Étapes préalables au cycle de Krebs : translocation du pyruvate et conversion du pyruvate en acétyl CoA
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1. Introduction

2. Translocation du pyruvate : la pyruvate translocase

3. Le complexe de la pyruvate déshydrogénase

a. Conversion du pyruvate en acétyl CoA

 

b. Détail du mécanisme de la réaction catalysée par le complexe de la pyruvate déshydrogénase

c. Régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase

4. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction

Au laboratoire, on peut oxyder complètement en CO2 et H2O les substances organiques composées de carbone, d'hydrogène et d'oxygène en les brûlant dans l'air. Cependant, on libère l'énergie sous forme de châleur.

Dans les cellules des organismes aérobies, le pyruvate formé à l'issue de la glycolyse est oxydé en CO2 et H2O par une série de réactions enzymatiques au cours desquelles une partie de l'énergie est stockée sous forme d'une molécule à haut potentiel énégétique :

  • cette partie de l'énergie ainsi stockée et utilisable par la cellule (au contraire de l'énergie dissipée sous forme de châleur) s'appelle l'énergie libre de Gibbs
  • la forme chimique (molécule à haut potentiel énégétique) ultime sous laquelle cette énergie est stockée (à l'issue de la chaîne respiratoire) est la molécule d'ATP

La première étape enzymatique dans la conversion du pyruvate en CO2 et H2O est une décarboxylation (formation de CO2) oxydante :

  • elle nécessite le coenzyme A ou CoASH.
  • elle forme l'acétyl-CoA (molécule constituée d'un groupe bicarboné attaché au coenzyme A).

Puis, l'oxydation du groupe acétyle de l'acétyl-CoA s'effectue dans le cycle de Krebs (aussi appelé cycle du citrate ou cycle des acides tricarboxyliques qui sont les intermédiaires de ce cycle).

L'énergie issue des réactions d'oxydation de ce cycle est convertie en pouvoir réducteur, sous la forme de coenzymes réduits (NADH et FADH2).

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Chez les Eucaryotes, les 2 étapes préalables au cycle de Krebs sont donc :

a. L'entrée du pyruvate, formé par la glycolyse dans le cytosol, dans les mitochondries. Cette entrée s'effectue :

  • puis via un mécanisme de transport actif, catalysé par la pyruvate translocase, au travers de la membrane interne. Un transporteur mitochondrial du pyruvate (MPC) semble également intevenir dans l'import du pyruvate.

b.La transformation dans la mitochondrie du pyruvate en acétyl-CoA catalysée par la pyruvate déshydrogénase.


2. Translocation du pyruvate : la pyruvate translocase

La membrane interne de la mitochondrie est imperméable aux petites molécules comme le pyruvate.

Le pyruvate issu de la glycolyse pénètre dans la mitochondrie (de l'espace intermembranaire dans la matrice) via la pyruvate translocase (protéine de la membrane interne).

Ce transport est un symport avec H+. Ces protons sont ceux qui sont concentrés dans l'espace intermembranaire par la chaîne respiratoire.

C'est la composante chimique (ΔpH) de la force proton motrice (générée par le gradient de protons au cours de la chaîne respiratoire) qui apporte l'énergie nécessaire à ce transport.

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Le phénylpyruvate qui s'accumule dans le sang en cas de phénylcéto-urée est un puissant inhibiteur de la pyruvate translocase.

En 2012, un transporteur mitochondrial du pyruvate ("Mitochondrial Pyruvate Carrier "- MPC) a été mis en évidence. Il s'agit d'un hétéro-complexe (environ 150 kDa) formé par 2 membres (MPC1 et MPC2) d'une famille de protéines membranaires non caractérisées ("Family MPC / PF03650"). Ces protéines membranaires sont conservées de la levure au mammifères.

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3. Le complexe de la pyruvate déshydrogénase

a. Conversion du pyruvate en acétyl-CoA

Le complexe multi-enzymatique (et multi co-facteurs) de la pyruvate déshydrogénase (ou pyruvate:NADP+ oxidoréductase ou PDH - EC 1.2.1.51) catalyse la transformation du pyruvate en acétyl-CoA.

Structure de l'acetyl-CoA

translocation transport symport pyruvate acide citrique tricarboxylique Krebs Szent Gyorgyi succinyl acetylcoa CoA coenzyme A biochimej pyruvate deshydrogenase

Cette réaction fait intervenir le coenzyme A (ou CoA ou CoASH).

Structure CoASH translocation transport symport pyruvate acide citrique tricarboxylique Krebs Szent Gyorgyi succinyl acetylcoa CoA coenzyme A biochimej

Le coenzyme A ou CoA ou CoASH est la molécule qui permet les réactions de transfert des groupes acyles (R-C=O), comme celles du catabolisme des acides gras.

Ces groupes sont liés au coenzyme A par des liaisons thioester, liaisons à haut potentiel énergétique (ΔG°' = - 9 kcal/mol).

Le coenzyme A est un dérivé de l'acide pantothénique, vitamine de la famille des vitamines B.

Remarque : l'adénosine 3', 5' -diphosphate n'est pas à confondre avec l'ADP = adénosine 5' -diphosphate.

Structure du complexe de la pyruvate déshydrogénase

La PDH est l'un des plus gros complexes multi-enzymatiques connus.

Exemple : la PDH de Escherichia coli contient 60 sous-unités pour une masse molaire de 5 106 à 1 107 Daltons.

Source : "Principes de Biochimie" - Horton et al. (1994)

translocation transport symport pyruvate acide citrique tricarboxylique Krebs Szent Gyorgyi succinyl acetylcoa CoA coenzyme A biochimej complexe pyruvate deshydrogenase


Enzyme E.C. structure co-facteur

sous-unités
Procaryotes

sous-unités
Eucaryotes

pyruvate déshydrogénase 1.2.4.1 tétramère α2β2 E1 en bleu pyrophosphate de thiamine 24 2 à 30
dihydrolipoamide acétyltransférase 2.3.1.12 homodimère E2 en vert acide lipoïque et coenzyme A 24 60
dihydrolipoamide déshydrogénase 1.8.1.4 homodimère E3 FAD et NAD+ 12 6 à 12

La taille de ce complexe est si grande qu'il s'apparente à une particule (comme les ribosomes ou le spliceosome).

De plus, le complexe est si flexible qu'il a fallu des années pour en déterminer une structure globale par 3 techniques : diffraction des rayons X/cristallographie, RMN et cryomicroscopie électronique.

En septembre 2012, elle a fait l'objet d'un article complet "Molecule of the month" de la PDB.

Source : NIH

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b. Détail du mécanisme de la réaction catalysée par le complexe de la pyruvate déshydrogénase

1ère étape : la sous-unité E1 (pyruvate déshydrogénase) catalyse la décarboxylation du pyruvate (partie gauche du schéma ci-dessous).

Le pyruvate réagit avec le groupe prosthétique de la sous-unité E1 : le pyrophosphate de thiamine ou TPP.

Après le départ du CO2, il reste un intermédiaire à 2 carbones : le pyrophosphate d'hydroxyéthylthiamine (HETPP).

2ème étape : HETPP est transféré de la sous-unité E1 au groupe prosthétique lipoamide de la sous-unité E2 (dihydrolipoamide acétyltransférase).

Cette étape ferait d'abord intervenir l'oxydation de HETPP par la forme disulfure du groupe lipoamide pour former l'acétyl TPP.

Il y aurait ensuite transfert du groupe acétyle à la forme dihydro du groupe lipoamide.

Enfin, le coenzyme A (CoASH) réagirait avec le groupe acétyle pour former l'acétyl-CoA et la forme réduite (sulfhydryle - SH) du groupe lipoamide.

Reaction catalyse pyruvate deshydrogenase translocation transport symport pyruvate acide citrique tricarboxylique Krebs Szent Gyorgyi succinyl acetylcoa CoA coenzyme A biochimej

Source : "Principes de Biochimie" - Horton et al. (1994)

3ème étape : La sous-unité E3 (dihydrolipoamide déshydrogénase) catalyse la réoxydation du groupe lipoamide réduit et la sous-unité E2 peut participer à un nouveau cycle catalytique.

  • Le groupe prosthétique de E3 est la flavine adénine dinucléotide (ou FAD) qui est réduite en FADH2 au cours de cette réaction.
  • La réoxydation en FAD est couplée à la réduction du NAD+ en (NADH + H+).

En conséquence, l'étape de formation de l'acétyl-CoA contribue aussi à la synthèse finale d'ATP via le NADH formé (chaîne respiratoire ==> gradient de protons ==> force proton motrice).

Résumé des coenzymes
pyrophosphate de thiamine
acide lipoïque
coenzyme A
FAD
NAD+

Structure de la pyrophosphate de thiamine

Structure de l'acide lipoique

Voir une animation du fonctionnement du complexe de la pyruvate déshydrogénase.

La flavine adénine dinucléotide (FAD)

De nombreuses protéines appelées flavoenzymes comportent un groupe prosthétique qui participe au mécanisme catalytique :

  • la flavine adénine dinucléotide ou FAD (l'ensemble de la molécule ci-contre)
  • la flavine mononucléotide ou FMN (la partie en noir)

Le centre réactionnel est un noyau aromatique tricyclique, l'isoalloxazine (la partie en rouge):

  • la partie de ce centre impliqué dans le déplacement des électrons au sein du complexe I de la chaîne respiratoire est colorée en rouge
  • l'isoalloxazine est liée au ribitol, un ose dérivé du ribose
  • l'ensemble de ces deux molécules constituent la riboflavine

Structure de la flavine adenine dinucleotide ou FAD

Source : "Principes de Biochimie" - Horton et al. (1994)

c. Régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase

L'activité de la PDH est très finement régulée car elle joue un rôle central dans le métabolisme énergétique : en effet, la réaction catalysée par la PDH met en relation la glycolyse, la néoglucogenèse et l'oxydation des acides gras avec le cycle de Krebs.

De plus, l'activité de la PDH est importante également dans la régulation du flux de la transformation du glucose en malonyl-CoA, nécessaire à la synthèse des acides gras.

  • L'acétyl-CoA produit dans les mitochondries par la PDH, est transporté dans le cytosol sous forme de citrate quand la charge énergétique de la cellule augmente.
  • Dans le cytosol, le citrate est hydrolysé par l'ATP-citrate lyase pour former l'oxaloacétate et l'acétyl-CoA : cet acétyl-CoA peut être converti en malonyl-CoA (précurseur des acides gras) par l'acétyl-CoA carboxylase.
  • L'accumulation du malonyl-CoA dans le cytosol, quand la charge énergétique de la cellule est élevée, sépare les acides gras du cytosol de la machinerie oxydative des mitochondries en inhibant la carnitine palmitoyl-transférase I.
  • Cet effet du malonyl-CoA (dérivé de l'acétyl-CoA) couple l'augmentation de l'oxydation du glucose à la diminution de l'oxydation des acides gras.

L'activité de la sous-unité E1 est régulée par :

La régulation allostérique des sous-unités E2 et des sous-unités E3 contrôle la quantité d'acétyl-CoA produite à partir du pyruvate.

Elle établit donc un lien avec le flux de la glycolyse.

En général, les substrats de la PDH sont des activateurs et les produits de la PDH sont des inhibiteurs.

Regulation allosterique activite pyruvate deshydrogenase translocation transport symport pyruvate acide citrique tricarboxylique Krebs Szent Gyorgyi succinyl acetylcoa CoA coenzyme A biochimej

Voir un cours sur les mécanismes enzymatiques à plusieurs substrats et plusieurs produits.

 

4. Liens Internet et références bibliographiques

"Pyruvate Dehydrogenase Complex : PDB Molecule of the Month - September 2012"

"Biocarta" : site interactif sur la signalisation cellulaire

"The UCSD-Nature Signaling Gateway" - A comprehensive resource for information about cell signaling

"Pyruvate metabolism" - KEGG PATHWAY Database

PDB

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Bricker et al. (2012) "A mitochondrial pyruvate carrier required for pyruvate uptake in yeast, Drosophila, and humans" Science 337, 96 - 100

Herzig et al. (2012) "Identification and functional expression of the mitochondrial pyruvate carrier" Science 337, 93 - 96

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