Les mécanismes de transports membranaires : passifs, actifs / pores, pompes, canaux
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1. Introduction et définitions

2. Quelques lois thermodynamiques du transport membranaire

3. La diffusion simple ou diffusion libre (transport passif)

4. Le transport facilité (transport passif)

a. Types de protéines du transport facilité
b. Caractéristiques du transport facilité
c. Formalisme thermodynamique du transport facilité
d. Traitement cinétique du transport facilité
e. Exemple du transport facilité du glucose par les perméases GLUT
f. Les protéines de transport facilité de la superfamille MFS

5. Le transport actif primaire ou direct

a. Généralités

 

b. Principe du transport actif primaire
c. Description du cycle de la pompe à sodium - potassium ou ATPase - [Na+/K+]

6. Les pompes - transport actif primaire

a. Les types de pompes
b. Mécanisme d'activation des pompes ATPases - Ca2+ par la calmoduline
c. L'ATP synthase FoF1

7. Transport actif secondaire

a. Principe
b. Description du cycle de la lactose perméase de Escherichia coli

8. Illustration : les transports au travers des membranes mitochondriales

9. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Introduction et définitions

Les transports membranaires déplacent des ions ou des molécules au travers des membranes biologiques séparant le milieu intra-cellulaire du milieu extra-cellulaire ou séparant deux compartiments sub-cellulaires.

Les propriétés physico-chimiques des membranes, donc leur composition en lipides et protéines, sont capitales puisqu'elles dictent les types de transport.

Voir un cours sur les lipides et les protéines constitutives des membranes.

Les membranes biologiques sont des barrières sélectives très efficaces.

La figure ci-contre indique la perméabilité ou non d'une double couche lipidique sans protéine à différents types de biomolécules.

fluidite permeabilite membrane transport biochimej

Le flux net d'un soluté S (Js) au travers d'une membrane signifie qu'il existe une force qui agit sur ce soluté et qui détermine le sens de ce flux.

Cette force résulte de gradients transmembranaires de potentiels thermodynamiques : gradients de pression osmotique, gradients chimiques ou électrochimiques, gradients de température.

  • Un transport est passif si l'énergie de ces gradients rend compte quantitativement du flux transmembranaire du soluté S.
  • Cependant, un flux net peut ne pas résulter de cette force : s'il n'y a pas de couplage du flux du soluté S avec le flux d'autres solutés, l'énergie pour le transport du soluté S provient (partiellement ou totalement) du métabolisme cellulaire. Il s'agit alors de transport actif primaire ou transport couplé directement au métabolisme.

Remarques concernant les gradients de température

  • Certains tissus adipeux sont spécialisés dans la combustion des graisses et la thermogenèse des mammifères. Cette aptitude à la thermogenèse leur est conférée par la protéine découplante 1 ("UnCoupling Protein 1" - UCP1), une protéine de transport spécifique de la membrane interne des mitochondries de ces tissus adipeux.
  • UCP1 augmente la conductance de la membrane interne pour les protons : le gradient de protons mitochondrial est dissipé au travers de la membrane interne, ce qui découple la phosphorylation oxydative de la synthèse d'ATP. L'énergie du gradient est convertie en chaleur (et non pas sous forme d'ATP).
  • Le réticulum endoplasmique / sarcoplasmique semble aussi l'un des organites responsables de la production de chaleur dans la cellule. Cette production de chaleur est médiée par la pompe Ca2+-ATPase (SERCA).
Les différents types de transport

Les transports passifs   Les transports actifs
Ils ne nécessitent pas d'énergie car ils se font dans le sens du gradient de concentration (ou gradient électrochimique). Ils nécessitent de l'énergie car ils se font contre le gradient de concentration (transport non spontané).

La diffusion directe (ou diffusion simple ou diffusion libre) : les molécules "liposolubles" diffusent au travers de la membrane.

La diffusion facilitée : les molécules utilisent une protéine de transport.

L'osmose : mouvement net de molécules de solvant au travers d'une membrane semi-perméable vers un compartiment contenant une concentration plus importante d'un soluté. Ce mouvement tend à égaliser la concentration de ce soluté des 2 côtés de cette membrane. La différence de concentration engendre une différence de pression (gradient de pression) : c'est la pression osmotique qui provoque ce mouvement.

Transport actif primaire (ou direct) : l'énergie est fournie par l'hydrolyse d'un nucléotide triphosphate (exemple : pompes à ATP et hydrolyse de l'ATP).

Transport actif secondaire (ou couplé) : l'énergie est fournie par une différence de potentiel électrochimique (exemple : un gradient de concentration de sodium). Le terme "secondaire" signifie que cette différence de potentiel électrochimique résulte d'un transport actif primaire (exemple : pompe à sodium et hydrolyse de l'ATP).


Figures ci-contre et ci-dessous : illustration schématique des types de transport transmembranaires.

Canal ionique transport membrane biochimej

Diffusion facilite simple gradient transport passif actif canal symport antiport uniport biochimej

Figure ci-contre : résumé des différents types de transport membranaires.

actif passif diffusion osmose pompe gradient electrochimique glucose transporter GLUT pump Fick biochimej

Le passage de matériel biologique trop volumineux ou trop réactif s'effectue par deux autres processus : l'endocytose et l'exocytose. Dans les deux cas, ce transport s'effectue par l'intermédiaire d'une vésicule lipidique, résultat d'une invagination de la membrane plasmique.

Voir le cours : "Le trafic vésiculaire - les protéines SNARE".


Type de transport Type de protéine de transport saturable par le substrat transporté production d'un gradient de concentration dépendant de l'énergie
passif - diffusion simple ------------- non non non
passif - diffusion facilitée transporteur / perméase : diffusion d'une espèce chimique oui non non
canal ionique / pore : diffusion d'une espèce chimique non non indirectement
actif primaire

pompes :

  • ABC ("ATP-Binding Cassette")
  • photosensibles "(light-driven pumps")
oui oui oui
actif secondaire

symport : transport simultané dans le même sens de deux (ou plus) espèces chimiques
antiport (ou contre-transporteur) : transport successif dans des sens opposés de deux (ou plus) espèces chimiques

oui oui oui

Figure ci-contre : "The Transporter Classification system".

Plus de 400 familles de transporteurs ont été recensées.

Source : Busch & Saier (2002)

transport membrane gap junction passif facilite biochimej


"Transporter Classification database" : système de classification des protéines de transport membranaire.

Class 1. Channels/Pores

  • α-Type Channels
  • β-Barrel Porins
  • Pore-Forming Toxins
  • Non-Ribosomally Synthesized Channels
  • Holins

Class 2. Electrochemical Potential-Driven Transporters

  • Porters
  • Non-Ribosomally Synthesized Porters
  • Ion-Gradient-Driven Energizers

Class 3. Primary Active Transporters

  • P-P-Bond Hydrolysis-Driven Transporters
  • Decarboxylation-Driven Transporters
  • Methyltransfer-Driven Transporters
  • Oxidoreduction-Driven Transporters
  • Light Absorption-Driven Transporters

Class 4. Group Translocators

Class 5. Transmembrane Electron Carriers

  • Transmembrane 1-Electron Transfer Carriers
  • Transmembrane 2-Electron Transfer Carriers

Class 8. Accessory Factors

  • Involved in Transport
  • Auxiliary Transport Proteins

Class 9. Incompletely Characterized Transport Systems

  • Recognized Transporters of Unknown Biochemical Mechanism
  • Putative Uncharacterized Transport Proteins
  • Functionally Characterized Transporters Lacking Identified Sequences

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2. Quelques lois thermodynamiques du transport membranaire

a. Les lois de la diffusion de Fick

Considérons le flux Js d'un soluté S en solution. A est la surface (en m2) à travers laquelle le flux se dirige.

Remarque : la diffusion a lieu dans les 3 dimensions mais le flux n'est considéré que dans 1 dimension par simplification.

La diffusion a lieu le long d'un gradient de concentration : des fortes concentrations vers les faibles concentrations.

Les lois de la diffusion ont été développées par Adolf Fick en 1855 :

1ère loi de Fick : Js = - Ds . (∂Cs / ∂x) = - b . Cs . (∂μs / ∂x)

2ème loi de Fick : ∂Cs / ∂t = Ds . (∂2Cs / ∂x2)

Diffusion facilite simple gradient transport passif actif canal symport antiport uniport Fick biochimej

  • Js est le flux (en mol.sec-1.m-2) du soluté S ou vitesse de changement de la quantité Q du soluté en fonction du temps. Js mesure donc la quantité de soluté qui traverse une petite surface pendant un temps court.
  • D = b . RT : coefficient de diffusion (en m2.sec-1) . Par convention il est toujours négatif dans l'équation de Fick car le sens du flux va vers les faibles concentrations.
  • (∂Cs / ∂x) est le gradient de concentration. C'est la force motrice de la diffusion.
  • b = B / Ν : mobilité molaire (mole-1)
  • μs est le potentiel chimique du soluté S : μs = μ0s + R.T . Ln (Cs)
  • B : mobilité mécanique (en mole ou m.sec-1.Newton-1)
  • Ν : nombre d'Avogadro

Voir une démonstration des équations de Fick.


b. Equation de Ussing-Teorell

Du point de vue biophysique, une façon de distinguer un transport passif d'un transport actif est l'utilisation de l'équation de Ussing-Teorell qui est un test pour le mouvement passif indépendant de solutés dans des conditions de non-équilibre.

ƒ = JExtracellulaires / JIntracellulaires = exp (- Δμs / R.T) = CExtracellulaires / CIntracellulaires

Si le soluté S n’est pas chargé : f = CExtracellulaires / CIntracellulaires

  • ƒ est le rapport des flux transmembranaires
  • Efflux JExtracellulaires : flux du soluté S du compartiment intracellulaire vers le compartiment extracellulaire
  • Influx JIntracellulaires : flux du soluté S du compartiment extracellulaire vers le compartiment intracellulaire
  • μs (potentiel chimique du soluté S) : μs = μ0s + R.T . Ln (Cs)
  • - Δμs (gradient de potentiel chimique du soluté S) : - Δμs = RT ln (CExtracellulaires / CIntracellulaires)
  • CExtracellulaires et CIntracellulaires : concentrations du soluté S dans chaque compartiment
  • R = constante des gaz parfaits = 8,31 J.K-1.mol-1
  • T = température absolue

Si la valeur expérimentale de f (le rapport des flux transmembranaires) est égale à la valeur prédite par l'équation de Ussing-Teorell, le transport est passif. Si ces valeurs sont différentes, le transport est actif.


c. Définitions préalables au transport de solutés chargés ou non

Plusieurs facteurs entraînent une distribution différente des ions ou des molécules de part et d'autre d'une membrane :

  • la présence d'ions de part et d'autre
  • la perméabilité selective de la membrane
  • la résistance élevée de la membrane
  • l'activité des canaux ioniques et des pompes ioniques

Les conséquences sont :

  • La création d'un gradient de concentration des ions ou des molécules.
  • Une différence de potentiel électrique entre la face de la membrane du côté du milieu intracellulaire (négatif) et la face de la membrane du côté du milieu extracellulaire (positif) : c'est le potentiel de membrane qui varie de -50 mV à -200 mV selon le type de cellule (exemple : -65 mV pour les neurones à l'état basal).
  • La membrane plasmique et la membrane mitochondriale ont un potentiel de membrane.

Ce potentiel de membrane influe sur le mouvement des molécules chargées : les molécules positives se dirigent vers le milieu intracellulaire (négatif) et inversement pour les molécules négatives.

Le déplacement des molécules chargées au travers des membranes est régi par deux forces :

  • l'énergie libre de Gibbs associée au gradient de concentration
  • le potentiel électrique (résultant d'un déséquilibre de charges de part et d'autre de la membrane) qui attire les charges positives vers le milieu intracellulaire et les charges négatives vers le milieu extracellulaire
  • la combinaison de ces deux forces est appelée gradient électrochimique

Une protéine de transport qui engendre un potentiel de membrane est une pompe électrogènique (exemple : pompe [Na+/K+]).


d. Expression de la force résultant d'une différence de potentiel chimique ou électrochimique transmembranaire

α. Si le soluté S n'est pas chargé, la force du potentiel chimique s'écrit :

ΔG'   =   RT . Ln (CsIntracellulaire / CsExtracellulaire)

β. Si le soluté S est chargé, il faut tenir compte aussi de la différence de potentiel électrique entre les deux faces de la membrane (rappel : la face de la membrane du côté du milieu intracellulaire est négative), proportionnelle au potentiel de membrane ΔΨM. La force du potentiel électrochimique s'écrit :

ΔG'   =   [RT . Ln (CsIntracellulaire / CsExtracellulaire)]    +    (zs . F . ΔΨM)

  • zs = valence du soluté S
  • F = constante de Faraday
  • potentiel de membrane : ΔΨM = (ΨIntracellulaire - ΨExtracellulaire)
  • composante électrique : ΔG'électrique =   - n . F . ΔΨM

Voir le formalisme de la force proton-motrice de l'ATP synthase générée par la chaîne respiratoire.


e. Perméabilité d'une membrane et potentiel de Nernst

Le milieu extracellulaire E et le milieu intracellulaire I sont séparés par la membrane M de la cellule.

Le saut de concentration d'un soluté S entre la phase membranaire M et les phases aqueuses I et E, est caractérisé par un coefficient de partage : ks= CMs / Cs

Si le flux du soluté S au travers de la membrane est constant, alors : Js= - Ds . (∂Cs / ∂x) = [ks. Ds / h] . (CIs - CEs)
Ds : coefficient de diffusion
h : épaisseur de la membrane

  • On définit la perméabilité Ps (en m.s-1) du soluté S : Ps = ks . Ds / h
  • Valeurs de perméabilité : environ 10-6 m.s-1 pour l'eau et 10-14 m.s-1 pour K+

A l'équilibre thermodynamique, en absence de flux ou de potentiel électrostatique, le passage d'un ion au travers de l'interface [milieu aqueux / membrane], nécessite de l'énergie.

  • Soit l'énergie libre de Gibbs standard du transfert d'un soluté S du milieu intracellulaire I vers la phase membranaire M : ΔG0s = μ0sM - μ0sI
  • Le coefficient de partage ks est défini par : ks = exp (ΔG0s / RT)

Pour un soluté chargé, il faut aussi tenir compte du potentiel électrique car le rapport des activités d'un soluté (as) de charge zs entre les deux phases est : asM / asI = ks . exp (-zs . F . ΔΨM-I / RT)

  • ΔΨM-I : potentiel interfacial [membrane - milieu intracellulaire]
  • F : constante de Faraday = 96.485 C.mol-1

En absence de différence de potentiel entre les phases, le rapport d'activité est déterminé par le coefficient de partage. Dans le cas des solutions idéales (solutions diluées), l'activité se réduit à la concentration : asM / asI = CsM / CsI

La différence de potentiel interfacial s'écrit alors : ΔΨM-I = ΨM - ΨI = - [RT / zs . F] . ln (CsM / ks.CsI)

Pour le passage entre le milieu intracellulaire I et le milieu extracellulaire E au travers d'une membrane M, l'application aux 2 interfaces M-I et M-E pemet d'obtenir le potentiel de Nernst :

ΔΨM = ΨI - ΨE = - [RT / zs . F] . ln (CsIntracellulaire / CsExtracellulaire)

Ce résultat n'est autre que celui obtenu pour ΔG' = 0 (force du potentiel électrochimique - ci-dessus), c'est-à-dire à l'équilibre.


f. Equations pour le calcul du potentiel de membrane

α. Potentiel d'équilibre pour un ion ou potentiel de Nernst pour un ion

Le milieux extracellulaire et le milieux intracellulaire sont séparés par une membrane. Ils contiennent KCl et la concentration dans le milieu intracellulaire est plus élevée.

Si la membrane n'est perméable qu'à K+, cet ion diffuse du milieu intracellulaire (concentration plus élevée) vers le milieu extracellulaire (concentration plus faible). L'ion Cl- ne peut pas diffuser.

  • dans un premier temps il y a un transfert net de charges positives du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire : il y a donc un excès de charges positives dans le milieu extracellulaire et un excès de charges négatives dans le milieu intracellulaire.
  • dès ce moment, le gradient électrique ainsi généré pousse à l'inverse K+ du milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaire.

Transport membranaire gradient electrochimique potentiel Nernst actif passif facilite biochimej

Très rapidement, un équilibre s'établit où la différence de potentiel électrique déplace K+ vers le milieu intracellulaire à la même vitesse que la vitesse de diffusion de K+ vers le milieu extracellulaire en raison du gradient de concentration.

Quand il n'y a plus de flux net de l'ion, il s'établit un équilibre thermodynamique. La différence de potentiel électrique à laquelle cet équilibre s'établit est appelée potentiel d'équilibre ou potentiel de Nernst (souvent noté E) pour l'ion considéré :

                 R . T                      [ion]milieu Intracellulaire
E =  -    --------  .  Ln  ( ------------------------ )
                 zs . F                     [ion]milieu Extracellulaire

  • E = potentiel d'équilibre ou potentiel de Nernst pour l'ion considéré, en volt
  • zs = charge de l'ion
  • F = constante de Faraday

Remarque : cette expression est équivalente à celle décrite ci-dessus.

La valeur du potentiel d'équilibre d'un ion dépend donc du gradient de concentration de cet ion au travers de la membrane :

  • plus le gradient de concentration est fort, plus le potentiel d'équilibre est fort.
  • à l'inverse, si les concentrations de cet ion des deux côtés de la membrane sont égales, la force du gradient de concentration est nulle et le potentiel d'équilibre est nul également.

β. Equation de David Goldman, Alan Hodgkin et Bernard Katz (1943 et 1949) : c'est une généralisation de l'équation de Nernst dans le cas de plusieurs types d'ions.

Cette équation décrit le potentiel d'une membrane M (ou potentiel transmembranaire ΨM) qui sépare 2 solutions contenant, par exemple, NaCl et KCl.

  • cette membrane est perméable aux 3 ions : Na+, K+, Cl-
  • approximations nécessaires : cette membrane est uniforme, plane et de dimension infinie dans le sens latéral
  • on prend comme valeur zéro le potentiel du milieu extracellulaire
  • l'équilibre des flux ioniques à l'état stationnaire se traduit par : JNa+ + JK+ - JCl- = 0

On obtient :

               R.T                     (PNa+ . [Na+]Extracellulaire) + (PK+ . [K+]Extracellulaire) + (PCl- . [Cl-]Intracellulaire)
ΨM  =  -------  .  Ln  [ ------------------------------------------------------------------- ]
                 F                       (PNa+ . [Na+]Intracellulaire) + (PK+ . [K+]Intracellulaire) + (PCl- . [Cl-]Extracellulaire)

  • ΨM = (ΨIntracellulaire - ΨExtracellulaire) = potentiel transmembranaire en volt
  • Pions = perméabilité de l'ion considéré en m.s-1

Voir une démonstration de l'équation de Goldman-Hodgkin-Katz.


γ. Equation de David Goldman : elle décrit le potentiel de membrane quand il y a des différences de concentrations de divers ions de part et d'autre de la membrane.

Dans la cellule, du fait des pompes ioniques (voir les ATPases), les concentrations en ions dans le milieu intracellulaire et dans le milieu extracellulaire ne sont pas égales.

De plus, chaque ion est caractérisée par une pérméabilité (voir ci-dessus) pour un type de membrane donnée : K+ entre 10 à 100 fois plus vite que Cl-.

Il s'ensuit un déséquilibre des charges entre les 2 faces de la membrane : ce potentiel ralentit à son tour le mouvement des ions.

Quand la différence nette des charges atteint un équilibre, un potentiel de diffusion est généré qui dépend de la perméabilité des différents ions.

Transport diffusion facilite simple gradient transport passif actif canal symport antiport uniport biochimej

Le potentiel de membrane est alors calculé par l'équation de Goldman :

           R.T                   (∑iN Pions + . [ions +]Extracellulaire) + (∑jM Pions - . [ions -]Intracellulaire)
E =  ------  .  Ln  [ -------------------------------------------------------------]
             F                     (∑iN Pions + . [ions +]Intracellulaire) + (∑jM Pions - . [ions -]Extracellulaire)

  • E = potentiel de membrane en volt
  • Pions = perméabilité de l'ion considéré en m.s-1
  • [ions +]Extracellulaire = concentration extra-cellulaire de l'ion considéré en mol.m-3 (pour l'homogénéïté des unités des différentes grandeurs)
  • [ions +]Intracellulaire = concentration intra-cellulaire de l'ion considéré en mol.m-3

Voir une démonstration de l'équation de Goldman.

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3. La diffusion simple ou diffusion libre (transport passif)

La diffusion simple est la diffusion d'un soluté au travers d'une membrane dans le sens fortes concentrations vers les faibles concentrations (gradient de concentration), jusqu'à atteindre un équilibre des concentrations des 2 côtés de la membrane.

Ce type de diffusion nécessite que le soluté soit soluble dans la bicouche de phospholipides constitutive de la membrane : il doit être hydrophobe ou apolaire.

S'il est hydrophile ou polaire, il doit être de petite taille.

transport simple libre membrane gradient biochimej

Les caractéristiques de ce transport sont :

  • pas de saturation ni de régulation
  • la vitesse de diffusion dépend du gradient de concentration ou du gradient électrochimique si le soluté est un ion
  • transport lent par rapport à la diffusion facilitée

Soluté Concentration intracellulaire (mM) Concentration extracellulaire (mM) Perméabilité (diffusion) de la membrane Imperméabilité de la membrane
Na+ 12 - 15 145
K+ 120 - 140 4 - 4,5
Mg2+ 0,8 1,5
Ca2+ 1 10-4 (≈ 100 nM) 1,2 - 2
Cl- 5 - 20 110 - 116
HCO3- / PO43- / protéines / acides nucléiques ... 148 42

La concentration de H+ dans les fluides corporels est d'environ 40 10-9 moles / L (40 nM - pH 7, 4).

Par ailleurs, chez un être humain de 70 kg à l'état basal, le taux de production d'acide :

  • résultant d'une alimentation et d'un métabolisme normaux est de 50 à 70 mmoles/jour
  • lié à la respiration est d'environ 15.000 mmol/jour (avec un pic pouvant atteindre 200 mmoles/min lors d'un exercice maximum)

Le flux d'H+ au travers de l'organisme en 24 heures est 108 fois plus élevé que la quantité totale d'H+ libre dans toute l'eau du corps (< 2 μmoles).

Cette homéostasie extraordinaire est assurée par :

  • des tampons intracellulaires et extracellulaires
  • une activité ventilatoire extrêmement efficace
  • les fonctions métabolique du foie
  • les mécanismes ammoniogèniques des reins (en particulier l'excrétion d'acide non volatile)
  • les mécanismes de transport

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4. Le transport facilité (transport passif)

a. Types de protéines du transport facilité

Le moteur de la diffusion facilitée est le gradient de concentration (comme la diffusion passive). Mais la diffusion facilitée ne s'opère que via des protéines transmembranaires intrinsèques qui sont spécialisées dans le transport de solutés spécifiques.

α. Les canaux ioniques qui permettent la communication entre cellules.

Exemple : les jonctions gap ("gap junction").

  • elles constituent une connexion spécialisée entre une grande diversité de cellules animales.
  • elles établissent une connexion directe entre les cytoplasmes des cellules connectées, ce qui permet le passage de molécules (masse molaire environ 500 - 1100 Da), d'ions et d'impulsions électriques.

Figure ci-contre : les niveaux multiples de la structure des canaux jonctions gap.

Ils sont composés de protéines intrinsèques de taille moyenne : les connexines (vertébrés) ou les innexines (invertébrés) .

Source : Goodenough & Paul (2009)

transport membrane gap junction passif facilite biochimej

Les connexines contiennent 4 domaines trans-membranaires. Elles sont synthétisées au niveau du réticulum endoplasmique rugueux puis insérées au réticulum endoplasmique au cours de leur traduction.

Les connexines s'assemblent à l'intérieur de la cellule sous forme d'hexamères, appelés connexons qui sont dirigés vers la surface de la cellule. Il s'y associent à d'autres connexons de cellules adjacentes : cela forme un canal axial (qui traverse les 2 membranes plasmiques) et un orifice extracellulaire étroit (le "gap").

β. Les canaux ioniques qui s'ouvrent en réponse à un stimulus chimique ou électrique précis ("Ligand-Gated Ion Channels").

Ce type de canal ionique [ouvert/fermé] par un ligand sont des protéines qui existent dans au moins 2 conformations : l'une de ces conformations forme un pore transmembranaire.

Le passage d'une conformation à une autre est régulé par la fixation d'un ligand spécifique : la fixation de ce ligand ouvre ou ferme ce canal.

La vitesse de transport des ions par les canaux ioniques est d'environ 107 - 108 ions.sec-1.

pore canal ionique ionic transport ligand membrane biochimej

Exemples de canaux ioniques et de ligands activateurs

  • les récepteurs purinergiques trimériques activés par l'ATP. Exemple : le récepteur P2X - mouvement de Ca2+, de Na+ et de K+ au travers de la membrane plasmique.
  • les récepteurs tétramèriques activés par le glutamate. Exemple : le récepteur NMDA (N-méthyl-D-aspartate) - mouvement de Ca2+, de Na+ et de K+ au travers de la membrane post-synaptique.
  • le récepteur nicotinique de l'acétylcholine de type "Cys-loop".
  • les récepteurs 5-HT3 de la sérotonine (5-hydroxytryptamine ou 5-HT) de type "Cys-loop" : l'entrée de Ca2+ et de Na+ induit une dépolarisation du neurone postsynaptique ce qui déclenche un potentiel d'action. Remarque : les autres récepteurs 5-HT1,2,4,5,6 de la sérotonine sont des récepteurs couplés à des protéines G.
  • indirectement : le canal Na+/Ca2+ activé par le GMP cyclique via un récepteur (rhodopsine) couplé à une protéine G (transducine).
  • indirectement : le canal Na+/K+ activé par l'AMP cyclique via un récepteur couplé à la protéine GOlf.

Base de données : "Ligand-Gated Ion Channel database".

γ. Les pores sélectifs comme les porines ou les aquaporines.

On les trouve dans la membrane externe des bactéries (Gram - et certaines Gram +), de la mitochondrie et du chloroplaste.

Leur structure est un tonneau β ("β-barrel") constitué de feuilets β anti-parallèles. Les acides aminés polaires et non polaires alternent au sein des feuillets : les acides aminés polaires sont orientés vers l'intérieur hydrophile du pore et les acides aminés non polaires interagissent avec les lipides membranaires.

Du fait de la taille du pore, divers types de molécules (sucres, ions et acides aminés - solutés de masse molaire inférieure à 5 à 7 KDa) diffusent de manière passive.

Chaque type de porine transporte sélectivement un groupe de molécules ou une molécule unique.

Voir un cours sur les porines et les aquaporines.

δ. Les protéines de transport ("carrier") ou perméases

SExtracellulaire KD
<====>
SIntracellulaire

b. Caractéristiques du transport facilité

Le transport facilité augmente considérablement la vitesse de transport d'un soluté par rapport à la diffusion simple (figure ci-contre).

Remarque : certains solutés transportés par transport facilité le sont aussi, à un flux beaucoup plus faible, par diffusion simple. La droite en rouge (diffusion simple) est donc parallèle à la fin de la courbe en bleu (transport facilité).

transport membrane glucose GLUT passif facilite biochimej

Il y a une spécificité de reconnaissance entre la protéine de transport facilité et le soluté transporté (comme les enzymes vis-à-vis de leur substrat), d'où une saturation quasi-hyperbolique (courbe en bleu - figure ci-dessus).

transport membrane glucose GLUT passif facilite biochimej

On peut déterminer une constante de dissociation KD du soluté transporté :

Exemples de valeurs de KDOse Transporté par la perméase GLUT1 ("GLUcose Transporter 1")
Ose Transporté D-glucose L-glucose D-mannose D-galactose
KD (mM) 1,5 > 3000 20 30

La structure du site de fixation du substrat de GLUT5 (transporteur spécifique du fructose) est très proche de celles de GLUT1 (transporteur spécifique du glucose) de l'homme et de XylE de Escherichia coli.

  • La comparaison de la structure de GLUT5 et de GLUT1 a mis en évidence qu'une mutation ponctuelle suffit pour changer la spécificité de substrat de GLUT5 du fructose en glucose.
  • La plupart des acides aminés qui tapissent la cavité centrale et qui sont conservés entre GLUT5 et GLUT1 de l'homme incluent Ile169, Ile173, Gln166, Gln287, Gln288, Asn324 et Trp419.
  • Dans la structure de GLUT5, Trp419 est le seul résidu Trp placé dans le site de fixation du substrat et il est essentiel pour le transport.
  • La constante de dissociation de GLUT5 pour le D-fructose est de 6 à 9 mM.

Le transport facilité peut être inhibé (inhibition compétitive ou non compétitive / inactivation).

Exemple : la perméase GLUT2 transporte le glucose, le fructose et le galactose. Le galactose étant un analogue structural du glucose, certains sites du transporteur sont occupés par le galactose (inhibition compétitive).

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c. Formalisme thermodynamique du transport facilité

La force motrice de la diffusion passive d'un soluté S de charge zs au travers d'une membrane est la différence de potentiel électrochimique de ce soluté entre les 2 côtés de la membrane.

Potentiel électrochimique d'un soluté S de charge zs :     μs = μ0s + (RT log as) + (zs . F . Ψ)

  • μs  = potentiel électrochimique du soluté S (en volt)
  • μ0s  = potentiel électrochimique de référence ou standard du soluté S (en volt)
  • as = activité du soluté S
  • Ψ = potentiel électrique (en volt)

Considérons le transport facilité d'un soluté S de charge zs, médié par un transporteur P, d'un milieu de potentiel électrique Ψ1 vers un milieu de potentiel électrique Ψ2.

transport membrane pore carrier facilite biochimej

On fait les approximations suivantes :

  • l'activité du soluté S (as) est égale à sa concentration [S] (solution aqueuse diluée)
  • les potentiels électrochimiques standards de ce soluté sont identiques dans les 2 milieux (c'est-à-dire des 2 côtés de la membrane)

L'expression de la force motrice de la diffusion passive devient : ΔμsElectroChimique = μ2s - μ1s = RT (log [S2] - log [S1]) + [zs . F . (Ψ2 - Ψ1)]

Remarque : dans le cas du transport de plusieurs solutés, l'expression est la même en sommant les différences de potentiel électrochimique pour obtenir la force nette globale.

Quand la différence de potentiel électrochimique est nulle, le système est à l'équilibre entre les 2 côtés de la membrane. Le rapport des concentrations ([S1] et [S2]) du soluté est alors déterminée par la différence de potentiel électrique :

[S2]equil / [S1]equil = exp [- zs . F . (Ψ2 - Ψ1) / RT]

d. Traitement cinétique de la diffusion facilitée

  • schéma cinétique de la diffusion facilitée via une protéine de transport : la conformation de la protéine libre n'est pas la même d'un côté et de l'autre de la membrane.
  • schéma cinétique de la diffusion facilitée via un pore : il n'y pas de changement de conformation.

transport membrane pore carrier facilite kinetic treatment facilitated diffusion biochimej

Cas d'une protéine de transport : le point important est qu'il existe 2 états conformationnels disctincts de la protéine de transport (P1 et P2).

  • d[P1]/dt = k4.[P2] - k-4.[P1] - k1.[P1].[S1] + k-1.[PS1]
  • d[PS1]/dt = k1.[P1].[S1] - k-1.[PS1] - k2.[PS1] + k-2.[PS2]
  • d[PS2]/dt = k2.[PS1] - k-2.[PS2] - k3.[PS2] + k-3.[P2].[S2]
  • [P2] = [Ptotal] - [P1] - [PS1] - [PS2]

La distribution des 2 différents états conformationnels de la protéine de transport à l'état stationnaire est :

  • [P1] = [Ptotal] . {k3k4 . (k2 + k-1) + k-2k-1 . (k4 + k-3) . [S2]} / Den
  • [PS1] = [Ptotal] . {k1k4 . (k3 + k-2) . [S1] + k-3k-2 . (k-4 + k1 . [S1]) . [S2]} / Den
  • [PS2] = [Ptotal] . {k1k2 . (k4 + k-3 . [S2]) . [S1] + k-4k-3 . (k-1 + k2) . [S2]} / Den
  • [P2] = [Ptotal] . {k-4k-1 . (k-2 + k3) + k2k3 . (k-4 + k1 . [S1]} / Den
  • Den = [k3k4 . (k2 + k-1)] + [k-2k-1 . (k4 + k-4)] + [k-4k3 . (k-1 + k2)] + [k1k4 . (k3 + k-2)] + [k1k2 . (k4 + k3)] + [k-3k-2 . (k-1 + k-4)] + [k-4k-3 . (k-1 + k2) . [S2]] + [k-3k1 . (k-2 + k2) . [S1] . [S2]]

Quand la protéine de transport atteint cette distribution plus rapidement que les changements des concentrations [S1] et [S2], la vitesse nette de translocation du soluté au travers de la membrane est décrite par le flux net du soluté via la protéine de transport :

Jnet = k2.[PS1] - k-2.[PS2] = [Ptotal] . {k1k2k3k4.[S1] - k-1k-2k-3k-4.[S2]} / Den

A l'équilibre, les vitesses dse réactions aller et retour de chaque étape du cycle sont égales et le flux net du soluté via la protéine de transport est = 0.

Dès lors : [S2]equil / [S1]equil = (k1k2k3k4) / (k-1k-2k-3k-4)

Approximation de l'équilibre rapide de fixation

Si on fait 2 hypothèses :

  • la fixation du soluté à la protéine de transport est plus rapide que les changements conformationnels de la protéine de transport
  • les constantes d'équilibre de dissociation KS du complexe [soluté/protéine de transport] sont les mêmes des 2 côtés de la membrane (c'est-à-dire pour les 2 conformations de la protéine de transport). Cette hypothèse n'est pas valable si les conditions physico-chimiques (pH, force ionique, ...) sont très différentes entre les 2 compartiments.

On a alors les relations :

  • (k-4.[P1] - k4.[P2]) + (k2.[PS1] - k-2.[PS2]) = 0
  • [Ptotal] = [P1] + [P2] + [PS1] + [PS2]
  • KS = k-1 / k1 = [P1] . [S1] / [PS1]
  • KS = k3 / k-3 = [P2] . [S2] / [PS2]

Remarque : si les conditions physico-chimiques entre les 2 compartiments sont très différentes, il faut remplacer le terme ([S1] / KS) par ([S1] / KS1) et le terme ([S2] / KS) par ([S2] / KS2).

L'expression de la distribution des 2 états conformationnels ([PS1] et [PS2]) de la protéine de transport à l'état stationnaire peut-être simplifiée :

  • [PS1] = ([Ptotal] / Den) . [k-2 . [S2]/KS + k4] . ([S1] / KS)
  • [PS2] = ([Ptotal] / Den) . [k2 . [S1]/KS + k-4] . ([S2] / KS)

Le flux net du soluté via la protéine de transport s'exprime :

Jnet = k2.[PS1] - k-2.[PS2] = ([Ptotal] / Den) . [(k2k4.[S1]/KS) - (k-2k-4.[S2]/KS)]

Où : Den = {(1 + [S1]/KS) . (k-2.[S2]/KS + k4)} + {(1 + [S2]/KS) . (k2.[S1]/KS + k-4)}

Dès lors : [S2]equil / [S1]equil = (k2k4) / (k-2k-4)

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e. Exemple du transport facilité du glucose par les perméases GLUT

Les perméases du glucose GLUT ("GLUcose Transporter") assurent le transport facilité du glucose. Les transporteurs GLUT existent à la surface de toutes les cellules.

Les transporteurs GLUT fonctionnent dans les 2 sens (entrée et sortie du glucose) en fonction du gradient de concentration.

  • si le taux de glucose sanguin est élevé, les transporteurs GLUT des cellules hépatiques le font entrer dans la cellule.
  • pendant une période de jeûne, si le taux de glucose sanguin chute, les cellules hépatiques convertissent leur stock de glycogène en glucose.
  • quand la concentration intracellulaire du glucose dépasse la concentration du glucose dans le plasma, il est alors transporté à l'extérieur de la cellule par les transporteurs GLUT.

Certaines cellules où a lieu la diffusion facilitée peuvent maintenir un état éloigné de l'équilibre en maintenant la concentration d'une molécule à une concentration très faible.

C'est le cas du glucose qui entre dans la cellule car il est immédiatement phosphorylé en glucose 6-phosphate (hexokinase ou glukokinase).

entree glucose transporteur GLUT4 insuline membrane fusion transport passif facilite biochimej

Il existe de nombreuses isoformes qui constituent une famille de 14 transporteurs d'hexoses chez l'homme (GLUT1 à GLUT12, GLUT14, et HMIT) subdivisée en 3 classes.


Quelques transporteurs d'oses GLUT : 12 hélices α transmembranaires.
GLUT1 (gène SLC2A1) : transcrit dans divers tissus mais à un faible niveau dans le foie et les muscles squelettiques. C'est le principal transporteur du glucose dans les érythrocytes (voir ci-dessous).
GLUT2 (gène SCL2A2) : transcrit essentiellement dans le foie, les cellules pancréatiques β, les reins et les intestins. Transport bi-directionnel du glucose au travers de la membrane. Il transporte aussi le fructose et le galactose.
GLUT3 (gène SCL2A3) : transcrit essentiellement dans les neurones. De tous les transporteurs du glucose, c'est celui qui a la valeur de KD la plus faible.

GLUT4 (gène SCL2A4) : transcrit essentiellement dans les tissus insulino-dépendants comme les tissus adipeux et les muscles squelettiques mais aussi dans les cellules cardiaques et le cerveau . Hautement spécifique du glucose : KMglucose ≈ 5 mM. Il transporte aussi le mannose, le galactose, l'acide déshydro-ascorbique et la glucosamine.
Voir un développement ci-dessous.

GLUT5 (gène SCL2A5) : transcrit essentiellement dans les entérocytes et les intestins. Il transporte spécifiquement le fructose.
GLUT6 (gène SCL2A6) : transcrit essentiellement dans le cerveau et les leukocytes. Il transporte le glucose. Attention : il a aussi comme appellation GLUT9 mais il est différent du suivant.
GLUT9 (gène SCL2A9) : transcrit essentiellement dans les reins, le foie et le placenta. Il transporte le glucose à une vitesse faible. Il transporte aussi l'urée et le fructose.

Transport insulino-dépendant du glucose par GLUT4

Dans une cellule non stimulée ou quand la concentration en insuline est faible, le transporteur insulino-dépendant du glucose GLUT4 ("GLUcose Transporter 4") est localisé dans des vésicules de stockage des cellules hépatiques et musculaires.

Quand le niveau de glucose circulant est élevé, l'insuline est libérée par les ilots de Langerhans et elle augmente :

  • la synthèse du transporteur GLUT4
  • la translocation de ce transporteur des compartiments endosomiques vers la membrane plasmique

Les vésicules fusionnent avec la membrane plasmique : l'absorption du glucose dans le muscle et le tissu adipeux augmente.

Entree glucose transporteur GLUT4 recepteur insuline transport passif facilite biochimej

Structure de GLUT4

La chaîne polypeptidique de GLUT4 contient 509 acides aminés qui forment 12 hélices α transmembranaires :

  • Le domaine N-terminal contient les hélices transmembranaires I à VI
  • le domaine C-terminal contient les hélices VII à XII

Ces 2 domaines forment un pseudo-axe de symmétrie autour d'un tunnel central polaire qui laisse entrer/sortir le glucose. Ce tunnel de nature amphipathique semble formé par les hélices 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10 et 11.

Les séquences cytoplasmiques des extrémités N-terminale et C-terminale sont particulières et expliquent en grande partie l'aptitude au traffic transmembranaire de ce transporteur.

  • la séquence N-terminale contient un résidu phénylalanine (F) critique
  • la séquence C-terminale contient deux leucines concomitantes (LL) et des motifs acides

Ces motifs dirigent probablement les aspects cinétiques de l'endocytose et de l'exocytose dans un systéme continu de traffic de recyclage.

Source : Huang & Czech (2007)

transport facilite structure transporteur GLUT4 biochimej

Les deux leucines et les motifs acides de l'extrémité C-terminale sont trouvés également dans une aminopeptidase ("Insulin-Regulated AminoPeptidase" - IRAP) qui, de manière semblable dans les adipocytes, est séquestrée dans des membranes intracellulaires enrichies en GLUT4 et sujette à l'action de l'insuline.


Régulation de l'activation de GLUT4 et rôle inhibiteur de l'ATP

Pour être fonctionnel, GLUT4 doit être activé au niveau de la membrane plasmique. Cette activation est régulée :

  • Par des interactions protéine-protéine. Par exemple, la fixation de l'hexokinase II sur GLUT4 inhibe l'activation. Cette inhibition semble levée par la fixation de la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase sur l'extrémité cytoplasmique de GLUT4.
  • Par des petites molécules (génistéine, myricétine).

La fixation de l'ATP sur GLUT1 (transporteur du glucose des érythrocytes) supprime son activité de transport.

Divers expériences et un modèle structural obtenu par simulation (figure ci-contre) tendent à montrer un rôle semblable de l'ATP pour GLUT4.

Source : Mohan et al. (2010)

Structure transporteur transport GLUT4 biochimej

Quand l'ATP est fixé, l'interface entre les 2 domaines de GLUT4 adopte une conformation plus compacte en raison de réarrangements de nombreuses liaisons hydrogène et de ponts salins inter-domaines.

La poche de fixation de l'ATP est formée par la boucle qui relie les hélices transmembranaires VIII et IX. Cette poche confine le motif de fixation de l'ATP (GRRTLHL) : elle est entourée par l'extrémité cytoplasmique des hélices transmembranaires V, X et XII.

  • La poche de fixation est entourée par les acides aminés R169, R349, R350, R416, R467, E345 et H353 dont certains semblent impliqués dans la fonction de transport du glucose.
  • Les acides aminés E345, E409 et R416 sont très conservés dans les séquences de transporteurs de glucose car ils jouent un rôle dans le changement de conformation du transporteur.

Mécanismes de la régulation de la transcription de GLUT4 par la CaMKII

[La signification des abréviations ci-dessous sont sous la figure ci-contre.]

A : la contraction des muscles pendant un exercice physique augmente la concentration cytosolique de Ca2+.

B : Ca2+ se fixe à la calmoduline et l'active.

C : le complexe [Ca2+/calmoduline] se fixe sur le domaine "calmoduline-like" de la CaMKII et l'active.

D : la CaMKII phosphoryle les HDAC de la classe II au sein des complexes [MEF2/HDAC] fixés sur le promoteur du gène Glut4, ce qui induit la dissociation des complexes et l'export du noyau des HDAC (E).

F : MEF2 forme alors des complexes avec des "HAT-like" comme p300. Les HAT acétylent les histones aux voisinage du domaine de MEF2 qui se fixe sur le gène Glut4. Cela augmente l'accessibilité des facteurs de transcription et des ARN polymérases, ce qui augmente le taux de synthèse de GLUT4 (G).

H : L'activation de l'AMPK (protéine kinase activée par l'AMP) est un autre signal important qui médie l'augmentation de la transcription du gène GLUT4 induite par l'exercice physique.

Structure transporteur transport GLUT4 calmoduline kinase biochimej

Source : Ojuka et al. (2012)

HDAC : histone désacétylases
MEF2 : "Myocyte Enhancer Factor 2"
HAT : histone acétyl-transferases
GEF : "GLUT4 Enhancer Factor"

f. Les protéines de transport facilité de la superfamille MFS

Chez les procaryotes, 25% des protéines de transport qui assurent la diffusion facilitée appartiennent à une superfamille : "Major Facilitator Superfamily" ou MFS.

  • Les protéines de transport MFS sont ubiquitaires et trouvées dans les 3 règnes des organismes vivants.
  • Voir la liste des transporteurs des sucres (Uniprot) : "Major facilitator superfamily - Sugar transporter (TC 2.A.1.1) family".
  • La plupart des protéines de transport MFS contiennent entre 400 et 600 acides aminés et possèdent 12, 14 ou 24 hélices α transmembranaires.
  • Les transporteurs GLUT sont des "major facilitator superfamily (MFS)-type passive transporters".
  • Les protéines de transport MFS sont spécifiques du transport des sucres, des polyols, des neurotransmetteurs, des métabolites du cycle de Krebs, des intermédiaires phosphorylés de la glycolyse, des acides aminés et des peptides, des osmolites, des siderophores, des nucléosides, des anions organiques et inorganiques ...
  • Les protéines de transport MFS catalysent des transports de type :
    1. uniport
    2. symport [soluté/H+] ou symport [soluté/Na+]
    3. antiport [soluté/H+] ou antiport [soluté/soluté]

Illustration de XylE

Figure ci-contre : structure de XylE fixé au D-xylose (au centre de la figure).

XylE est un symport MFS ([D-xylose/H+]) de Escherichia coli, homologue de GLUT1, GLUT2, GLUT3 et GLUT4.

Le repliement de XylE est typique des MFS :

  • 12 hélices transmembranaires organisées en 2 domaines distincts (domaines N et C) avec les extrémités N- et C-terminales localisées du côté intracellulaire
  • contrairement aux autres transporteurs de type MFS dont la structure est connue, XylE contient un domaine intracellulaire avec 4 hélices : 3 hélices qui connectent les domaines N- et C-terminaux et 1 hélice à l'extrémité C-terminale
  • les hélices transmembranaires 7 et 10 sont discontinues ce qui doit faciliter les changements conformationnels qui ont lieu lors du transport du substrat

Les hélices extracellulaires et intracellulaires sont colorées en bleu foncé (en haut) et en orange (en bas), respectivement.

Structure transporteur GLUT4 biochimej

Source : Sun et al. (2012) - PDB : 4GBY

Le D-xylose est piègé au centre du domaine transmembranaire : ce domaine est complètement occlu du côté intracellulaire mais il est accessible au solvant du côté extracellulaire via un canal trop étroit pour permettre la fuite du D-xylose.

Les groupements hydroxyle du D-xylose sont reconnus spécifiquement (via 8 liaisons hydrogène) par des acides aminés polaires dont : Gln168 (hélice transmembranaire 5 - HT5), Gln288, Gln289, Asn294 (HT7), Trp 392 (HT10) et Gln 415 (HT11).

Hormis Gln415, tous ces acides aminés sont invariants chez GLUT1, GLUT2 , GLUT3 et GLUT4.

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5. Le transport actif primaire ou direct

a. Généralités

Symport : transport de deux (ou plus) solutés dans le même sens via un gradient électrochimique.

SExtracellulaire + H+Extracellulaire ou Na+Extracellulaire <===>  SIntracellulaire + H+Intracellulaire ou Na+Intracellulaire

La vitesse de transport par les uniports (transport d'un seul soluté dans un seul sens) ou les symports est d'environ 102 - 104 molécules.sec-1.

Antiport : un soluté est transporté dans le sens de son gradient de concentration, l'autre soluté est transporté dans le sens opposé à son gradient de concentration. La protéine qui assure ce type de transport existe dans deux conformations (P et P*) en interconversion :

S1Extracellulaire + P <===> S1Intracellulaire + P*

P* + S2Intracellulaire <===> S2Extracellulaire + P

Exemples de protéines membranaires effectuant un transport actif primaire :

  • pompe à calcium ou ATPase - Ca2+ (uniport)
  • pompe à protons ou ATPase - H+ (uniport)
  • pompe sodium - potassium ou ATPase - [Na+/K+] (antiport : 3 Na+ expulsés vers le milieu extracellulaire et 2 K+ importés dans le milieu intracellulaire)
  • pompe [protons - potassium] ou ATPase - [H+/K+] (antiport)
  • ATP/ADP : antiport qui échange ATP4- contre ADP3- ===> électrogènique / le potentiel de membrane (mitochondrie) est en faveur de l'export de l'ATP
  • α-cétoglutarate : antiport qui échange l'α-cétoglutarate (2-) contre le malate (2-) ou le succinate (2-) ===> électriquement neutre
  • antiports d'acides aminés : [agmatine / arginine] - [cadaverine / lysine] - [putrescine / ornithine]

Exemples de transport actif par les protéines de transport MFS :

b. Principe du transport actif primaire

Le transport actif primaire utilise de l'énergie (souvent issue de l'hydrolyse de l'ATP) pour transporter un soluté contre son gradient de concentration.

Transport actif secondaire secondary pompe pump Na K biochimej

c.Description du cycle de la pompe à sodium - potassium ou ATPase - [Na+/K+]

1. Cet antiport est initialement dans un état E1 à haute affinité pour l'ion Na+. Il fixe 3 ions Na+ dans le cytosol : formation du complexe E1-3Na+.

Les résidus aspartate sont phosphorylés. On aboutit au complexe E1-ATP-3Na+.

2. L'hydrolyse de l'ATP génère un complexe à haute énergie E1-P-3Na+.

La structure de ce complexe se relâche par un changement de conformation : le site de fixation du Na+ est exposé au milieu extra-cellulaire.

Il s'ensuit le relarguage de 3 ions Na+ dans le milieu extra-cellulaire et la formation d'un complexe E2-P qui a une haute affinité pour l'ion K+.

Source : "Membrane III"

Transport actif secondaire secondary pompe pump Na K biochimej

3. La pompe fixe alors 2 ions K+ du milieu extra-cellulaire et forme le complexe E2-P-2K+.

4. L'hydrolyse du groupement phosphate génère un complexe à haute énergie E2-2K+.

5. L'énergie de ce complexe lui permet de changer de conformation : le site de fixation de K+ est alors orienté vers le cytosol. Il s'ensuit le relarguage de 2 ions K+. La forme E1 de la pompe est régénérée et le processus peut recommencer.

Voir une animation du fonctionnement de la pompe ATPase - [Na+/K+].

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6. Les pompes - transport actif primaire

La vitesse de transport des ions par les pompes est d'environ 102 - 103 ions.sec-1.

Il existe une très grande variété de pompes.

a. Les types de pompes

α. Les pompes ioniques ou ATPases ionophores : l'énergie qu'elle libère en hydrolysant l'ATP est utilisée pour le transport d'ions. Il en existe différents types :

ATPases de type "P" : ce sont des transporteurs de cations avec formation d'un intermédiaire phosphorylé à haut potentiel énergétique. Ce sont soit des monomères d'environ 100 kDa ou des oligomères.

Elles transportent le calcium, les protons ou échangent le sodium et le potassium à travers la membrane plasmique des Eucaryotes.

  • pompe à calcium ou ATPase - Ca2+ (uniport)
  • pompe sodium - potassium ou ATPase - [Na+/K+] (antiport)
  • pompe protons - potassium ou ATPase - [H+/K+] (antiport)

ATPases de type "F" (ou FoF1-ATPase) :

  • membrane plasmique des bactéries
  • membrane interne de la mitochondrie
  • membrane des thylacoïdes des chloroplastes

pompe pump type F ATPase transport actif biochimej

Source : Armen et al. (2007)

ATPases de type "V" (ou vacuolaire) : ce sont pompes à protons que l'on trouve dans les membranes des vacuoles, des lysosomes, de l'appareil de Golgi, des endosomes, ...

Il n'y a pas de phosphorylation intermédiaire de l'enzyme.

Elles sont constituées de 2 types de chaînes polypeptidiques (A : 78 - 89 kDa et B : 60 - 65 kda) selon une organisation qui ressemble à celle des ATPases de type "F".

Type V ATPase pompe pump transport membrane biochimej

Source : Armen et al. (2007)

Autres types d'ATPases

  • de type "M" : transporteur de drogues
  • de type "H" : activité ATPase des protéines de choc thermique
  • de type "C" : impliquées dans les phénomènes de contraction (myosine)

Superfamille des transporteurs ABC ("ATP Binding Cassette transporters")

Ce sont des transporteurs qui existent des Procaryotes à l'homme. Ils assurent le transport des acides aminés, des peptides, des sucres, des ions, ...

Le module ABC (environ 200 acides aminés) fixe et hydrolyse l'ATP.

Figure ci-contre : "Multidrug ABC transporter SAV1866" - état fermé.

Voir :

Structure ABC transporteur transporter pompe pump biochimej

Source : PFAM

β. Pompes phosphotransférases chez Escherichia coli : mécanisme par translocation d'un groupe phosphoryle / la source d'énergie est le phosphoénolpyruvate.

γ. Pompes photosensibles chez les bactéries halophiles : la bactério-rhodopsine (pompe à H+) et l'halo-rhodopsine (pompe à Cl-) / mécanisme : couplage direct d'énergie lumineuse avec un transport actif de protons.

Voir le mécanisme dans le cas de la vision de l'oeil : photon / rhodopsine / transducine / canal ionique.

b. Mécanisme d'activation des pompes ATPases - Ca2+ par la calmoduline

Les ions calcium sont des messagers secondaires de nombreuses voies de transduction du signal.

Les cellules investissent beaucoup d'énergie dans le contrôle et le maintien d'un gradient entre la concentration intracellulaire (≈ 0.1 μM) et extracellulaire (≈ 2 mM) de calcium.

La famille des pompes à calcium activées par la calmoduline, à laquelle appartiennent les Ca2+-ATPases de la membrane plasmique ("Plasma-Membrane Ca2+-ATPase"), sont des régulateurs clé de la concentration intracellulaire de calcium chez les Eucaryotes.

Contrairement aux autres ATPases de type P, les Ca2+-ATPases contiennent un domaine N-terminal (chez les plantes) ou C-terminal (chez les mammifères) responsable de l'auto-inhibition.

Le domaine N-terminal auto-inhibiteur contient plusieurs acides aminés basiques conservés capitaux pour l'auto-inhibition : Arg58, Arg61, Lys67 et Lys68.

Figure ci-contre : Structure de la Ca2+-ATPase de Arabidopsis thaliana.

  • A : domaine activateur
  • N : domaine de fixation du nucléotide
  • P : domaine de phosphorylation
  • En vert : domaine auto-inhibiteur (acides aminés 40 à 95) qui forme une longue hélice α

Source : Tidow et al. (2012)

Pompe calcium atpase calmodulin

1er temps : quand la concentration en calcium augmente, le complexe Ca2+-CaM se fixe d'abord au premier site de fixation à haute affinité (CaMBS1 - "CaM Binding Site 1").

Cette fixation déplace ce site dans la région entre les domaines A et N et permet les mouvements des domaines cytoplasmiques nécessaires au pompage des ions quand la concentration du calcium est basale.

Figure ci-contre : Mécanisme proposé pour l'activation de la Ca2+-ATPase de Arabidopsis thaliana par la CaM.

La fixation de deux molécules de CaM complexée au calcium déplace l'hélice auto-inhibitrice du coeur catalytique, ce qui active la Ca2+-ATPase.

Source : Tidow et al. (2012)

Activation pompe calcium atpase calmodulin

2ème temps : un accroissement supplémentaire de la concentration en calcium déplace le second site CaMBS2 du coeur catalytique : la pompe est alors pleinement activée.

Ce mécanisme en 2 temps explique la régulation médiée par la calmoduline sur une telle gamme de concentration de calcium (4 ordres de grandeur).

L'analyse des séquences indiquent que l'existence de 2 sites de fixation de la CaM n'est pas propre à Arabidopsis thaliana mais est trouvé chez de nombreuses plantes.

Figure ci-contre : Structure du complexe [Ca2+-ATPase/CaM2] à une résolution de 1.95 Å.

Les 2 sites de fixation de la CaM sont séparés par 8 acides aminés.

Source : Tidow et al. (2012)

cryoelectron microscopy  cryoEM

Figure de gauche : forme auto-inhibée de la Ca2+-ATPase de la membrane plasmique ("Plasma-Membrane Ca2+-ATPase").

Figure de droite : fixation de deux molécules de calmoduline (complexée au calcium) sur les sites de fixation à haute affinité (en vert clair et en bleu clair). Cette fixation déplace l'hélice auto-inhibitrice du coeur catalytique, ce qui active la pompe à ion.

c. L'ATP synthase FoF1

Attention : il ne faut pas la confondre avec les FoF1-ATPases car elle fonctionne à l'envers des pompes ioniques.

En effet, le complexe V de la chaîne respiratoire, appelé ATP synthase F0F1, utilise le gradient de concentration de protons comme source d'énergie pour synthétiser l'ATP.

Le sigle "F" désigne un facteur de couplage, selon la nomenclature des enzymes : en effet, l'ATP synthase couple la phosphorylation de l'ADP en ATP à l'oxydation de substrats par la mitochondrie.

Les ATP synthases sont des protéines oligomériques de masse molaire supérieure à 450 kDa et de structure très complexe : les types différents de chaînes polypeptidiques qui les composent sont au nombre de 8 chez E. coli, 8 ou 9 dans le chloroplaste, 10 ou plus dans la mitochondrie et au moins 13 pour celle du coeur de boeuf.

  • F1 est l'élément qui catalyse la synthèse de l'ATP.
  • le composant F1 de l'ATP synthase de E. coli a une stoechiométrie α3β3γδε (chaque lettre indiquant un type différent de sous-unité)
  • le composant F1 de l'ATP synthase de E. coli déborde dans le cytosol et celui de la mitochondrie déborde dans la matrice
  • F0 constitue un "tunnel" à protons sur toute l'épaisseur de la membrane interne de la mitochondrie. Il a été baptisé ainsi du fait de sa sensibilité à l'oligomycine, antibiotique qui en se fixant à F0 empêche la synthèse d'ATP
  • le composant F0 de l'ATP synthase de E. coli a une stoechiométrie a1b2c10-15
  • la structure et la composition oligomérique du composant F0 de la mitochondrie est plus complexe que celui de E. coli

Source : Dimroth et al. (2006)

ATP synthase

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7. Transport actif secondaire

a. Principe

Le transport actif primaire utilise de l'énergie pour transporter un soluté contre son gradient de concentration.

Mais ce gradient devient à son tour une source d'énergie : en effet, si le même soluté est transporté cette fois dans le sens de son gradient de concentration, l'énergie qui est libérée peut-être utilisée pour transporter un autre soluté.

Ce transport actif est donc appelé secondaire parce que sa source d'énergie (le gradient électrochimique) doit être préalablement générée par un transport primaire.

Exemple du transport du glucose

Il s'agit du transport actif via les symports [Na+ / glucose] ("Sodium Glucose Co-Transporter") - SGLT1 et SGLT2.

Cotransport actif secondaire secondary permease SGLT1 GLUT glucose sodium biochimej

Ces symports utilisent le gradient transmembranaire de Na+généré par la pompe ATPase - [Na+/K+] (voir ci-dessus).


Les symports [Na+/ glucose]
SGLT1 (gène SCL5A1) : symport [Na+ / glucose] ("Sodium/Glucose Co-Transporter 1"). Le rapport du transport est 1 molécule de glucose pour 2 ions Na+. Il contient 11 hélices α transmembranaires.
SGLT2 (gène SCL5A2) : symport [Na+ / glucose] ("Sodium/Glucose Co-Transporter 2"). Le rapport du transport est 1 molécule de glucose pour 1 ion Na+. Il contient 14 hélices α transmembranaires.

b. Description du cycle de la lactose perméase de Escherichia coli

  • La lactose perméase est un transporteur de la famille MFS qui co-transporte les ions H+ et le lactose dans la cellule.
  • C'est un symport [protons - lactose]. Il accumule des sucres dans le cytosol via un transport actif secondaire.
  • Il utilise un gradient d'ions H+ généré par des processus métaboliques qui accroissent la concentration en ions H+ dans le milieu extra-cellulaire.

Ce transporteur existe sous 2 formes : E1 et E2.

  • la forme E1 a un site de fixation du lactose à faible affinité orienté vers le milieu intra-cellulaire.
  • la forme E2 a un site de fixation du lactose à haute affinité orienté vers le milieu extra-cellulaire.

Transport actif secondaire secondary lactose permease

Source : "Membrane III"

La forme E1 n'est convertie en forme E2 que quand les sites de fixation du H+ et du lactose sont soit libres, soit occupés.

1. La forme E2 fixe le lactose. Quand la concentration extra-cellulaire du H+ augmente, la conformation du transporteur change : le site de fixation du lactose est alors orienté vers le milieu intra-cellulaire et devient un site à faible affinité (forme E1). Le lactose est alors relargué.

2. Les processus métaboliques diminuent la concentration du H+ : la forme E1, qui jusque là était ligandée au H+, relargue ce H+. Les 2 sites de fixation étant libres, l'enzyme re-bascule dans la forme E2.

Le mécanisme peut de nouveau avoir lieu ce qui accroît la concentration intra-cellulaire du lactose.

Visualisation de la lactose perméase de Escherichia coli complexée à un thiodigalactoside, à une résolution de 3,6 Å

Code PDB : 1PV7

Seule la chaîne A est représentée.

La structure peut prendre quelques secondes avant d'apparaître.

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8. Illustration : les transports au travers des membranes mitochondriales

Les canaux ioniques "Voltage-dependent anion-selective channel proteins" (VDAC) sont des porines de la membrane externe de la mitochondrie qui constituent la voie principale pour l'échange d'un grand nombre de métabolites. Il existe 3 isoformes de VDAC chez l'homme.

Leur structure est en forme de tonneau β :

  • exemple : VDAC-1 est composé de 19 brins β ce qui représente une nouvelle classe de protéine membranaire.
  • le tonneau β a un diamètre interne de environ 2,5 nm qui permettrait le transport de métabolites (exemples : acides gras, pyruvate, acides aminés, nucléotides, ions ...).
  • le changement de conformation de ces canaux anioniques dépend du potentiel de membrane : ils sont ouverts pour un potentiel nul et fermés pour un potentiel de 30 - 40 mV.

L'hexokinase, la glucokinase et la glycérol kinase (enzymes cytosoliques ATP-dépendantes) et la créatine kinase (enzyme mitochondriale) sont fixées à VDAC.

De plus VDAC est un important régulateur du transport du Ca2+. En effet, Ca2+ est un co-facteur de la pyruvate déshydrogénase et de l'isocitrate déshydrogénase : la production énergétique et l'homéostasie énergétique sont donc toutes deux tributaires de la perméabilité de VDAC au Ca2+.

transport VDAC voltage dependent anion selective channel membrane interne mitochondrie carnitine coenzyme A

Source : Brenner et al. (2011)

VDAC est associée à :

  • L'adénine nucléotide translocase (ANT) :
    1. ANT est une protéine constituée de 6 hélices α transmembranaires sous forme de dimère)
    2. ANT échange l'ADP et l'ATP via un transport actif. C'est un antiport : l'ADP est transporté du cytoplasme vers la matrice mitochondriale et l'ATP en sens inverse.
    3. C'est le potentiel de membrane (gradient de protons) qui est la force motrice.
  • la cyclophiline D (CypD - peptidyl-prolyl cis-trans isomérase) située dans la matrice mitochondriale.

L'ensemble VDAC, ANT et CypD forme ce que l'on appelle le "Permeability Transition Pore complex".

Les autres principaux transports sont :

  • Le phosphate inorganique est transporté par le symport [H+/H2PO4-].

Source : "Lehninger Principles of Biochemistry" 5th edition (2008) - WH Freeman

transport acide gras membrane interne mitochondrie carnitine coenzyme A

Le transport des acides gras au travers de la membrane interne de la mitochondrie est facilité par leur liaison à la carnitine.

L'acide gras à transporter se fixe au coenzyme-A qui est remplacé par la carnitine pour former l'acyl-carnitine (figure ci-dessous).

Cette réaction est catalysée par la carnitine O-palmitoyltransférase 1.

carnitine transport acide gras membrane interne mitochondrie coenzyme A biochimej

La carnitine est ensuite reconnue par un transporteur : la carnitine/acyl-carnitine translocase situé dans la membrane interne.

Ce transporteur ("mitochondrial carnitine/acylcarnitine carrier protein") échange le complexe [acide gras-carnitine] pour une carnitine libre issue de l'intérieur de la mitochondrie.

La carnitine est séparée de l'acide gras dans la matrice par la carnitine palmitoyltransférase 2 (E.C. 2.3.1.21).

L'acide gras se fixe au coenzyme-A pour former un palmitoyl-CoA qui subit la β-oxydation dans la matrice.

transport acide gras membrane interne mitochondrie coenzyme A biochimej

Source : Wikipédia

 

9. Liens Internet et références bibliographiques

"Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn et Scrimgeour (1994) - Ed. DeBoeck Universités - ISBN : 2-8041-1578-X

"Carrier mediated transport through biomembranes " - Ranjan et al. (2011)

Cours : "Transports membranaires" - Université Bordeaux

Voir des animations des différents types de transport

Animations et quizz : "Biology, Eighth Edition (Raven)"

Bases de données

"Transporter Classification database"

"TransportDB : Relational database describing the predicted cytoplasmic membrane transport protein complement for organisms whose complete genome sequence are available"

"OPM : Orientations of Proteins in Membranes database"

"Ligand-Gated Ion Channel database"

 

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