1. Introduction

2. Aspect cinétique - Paradoxe de Levinthal

3. Aspect thermodynamique du repliement

4. Rôle du solvant : l'eau

5. Quelques modèles du repliement

6. Les moyens pour approcher le problème du repliement

7. Expériences de calcul partagé pour la simulation du repliement

8. Liens Internet et références bibliographiques

Le processus par lequel la chaîne polypeptidique d'une protéine acquière une structure tridimensionnelle s'appelle le repliement : ce processus n'est pas encore décrypté.

Voir une animation simple illustrant le principe du repliement d'une chaîne polypeptidique.

• molécule "simple" : quand W. Bragg et L. Bragg (Prix Nobel 1915) ont les premiers résolu la structure du NaCl, les résultats ont modifié les concepts liés aux forces de liaison au sein des molécules ionisées.

• ADN : en 1953, la structure en double hélice de l'ADN a été résolue par F. Crick , J. Watson et M. Wilkins (Prix Nobel 1962). L'information dans l'ADN est sous forme linéaire. En conséquence, les molécules d'ADN ont une structure semblable.

• protéine : la première détermination par cristallographie de la structure d'une protéine globulaire, la myoglobine (J. Kendrew - 1958 - Prix Nobel 1962), a été une sorte de déception quant à l'élucidation du mécanisme du repliement des protéines.

La situation est beaucoup plus complexe que dans le cas des acides nucléiques. En effet, chacune des milliers de protéines qui existent dans une cellule doit reconnaitre spécifiquement un (ou quelques) ligand(s). Cette reconnaissance s'effectue grâce à de subtiles interactions entre la structure tridimensionnelle de la protéine et celle(s) du (des) ligand(s).

Une telle diversité d'interactions aussi précises ne peut être obtenue qu'avec des structures de protéines extrêmement variées et irrégulières.

La figure ci-dessous montre la "hiérarchie" des 4 niveaux de structures des protéines.

Christian Anfinsen (Prix Nobel 1972) a montré que, dans un environnement approprié : toute l'information nécessaire au repliement d'une protéine dans sa structure native (donc fonctionnelle) est contenue dans sa séquence primaire (l'enchaînement des acides aminés).

Pour rendre compte de la complexité du processus du repliement, on peut mentionner :

• la polarité de l'enchaînement des carbones α des acides aminés : lors de sa biosynthèse, la chaîne polypeptidique s'étend de l'extrémité N-terminale vers l'extrémité C-terminale.
• les contraintes stériques induites par la liaison entre deux acides aminés consécutifs ou liaison peptidique.
• la diversité des propriétés physico-chimiques des chaînes latérales des acides aminés.

Figure ci-dessous : représentation schématique des liaisons au sein d'une protéine repliée. A ces liaisons s'ajoutent les interaction avec le milieu ambiant.

• Comment une chaîne polypeptidique se replie-t-elle ?
• Quels sont les principes universels du repliement et les lois qui le gouvernent ?
• Existe-t-il un seul mécanisme commun à toutes les protéines ?
• Si non, y a-t-il autant de mécanisme que de protéines ? Ou autant que de famille de protéines ? ...

Pour mesurer la compléxité de ce (ou ces) mécanisme(s), rappelons que :

• 20 acides aminés sont principalement utilisés dans la composition des protéines (on en a recensé 339) : hydroxyproline (collagène), hypusine, β-acides aminés (isoserine), γ-acides aminés (statine), ω-acides aminés (ε-acide aminocaproique, 11-acid amino-undécaoïque), citrulline, isovaline, pseudoleucine, desmosine, norvaline, diéthylglycine, ...
• chacun d'entre eux possède une chaîne latérale avec des propriétés physico - chimiques particulières (charge, volume, hydrophobicité, hydrophilicité, ...)
• les protéines peuvent contenir de quelques dizaines d'acides aminés (les toxines) à quelques milliers comme la calossine ! Les protéines ont donc des masses molaires de quelques kDa à quelques centaines de kDa
• les protéines ont des pI qui s'échelonnent de 2 (glucose-1-phospho-D-mannosylglycoprotéine phosphodiestérase) à 12 (cathepsine G)
• (presque) toutes les combinaisons d'enchaînement de ces acides aminés sont possibles en théorie (mais loin d'être toutes "sélectionnées" par la nature)
• les protéines sont sous forme de monomère (une chaîne polypeptidique) ou de polymères (plusieurs chaînes polypeptidiques identiques ou non). Ces structures quaternaires peuvent contenir des dizaines de sous-unités (pyruvate déshydrogénase)
• le rayon moyen d'une protéine repliée (assimilée à une sphère ou globulaire) est d'environ 40 Å. Cependant, elle peuvent être très allongées (collagène) ou adopter des structures tri-dimensionnelles très particulières
• les échelles de temps du repliement s'étendent de l'ordre de 10^-9 s à 10^-3 s
• l'espace des phases du repliement d'une protéine comporte de nombreux minima locaux
• la transition du repliement est une transition du 1er ordre avec une perte d'entropie d'ordre k_B par monomère

2. Aspect cinétique - Paradoxe de Levinthal

Le nombre de conformations d'une chaîne polypeptidique de n acides aminés (susceptibles d'adopter s structures secondaires) est sⁿ.

Autre ordre de grandeur : 100 acides aminés ===> 99 liaisons peptidiques ===> 198 angles φ et ψ ===> 3 conformations stables pour chacun de ces angles ===> 3¹⁹⁸ conformations possibles.

Hypothèse que le repliement d'une protéine suit un processus au hasard : une protéine contenant n = 100 acides aminés / adoptant s = 13 structures secondaires / temps d'exécution de chaque conformation = 1 psec ===> temps pour explorer toutes les conformations = 10⁸⁵ secondes, c'est-à-dire 3 10¹⁷ ... siècles !

En conséquence, un processus du repliement opèrant uniquement selon une recherche au hasard de la structure de plus basse énergie (la plus stable) est donc absolument impossible du point de vue cinétique et totalement incompatible avec les échelles de temps de la vie biologique et avec la vitesse des évènements du repliement qui s'échelonnent de la micro-seconde à la milli-seconde.

C'est le paradoxe de Cyrus Levinthal (1969).

Les études de la cinétique du repliement ont montré l'existence de structures intermédiaires instables. La grande difficulté a toujours résidé dans l'isolement (et donc la caractérisation) de ces intermédiaires peu peuplés et trés labiles (temps de demi-vie trés courts).

Cependant, les données accumulées montrent actuellement que le le repliement correspond :

• à une ou des étape(s) initiale(s) rapide(s)
• suivie(s) de réarrangements structuraux plus lents (ajustements conformationnel locaux)

Une théorie a été développée par Alan Fersht : elle porte sur l'aspect cinétique du repliement (via les équilibres entre intermédiaires et/ou états globaux : état natif, états dénaturés, états structuraux intermédiaires).

3a. Aspect thermodynamique du repliement

Les états dénaturés (l'ensemble des conformations qu'une chaîne polypeptidique adopte quand elle n'est pas repliée ou est incorrectement repliée) et l'état natif (unique) d'une protéine ont des niveaux d'énergie trés proches.

En revanche, leur différence d'entropie (le nombre des configurations possibles dans chaque état) est trés importante. Du point de vue statistique, on peut donc considérer que l'état natif est largement improbable (c'est une autre illustration du paradoxe de Levinthal).

Les données actuelles sont en faveur d'un processus du repliement contrôlé thermodynamiquement. La formation de la structure native (le fond de l'entonnoir dans la figure ci-dessous) s'accompagne d'une diminution de l'entropie. [Wolynes et al. (1995) Science 267, 1619 - 1620].

Figure adaptée de Benhabilès et al. (2000)

Les intermédiaires structuraux dont la formation est sous contrôle cinétique aboutissent à la formation de la structure native.

Récemment la question a été posée de savoir si l'hypersurface du potentiel qui dirige le repliement est constituée de minima multiples ou s'il s'agit d'un système percolatoire dans lequel ces minima seraient des points de selle.

3b. L'entonnoir des paysages énergétiques ("Folding energy landscape")

Le nombre de conformations adoptables par une chaîne polypeptidique en train de se replier est astronomique.

La forme de l'espace de ces conformations (ou paysage énergétique) est représentée par une fonction mathématique qui décrit les énergies libres intramoléculaire et de solvatation d'une protéine en fonction des degrés de liberté microscopiques.

L'une des grandes avancées théoriques dans la résolution du problème du repliement d'une chaîne polypeptidique, a été de quantifier la fonction de partition de mécanique statistique, dont une composante clé est la densité d'état ("Density Of States" - DOS) : le nombre de conformations à chaque niveau énergétique.

Dans les cas simples, le logarithme de DOS est l'entropie conformationnelle. De telles valeurs d'entropie n'ont pu être estimées via des modèles tenant compte de tous les atomes constitutifs d'une protéine car cela aurait requis des temps et des méthodes de calculs astronomiques. Des modèles simplifiés de la chaîne polypeptidique en cours de repliement ont donc été développés.

L'une des conclusions les plus importantes est que les protéines sont caractérisées par un paysage énergétique en forme d'entonnoir ("funnel-shaped energy landscape"). Les chaînes polypeptidiques adoptent beaucoup d'états de grande énergie et peu de faible énergie.

Source : Ferreon et al. (2011)

Une chaîne polypeptidique résout le grand problème d'optimisation globale comme une série de petits problèmes d'optimisation locale : elle assemble des fragments peptidiques préalablement structurés et aboutit ainsi de proche en proche à sa structure native.

Source : Behance

Il y a une distinction capitale à faire entre le repliement d'une protéine et une réaction chimique classique simple.

• une réaction chimique simple évolue d'un réactant A vers un produit B, via une succession de structures individuelles.
• une chaîne polypeptidique ne suit pas le même processus parce que son "réactant" (l'ensemble des conformations dénaturées / dépliées) ne correspond pas à une structure microscopique unique. Le repliement est une transition du désordre vers l'ordre, pas celle d'une structure unique vers une autre.

En conséquence, un diagramme à 1 ou 2 dimension(s) du contour réactionnel du repliement ne peut décrire cette réduction drastique du nombre de conformations.

En revanche, une forme en entonnoir :

• décrit l'hétérogénéité conformationnelle d'une protéine
• décrit l'entropie d'une chaîne polypeptidique : il permet d'expliquer le phénomène de dénaturation qui est la résultante entre l'entropie de cette chaîne et les forces du repliement
• procure un cadre à l'échelle microscopique pour les phénomènes cinétiques du repliement
• permet d'expliquer certains comportements non classiques observés dans les processus de repliement ultra-rapides

Source : Schuler & Clarke (2013)

Les structures des protéines oscillent entre différentes conformations pour exécuter leurs tâches sophistiquées.

Le mouvement aléatoire des molécules d'eau autour des protéines fournit un réservoir inépuisable de «coups» thermiques qui agissent comme des moteurs moléculaires de la dynamique conformationnelle des protéines.

Il semble cependant que, dans certains cas, les phénomènes de friction au sein d'une protéine soit l'entrave dominante à sa dynamique moléculaire.

4. Rôle du solvant : l'eau

Le solvant naturel (dans la cellule) des protéines est l'eau : elle joue un rôle absolument capital dans le repliement et la stabilisation des états conformationnels intermédiaires.

Le repliement s'accompagne d'une importante augmentation de l'entropie de l'eau, qui compense la diminution de celle de la chaîne polypeptidique (voir ci-dessus).

Le repliement est un processus dynamique :

• le point de départ est l'état déplié qui correspond schématiquement à la chaîne polypeptidique hydratée (beaucoup d'acides aminés sont en contact avec l'eau)
• dans l'état natif, se sont quasi exclusivement les acides aminés situés en surface de la protéine qui sont au contact du solvant

Remarque : il faut mentionner

• les molécules d'eau dites de "structure" qui participent aux liaisons intra-moléculaires qui stabilisent la structure native
• les molécules d'eau présentes au niveau du site actif qui sont impliquées dans l'acte catalytique de certaines enzymes

Simulation de la molécule d'eau : lien entre le modèle appelé à grain grossier ("coarse grained" - à gauche) et le modèle appelé tout-atome ("all-atom" - à droite).

Source : Praprotnik et al. (2007)

5. Quelques modèles du repliement

Les molécules biologiques ont un large éventail d'échelles de temps au cours desquelles des processus spécifiques ont lieu :

• mouvements locaux (0,01 à 5 Å - 10^-15 à 10^-1 secondes) : fluctuations atomiques - mouvements des chaînes latérales et des boucles
• mouvements du corps rigide (1 à 10 Å - 10^-9 à 1 secondes) : mouvements des hélices - mouvements des domaines (flexion de la charnière - "hinge bending") - mouvements des sous-unités
• mouvements à grande échelle (> 5 Å - 10^-7 à 10⁴ secondes) : transitions hélice/pelote - dissociation/association - repliement/dépliement

6. Les moyens pour approcher le problème du repliement

On dispose de moyens techniques et bioinformatiques mais aussi d'un grand nombre de bases de données ("Protein Data Bank", SCOP, CATH, PFAM, CDD, ...) pour approcher une solution la plus complète du problème du repliement de n'importe quelle protéine.

Parmi les techniques, on peut citer entre autres :

• les expériences de mutations d'acides aminés pour déterminer les valeurs des angles φ et ψ, afin d'identifier les résidues déterminants pour la cinétique du repliement
• les expériences d'échange d'hydrogène qui permettent d'obtenir des informations sur les évènements au cours du repliement au niveau d'un monomère
• les peptides modèles qui permettent d'appréhender les premiers évènements extrêmement rapides du repliement
• les méthodes dites à molécule unique ("single-molecule") qui permettent de commencer à explorer expérimentalement l'hétérogénéité conformationnelle d'une protéine
• l'exploitation intensive de données structurales et fonctionnelles de protéines modèles telles que : le cytochrome c, la barnase, l'apomyoglobine, l'α-spectrine, les kinases fyn ou src, les domaines SH3 ou WW, les protéines L, les protéines G, les protéines à motif "trp cage", les protéines à "tryptophan zippers" (courtes épingles à cheveux)
• la méthode "fast laser temperature-jump"
• la méthode "time-resolved fluorescence energy transfer between heme and fluorescent probes"

Bien que la connaissance actuelle de l'ensemble des forces et des mécanismes microscopiques qui gouvernent le repliement soit largement incomplète, cela n'a pas empêché l'émergence de nouvelles méthodes de conception de protéines :

• soit des variantes de protéines existantes
• soit des protéines avec un "alphabet" élargi à des acides aminés non naturels
• soit des protéines conçues et synthétisées de novo (exemple : protéine "artificielle" TOP7 en 2003)

De plus, de nouveaux polymères appelés "foldamères" permettent d'obtenir des structures hélicoïdales compactes avec des constituants non biologiques :

• le m-phénylène éthynylène
• des peptides dits β avec un groupement CH₂ supplémentaire entre la fonction amine et la fonction carboxylique
• les peptoides (polyglycines substituées par N)

Ces foldamères ont trouvé des applications en biomédecine où ils sont utilisés :

• comme antimicrobiens
• en remplacement de surfactants des poumons
• contre les cytomégalovirus
• comme inhibiteurs
• comme vecteurs pour délivrer des siRNA à l'endroit idoine dans la cellule

Etude des intermédiaires du repliement

La caractérisation d'intermédiaires structuraux du repliement reste l'une des difficultés majeures de l'étude du repliement. En effet, le temps de demi-vie de ces intermédiaires est souvent très court (de l'ordre de la ps ou ns) et leur nombre est grand.

De nouvelles technologies permettent d'aborder ce domaine avec des résultats prometteurs. L'une d'entre elle est la ligne de faisceau BioCARS 14-BID ("BioCARS 14-IDB beamline at the Advanced Photon Source").

Cette technologie a été employée pour suivre les changements structuraux dans des cristaux de protéine avec une résolution spatiale atomique et une résolution en temps de 150 ps : ils ont permis de suivre le photocycle réversible de la protéine jaune photoactive ("Photoactive Yellow Protein"- PYP) après la photoisomérisation trans ---> cis de son chromophore acide p-coumarique (pic d'absorbance dans un cristal P6₃ : 447 nm).

Schématiquement, des instantanés (de l'ordre de la ps) de la structure de PYP ont été acquis à l'aide de la méthode "pompe-sonde":

Source : Schotte et al. (2012)

• un pulse (5 mJ à 780 nm) de faisceau laser (pompe) photo-active un cristal de PYP
• après quoi une impulsion (120 ps) convenablement retardée de rayons X (sonde - environ 3 × 10¹⁰ photons) traverse le cristal et enregistre son profil de diffraction sur un détecteur 2D

L'impulsion de rayons X (12 keV) utilisée étant poly-chromatique, des milliers de réflexions sont capturées en une seule image (spot de 80 × 40 μm²) sans avoir à tourner le cristal.

Cette approche augmente considérablement la vitesse à laquelle les données de diffraction sont acquises, d'où une augmentation de la résolution dans le temps.

Les informations nécessaires pour déterminer la structure de la protéine sont contenues dans les intensités relatives des taches de diffraction observées.

Cependant, les informations structurales contenues dans une seule image de diffraction étant incomplètes, cette méthode nécessite des mesures répétées avec des orientations multiples du cristal pour produire un ensemble complet de données.

Dans cette étude, des données de diffraction de 9 très gros (pour atténuer les effets néfastes des radiolésions lors de la collecte de données) cristaux différents dans 41 orientations ont été combinées pour produire des cartes de densité électronique résolues dans le temps.

Figure ci-dessous : population de 4 intermédiaires du repliement de PYP.

Source : Schotte et al. (2012)

7. Expériences de calcul partagé pour la simulation du repliement

Les échelles de temps du repliement s'étendent de l'ordre de 10^-11 s à 10^-3 s. Certaines sont trop courtes pour être analysées avec les technologies actuelles. Elles peuvent être simulées par ordinateur.

Depuis quelques années, des expériences de calcul partagé (grille ou "grid" : ensembles d'ordinateurs en réseau) ont lieu dans le but est de prévoir la structure d'une protéine.

L'une des initiatives les plus intéressantes est le projet "FoldingATHome" de l'Université de Stanford (USA).

Un autre exemple de calcul massif parallèle est le projet Décrypthon lancé le 15 mars 2005 par l'Association française contre les myopathies (AFM), le CNRS et la société d'informatique IBM. Ces grilles permettront de générer la puissance de calcul nécessaire au traitement de projets de recherche complexes, en génomique et en protéomique.

La base de données "REFOLD", créée par A. Buckle et S. Bottomley (Université Monash, Australie), est un recueil rare et superbe.

Elle donne un trés large éventail d'information sur les méthodes et modes opératoires pour le repliement de plusieurs centaines de protéines. Pour chacune de ces protéines, un grand nombre d'informations croisées sont disponibles.

CASP ("Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction")

En 1994, John Moult a inventé CASP ("Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction"), un test "à l'aveugle" ouvert à l'ensemble de la communauté scientifique pour prédire la structure inconnue de protéines.

Ces efforts massifs sur des années et l'émulation entre scientifiques pour arriver à des solutions rapides et satisfaisantes a permis des avancées substantielles dans le domaine de la prédiction de structures des protéines.

Des serveurs Web et des ensembles de programmes prédisent la structure native de petites protéines à domaine unique avec une déviation moyenne de 2 à 6 Å par rapport à leur structures déterminées expérimentalement.

Méthodes de simulations de la dynamique moléculaire du repliement

Les simulations de la dynamique moléculaire ("Molecular Dynamics Simulations" - MDS) du repliement des protéines (quantitativement précises) constituent l'une des approches les plus récentes et les plus prometteuses.

Au cours de la dernière décennie, les tailles des systèmes biologiques étudiés et les échelles de temps du repliement accessible aux méthodes de simulations ont augmenté de manière exponentielle (figure ci-contre).

Source : Lane et al. (2013)

Ce gain a été obtenu grâce à des progrès sur trois fronts principaux : une parallèlisation des codes de MDS, du matériel informatique spécialisé et de plus en plus performant (exemple : Anton - superordinateur pour calculs massivement parallèles construit par Shaw Research) et l'analyse statistique de trajectoires multiples indépendantes.

Evolution des capacités de simulations de systèmes aussi complexes qu'une protéine et son environnement aqueux :

• 1969 : All non-hydrogen atoms - Protein energy minimization
• 1975 : Atom groups - Coarse grain models
• 1976 : All atoms & electrons - Quantum mechanics/molecular mechanics (QM/MM) models for catalysis
• 1979 : First molecular dynamics movie
• 1988 : All atoms & water - Protein molecular dynamics in water
• 1990 : Alpha-helix molecular dynamics in water
• 2000 et après : Multiscale dynamics of huge structures
  1. Coarse-grained & all-atom normal mode dynamics of entire ribosome
  2. Markov state dynamics of RNA polymerase II
  3. Natural move Monte-Carlo of RNA
  4. "(Hamiltonian) Replica Exchange Molecular Dynamics"
  5. "Superstate parallel-replica dynamics"
  6. ...

San Diego Supercomputer Center

Computational Biochemistry Group (Kästner Group - Stuttgart)