Les inhibitions des réactions enzymatiques
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1. Définition et caractéristiques générales des inhibiteurs

2. Inhibition compétitive (fixation exclusive)

3. Inhibition non compétitive (fixation non exclusive) 

4. Inhibition incompétitive (fixation non exclusive)

5. Tableau résumé des modifications des paramètres cinétiques en présence de l'un des trois inhibiteurs précédents

6. Inactivation : inhibition IRréversible

7. Inhibition par excès de substrat

8. Exemples de mécanismes plus complexes

9. Liens Internet et références bibliographiques

Démonstration de l'équation de vitesse pour une inhibition de type : 

Représentation graphique pour une inhibition de type :

 

1. Définition et caractéristiques générales des inhibiteurs

Toute molécule qui modifie la vitesse d'une réaction enzymatique est appelée un effecteur :

  • les effecteurs qui augmentent l'activité enzymatique sont des activateurs
  • à l'inverse, ceux qui la diminuent sont des inhibiteurs
  • certaines molécules peuvent, selon les conditions, se comporter comme un activateur ou un inhibiteur.

La modulation (inhibition ou activation) de l'activité enzymatique est un mode de régulation primordial des voies métaboliques dans la cellule, d'autant que les inhibiteurs naturels sont multiples : antibiotiques, toxines, drogues, poisons ... 

L'étude de l'effet d'inhibiteurs permet :

  • d'affiner le mécanisme catalytique d'une réaction enzymatique
  • de mieux connaître la spécificité d'une enzyme
  • d'obtenir des données physiques et chimiques concernant le site actif

En effet, certains inhibiteurs s'associent de manière réversible à l'enzyme en interagissant de manière non covalente.

D'autres se fixent de manière IRréversible et sont souvent utilisés pour déterminer les groupes actifs du site catalytique.

intermediaire tetrahedrique catalyse protease serine active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

Figure ci-dessus : mécanismes d'inhibition des protéases à sérine par différents composés qui forment un intermédiaire tétrahédrique.

Ces composés ont permis d'identifier la sérine 195 du site actif.

Selon le type d'inhibiteur, l'enzyme peut fixer :

  • le substrat ou l'inhibiteur : c'est la fixation exclusive avec formation de complexes binaires ES ou EI
  • le substrat et l'inhibiteur : c'est la fixation non-exclusive avec formation de complexes ternaires (ESI). Si ce complexe ternaire reste encore actif (moins que le complexe ES), l'inhibition est dite partielle et s'il est totalement inactif, l'inhibition est dite totale.

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2. Inhibition compétitive (fixation exclusive)

C'est un mécanisme où la fixation de l'inhibiteur empêche celle du substrat (et réciproquement) : la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont donc mutuellement exclusives.

Le mécanisme réactionnel :

Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

Différents modèles rendent compte du mécanisme de l'inhibition compétitive :

  • Dans le modèle 1 il n'existe qu'un site de fixation pour les deux molécules : la fixation mutuellement exclusive résulte d'une analogie de structure entre le substrat et l'inhibiteur. 
  • Il existe cependant d'autres modèles (modèles 2 à 4) où le substrat et l'inhibiteur se fixent sur des sites distincts. L'inhibition est malgré tout de type compétitif pour diverses raisons structurales.
  • Modèle 5 : l'un des principaux modes de régulation des voies métaboliques est la rétro-inhibition : un métabolite (souvent terminal) d'une voie métabolique donnée inhibe une enzyme qui catalyse la première (ou l'une des premières) étape(s) de cette voie. Cependant, le substrat et l'inhibiteur n'ont pas (ou peu) d'homologie structurale (modèle 5) : c'est le changement conformationnel de l'enzyme induit par la fixation de l'inhibiteur qui empêche celle du substrat (et réciproquement). Les enzymes sujettes à ce mode de régulation sont souvent des enzymes multimériques à régulation allostérique : par exemple, l'aspartate transcarbamylase, la glutamine synthétase ... 

En présence d'un d'inhibiteur compétitif, KM est augmentée et VM n'est pas modifiée (voir tableau).

Celà signifie que l'inhibition compétitive peut-être "levée" à concentration saturante en substrat. En effet, puisque la fixation du substrat et celle de l'inhibiteur sont mutuellement exclusives, l'addition d'une très forte concentration de substrat déplace l'équilibre E + S <==> ES en faveur de ES et donc déplace l'équilibre EI <==> E + I en faveur de E.

Vitesse relative (ou activité fractionnaire) en absence et en présence d'inhibiteur : le degré d'inhibition induit par un excès d'inhibitieur compétitif de n fois est maximal quand la concentration du substrat ET la concentration de l'inhibiteur sont beaucoup plus importantes que KM et KI, respectivement (voir un développement).

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3. Inhibition non compétitive (fixation non exclusive)

Un inhibiteur non compétitif classique n'a aucune influence sur la fixation du substrat (et réciproquement) : les sites de fixation du substrat et de l'inhibiteur sont distincts.

En conséquence, l'inhibiteur se fixe à l'enzyme libre E et au complexe ES ; de même, le substrat se fixe à l'enzyme libre E et au complexe EI.

Les inhibiteurs non compétitifs n'ont pas d'homologie structurale avec le substrat.

Le mécanisme réactionnel :

Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

  • Dans le modèle classique du mécanisme de fixation de l'inhibiteur, celle-ci ne modifie pas la manière dont se fixe le substrat mais elle empêche les ajustements conformationnels du site actif qui devraient avoir lieu pour qu'il y ait catalyse : le complexe ternaire ESI est inactif.
  • Un autre modèle suggère qu'il n'y a pas de transconformation possible entre ES et ESI, c'est-à-dire qu'il n'y a pas d'équilbre : ES + I <==> ESI. Cependant, l'effet de l'inhibiteur est le même que dans le modèle classique parce que les 4 formes de l'enzyme (E, EI, ES et ESI) sont en équilibre (ESI <==> EI <==> E <==> ES).
En présence de ce type d'inhibiteur :
  • VM est diminuée (voir tableau) : une partie des molécules d'enzyme se trouvant sous la forme EI et ESI, conjointement au complexe ES, il y a donc moins de molécules d'enzyme productives.
  • KM n'est pas modifiée : les sites de fixation étant distincts, la saturation par le substrat des molécules d'enzyme libre E n'est pas modifiée.
  • cette inhibition ne peut être levée en présence de fortes concentrations en substrat.
Inhibition non compétitive "pure" et "mixte" :
  • on appelle "pure", l'inhibition non compétitive où l'inhibiteur se fixe avec la même affinité à l'enzyme libre E et au complexe enzyme - substrat ES (KI = K'I) ;
  • on appelle "mixte", l'inhibition non compétitive où l'inhibiteur se fixe avec des affinités différentes à E et à ES (KI différent K'I).
L'inhibition non compétitive est rare et on en trouve des exemples essentiellement dans le cas des enzymes à régulation allostérique. 

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4. Inhibition incompétitive (fixation non exclusive)

Ce type d'inhibition est aussi appelé inhibition par blocage du complexe intermédiaire. Cette appellation décrit mieux le mécanisme : l'enzyme et le substrat forment d'abord le complexe enzyme-substrat (le complexe intermédiaire), puis l'inhibiteur se fixe à ce complexe.  

Le mécanisme réactionnel :

Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

Il y a formation d'un complexe ternaire ESI inactif (voir le modèle). Ce type d'inhibition est essentiellement observé pour des réactions impliquant plusieurs substrats.

En présence de ce type d'inhibiteur :

  • Les deux paramètres (VM et KM) sont modifiés par le même facteur (voir le tableau résumé ci-dessous). En effet, ce type d'inhibiteur favorise la formation du complexe [enzyme-substrat] qui lui-même est consommé pour former le complexe ESI.
  • L'équilibre : E+S <==> ES est donc déplacé en faveur de ES. Celà signifie que, pour un même degré de saturation de l'enzyme il faut une concentration plus faible en substrat (KM diminue).
  • La concentration du complexe [ES] est moindre (une partie se trouve sous forme ESI), donc VM diminue.
  • Cette inhibition ne peut être "levée" par un excès de substrat puisque plus il y a de substrat, plus il y a formation de complexe ES et plus l'équilibre de fixation de l'inhibiteur est déplacé en faveur du complexe ternaire ESI.
Remarque : Dans certains ouvrages, on trouve la terminologie issue du terme anglo - saxon : "uncompetitive".

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5. Tableau résumé des modifications des paramètres cinétiques en présence de l'un des trois inhibiteurs précédents

VMapp et KMapp ("app" pour apparent) sont les valeurs de VM et KM, respectivement, mesurées en présence d'un inhibiteur à une concentration [I0].

Inhibition vi VM ou VMapp KM ou KMapp KI (constante
d'inhibition)
SANS Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej VM KM -------------
Compétitive Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej VM Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej KM . [I0]
-----------
KMapp - KM
Non
compétitive
Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej KM VMapp . [I0]
------------
VM - VMapp
Incompétitive Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej VMapp . [I0]
------------
VM - VMapp

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6. Inactivation : inhibition IRréversible

L'action d'un inhibiteur est IRréversible quand il se forme une liaison covalente entre l'enzyme et l'inhibiteur : on l'appelle un inactivateur.  

Le mécanisme réactionnel :

Remarque : la fixation de l'inactivateur n'est pas un équilibre.

Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

L'étude de l'effet des inhibiteurs IRréversibles est souvent utilisée pour déterminer les groupes actifs du site catalytique.

Un exemple classique d'inactivateur est le di-isopropyl fluorophosphate ou DFP*. L'étude de l'effet de ce composé sur l'activité des protéases à sérine a permis d'identifier la sérine 195 comme l'un des deux résidus impliqués dans la catalyse (le second étant l'histidine 57).

Le complexe est inactif, mais en fonction de la concentration relative de l'enzyme et de l'inhibiteur, toute molécule d'enzyme libre est évidemment totalement active.

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7. Inhibition par excès de substrat

Ce type d'inhibition par le substrat lui-même peut avoir lieu quand il est en très grande concentration.

En général, le site de fixation du substrat est dans ce cas de grande dimension et contient plusieurs sous - sites, chacun fixant une partie du substrat.  

Le mécanisme réactionnel :

Enzymologie enzymology active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation DFP PMSF biochimej

L'acétylcholinestérase est un exemple d'enzyme sujette à inhibition par excès de son substrat, l'acétylcholine.

Le site actif de cette enzyme a été caractérisé, en particulier en utilisant des analogues de substrat : une série d'inhibiteurs compétitifs portant des charges et un nombre d'atomes de carbone variables.

Il existe deux sous - sites de fixation de l'acétylcholine, distants de 7 Å :

  • le sous - site anionique qui porte une charge négative et qui interagit avec la charge positive portée par l'ammonium quaternaire du substrat
  • le sous - site estérasique (contenant les résidus catalytiques sérine et histidine) et qui interagit avec la liaison ester du substrat
  • Quand la concentration du substrat est faible, chaque partie du substrat interagit avec le sous-site qui lui est dédié.
  • Quand la concentration du substrat est forte, une molécule de substrat n'interagit plus que partiellement avec l'un ou l'autre des sous - sites, chaque sous - site étant cependant occupé par une molécule de substrat.

Un autre exemple est la régulation de la phosphofructokinase-1 (enzyme de la glycolyse) par la concentration de ces substrats (l'ATP et le fructose 6-phosphate) mais aussi par celles de de nombreux effecteurs liés à la production d'énergie (ATP) par la phosphorylation oxydative.

Ces effecteurs sont : l'ATP lui-même (voir ci-dessous), l'ADP, l'AMP, le phosphoénolpyruvate, le phosphate inorganique, le citrate, le NADH

L'ATP est un cas particulier : c'est l'un des deux substrats de la PFK mais c'est aussi un effecteur. En effet la PFK-1 possède :

  • un site de fixation de l'ATP en tant que substrat (effet homotrope)
  • un site de fixation en tant qu'effecteur (effet hétérotrope)

a. Partie gauche de la courbe de saturation ci-dessous

Elle reflète l'effet de l'ATP sur la vitesse de la réaction enzymatique en tant que substrat.

L'allure hyperbolique de cette première partie de la courbe indique que la fixation de l'ATP aux 4 sites catalytiques (la PFK est un homotétramère) s'effectue selon un mécanisme "Michaelien" (voir le cours).

Celà signifie qu'il n'y a pas d'effet coopératif dans la fixation des molécules d'ATP.

Courbe saturation phosphofructokinase PFK1 ATP active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

b. Partie droite de la courbe de saturation ci-dessus

A partir d'une certaine concentration, des molécules d'ATP se fixent sur un site qui n'est pas le site catalytique : ce site est lié à la régulation de l'activité catalytique.

C'est un site dit effecteur : certaines molécules d'ATP n'agissent plus comme substrat mais comme effecteur :

  • La fixation de molécules d'ATP sur ce site induit un changement de conformation de certaines molécules d'enzyme.
  • Les sites catalytiques dans cette conformation (dite "tendue" ou "tense", T) ne fixe pas ou trés mal l'ATP.
  • Dans cette conformation T, l'enzyme n'est pas ou trés peu active.

c. En conséquence :

Une partie des molécules d'enzyme étant inactive, la concentration réelle de complexe enzyme - substrat ([ES]) est moindre que la concentration d'enzyme. La vitesse de catalyse diminue puisque : vi = kcat x [ES].

d. Illustration

Inhibition de la CTP synthase par excès d'ammoniaque.

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

Source : Lunn et al. (2008)

Voir un exercice de travaux dirigé d'inhibition par excès de substrat.

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8. Exemples de mécanismes plus complexes

Dans certains cas, bien que complexée à l'inhibiteur, l'enzyme peut catalyser la réaction (forme ESI - mécanisme ci-dessous) et former le produit.

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

Source : Simm et al. (2005)

  • Le facteur α : le substrat se fixe sur E avec une plus forte affinité qu'il ne se fixe sur EI.
  • Le facteur β : le complexe ESI ne catalyse pas la réaction avec la même efficacité que le complexe ES.

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

Deux inhibiteurs non exclusifs

Les facteurs α et β (mécanisme ci-dessous) représentent la variation de l'affinité pour le substrat induite respectivement par I1 et I2 ou, à l'inverse, la modification de l'affinité pour les inhibiteurs due à la fixation du substrat.

Le facteur γ représente l'influence que chaque inhibiteur a sur la fixation de l'autre inhibiteur.

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

 active site inhibitor inhibiteur non competitif incompetitif uncompetitif inactivation exces substrat rate equation biochimej

Source : Gledhill & Walker (2005)

 

9. Liens Internet et références bibliographiques

"Enzyme Kinetics " I. Segel (1975), Ed. J. Wiley & Sons, Inc.

"Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn et Scrimgeour (1994) - Ed. DeBoeck Universités - ISBN : 2-8041-1578-X

Simm et al. (2005) "Bulgecin A: a novel inhibitor of binuclear metallo-β-lactamases" Biochem. J. 387, 585 - 590

Gledhill & Walker (2005) "Inhibition sites in F1-ATPase from bovine heart mitochondria" Biochem. J. 386, 591 - 598

Lunn et al. (2008) "Mutational analysis of conserved glycine residues 142, 143 and 146 reveals Gly142 is critical for tetramerization of CTP synthase from Escherichia coli" Biochem. J. 412, 113 - 121

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