérapeutiques de l'interférence ARN

Les pathologies sont très nombreuses, par exemple :

  • l'inhibition de l'infection des lymphocytes T par le virus HIV-1
  • les thérapies anticancéreuses (ciblage de molécules impliquées dans la carcinogenèse, études des voies de l'oncogenèse et de la régulation du cycle cellulaire, apoptose, ...)
  • la fibrose pulmonaire
  • l'identification de signatures miRNA dans les cellules PBMC ("Peripheral Blood Mononuclear Cells") suggère l'utilisation de marqueurs miRNA de la schizophrénie pour de nouveaux diagnostiques cliniques

Cependant l'une des restrictions dans l'utilisation clinique des ARN interférents émane de leur temps de vie très court car ils sont rapidement dégradés par les nucléases du sérum ou des fluides extracellulaires.

Les courts ARN double brins interférants sont donc instables et il génère des effets secondaires indésirables (stimulation du système immunitaire, sécrétion de cytokines inflammatoires, ...) s'ils sont administrés systématiquement, raison pour laquelle il n'y a pas ou peu de thérapie clinique à base d'interférence ARN.

Il faut donc mettre au point des systèmes qui permettent :

  • de délivrer spécifiquement et efficacement des petits ARN interférents
  • au type de cellules ciblées
  • en optimisant leur dispersion cytosolique
  • sans qu'ils soient dégradés

biochimej Vecteur administration siRNA miRNA RNAi therapy therapie

Source : Roche

a. L'empaquetage

Des "protocellules" - nanoparticules à base de silice mésoporeuse (exemples : "Mobil Crystalline Materials" - MCM-41 / "Santa Barbara Amorphous" - SBA-15) recouvertes d'une bicouches lipidique.

biochimej spanosome protocellule nanoparticule nanoparticle administration siRNA miRNA RNAi therapy therapie

Source : Ashley et al. (2012)

Elles sont 10 à 100 fois plus stables que les nanoparticules à base de bicouches lipidiques.

Les protocellules chargées en siRNA se fixent spécifiquement aux cellules via un peptide de ciblage.

b. La synthèse d'oligomères adoptant une structure résistante à la dégradation

Les auteurs ont synthétisé un oligonucléotide de 51 nucléotides (correspondant à une partie de la séquence de l'ARNm de la glycéraldehyde 3-phosphate déshydrogénase - GAPDH - de l'homme) avec 2 prolines.

biochimej PnkRNA proline administration siRNA miRNA RNAi therapy therapie

Source : Hamasaki et al. (2012)

Cet oligomère avec 2 résidus proline s'autohybride et la structure obtenue, appelée agent RNAi PnkRNA™, correspond à :

  • une tige centrale constituée du brin sens (en rouge - figure ci-dessus) et du brin antisens (en violet), avec un nucléotide non apparié
  • 2 boucles en 3' et en 5' (en bleu) contenant chacune une proline (P) à leur extrémité

Un autre oligonucléotide de 62 nucléotides (GAPDH humaine) et qui s'autohybride aussi a été synthétisé : agent RNAi nkRNA®.

c. La synthèse assistée par ordinateur ("small interfering RNA design")

La synthèse assistée par ordinateur s'appuie sur :

La conception de courts ARN interférant simple brin ("single-stranded short interfering RNA" - ss-siRNA) semble une voie prometteuse pour une formulation efficace dans l'optique d'une administration sytématique : en effet, une étude de 2012 sur la souris a montré que le brin passager ne serait pas nécessaire pour une interférence ARN efficace (Lima et al., 2012).

L'action du brin guide nécessitant un 5' phosphate, les auteurs de cette étude ont développé un ARN interférant simple brin (chargé sur AGO2) métaboliquement stable avec un 5'-(E)-vinylphosphonate.

Autres exemples d'application :

 

12. Liens Internet et références bibliographiques

Qiagen : "RNAi pathway"

"Une nouvelle classe d'ARN : les petits ARN interférents" - Cours Université Jussieu

"miRanda" : programme de prédiction de cibles de miRNA

Molecule of the month : "Small Interfering RNA (siRNA)"

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microRNA

PDB

Animation : phénomène d'ARN interférents (revue "Nature")

Animation : "Mechanism of Dicer"

"The RISC Complex" - E. Devol

Vidéo

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Historique de l'interférence ARN

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