Exercices d'enzymologie
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Exercice N°1 : inhibition compétitive

La cétostéroïde-isomérase catalyse l'isomérisation de différents Δ5-3-cétostéroïdes pour former des Δ4-3-cétostéroïdes conjugués tels que la Δ4-androstene-3,17-dione ou la testostérone.

Testosterone androstenedione nortestosterone Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

On étudie donc la réaction catalysée par cette enzyme (E) sur la Δ5-androstene-3,17-dione, en absence et en présence d'un inhibiteur (I), la 19-nortestostérone

On suit la réaction enzymatique en mesurant l'absorbance à λ = 248 nm et on obtient les résultats présentés dans le tableau ci-dessous.


[S]0 (mM) vi (U.A.min-1) / [I] = 0 vi (U.A.min-1) / [I] = 5.5 µM
0.083 0.08 0.051
0.122 0.11 0.072
0.195 0.15 0.106
0.238 0.17 0.122
0.340 0.20 0.150
0.580 0.26 0.200
0.870 0.29 0.240
1.170 0.30 0.270

1. Est-on en condition de substrat saturant ?
2. Déterminez Vmax, KM et kcat (en s-1) par la représentation des double inverses.
3. Déterminez les paramètres cinétiques Vmaxapp et KMapp en présence de l'inhibiteur. Calculez la constante KI. De quel type d'inhibition s'agit-il ?
4. Que suit-on à λ = 248 nm ?

Données : [E]0 = 7.3 pM ; εMproduit = 17000 M-1.cm-1; U.A. = unité d'absorbance 

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Réponse

[S]0 étudiée la plus faible = 8,3 10-5 M et [E]0 = 7,3 10-12 M, donc [S]0 >> [E]0 : on est en conditions de substrat saturant.

Expression de de VMax

On passe de ΔA.min-1 à µM.min-1 avec la relation de Beer-Lambert :

                                 Vmax (ΔA.min-1)
VMax (µM.min-1) = -------------------
                                           εM . l

VMax = 23,5 µM.min-1

Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

VMax = VMaxapp et KM KMapp , donc l'inhibiteur est compétitif.

kcat = VMax / [E]0 = 3,2 106 min-1 = 5,4 104 s-1

KI = (KM  x  [I]) / (KMapp - KM) = 6,7 µM

A λ = 248 nm : la fonction carbonyle conjuguée du produit4-androstene-3,17-dione) absorbe alors que le substrat (Δ5-androstene-3,17-dione) n'absorbe pas.

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Exercice N°2 : inhibition par excès de substrat

La lactate déshydrogénase catalyse la réduction réversible du pyruvate en lactate : pyruvate + NADH + H+ <===> lactate + NAD+

Les vitesses initiales de la réaction sont déterminées pour différentes concentrations [S]0 de pyruvate.
La concentration du NADH est constante et égale à 5,4 10-4 M et KMNADH  = 5,4 10-5 M.

On suit la disparition du NADH à λ = 340 nm en fonction du temps.


[S]0 (mM) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,8 1 2 3 4 5 9
vi (U.A.min-1) 0,075 0,125 0,157 0,180 0,200 0,212 0,232 0,250 0,270 0,270 0,250 0,240 0,190

1. Tracez la courbe de saturation et commentez l'allure.
2. Déterminez Vmax et KM par la représentation des double inverses.

Données : εMNADH = 6000 M-1.cm-1; U.A. = unité d'absorbance

Réponse

courbe saturation Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

La forme de la courbe de saturation est caractéristique d'une inhibition par excès de substrat : l'incurvation de la courbe de saturation a lieu pour [pyruvate]0 = 4 mM >> [NADH]0 = 0,54 mM.

Il y a compétition entre les 2 substrats et formation du complexe [pyruvate - E - pyruvate] au lieu de [pyruvate - E - NADH].

Enzymology kinetics parameter inhibition non competitive incompetitive kcat KM Vmax Vm catalytic center enzyme deux substrat exces enzymologie Michaelis Menten Henri Lineweaver Burk radioactivite radioactivity biochimej

courbe saturation exces substrat

VMax = 0,34 UA.min-1 ===> VMax = 55 µmoles NADH oxydées.min-1

KMpyruvate = 0,36 mM

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Exercice N°3

Le séquençage de l'ADN par la méthode de Frederic Sanger repose sur le marquage radioactif des brins synthétisés. Quatre réactions sont effectuées simultanément, chaque milieu réactionnel contenant un nucléotide triphosphate radioactif (en général, la cytosine marquée au 35S) en plus des quatre nucléotides triphosphate froids.

  • L'enzyme utilisée a longtemps été le fragment Klenow de la DNA polymérase I.
  • De manière schématique, la réaction d'incorporation de la 1ère cytosine peut s'écrire de la façon suivante: ADN(n) + dCTP35S ------> ADN(n+1)35S + PPi

Afin de déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme, on effectue 6 réactions de la manière suivante:

réaction 1 2 3 4 5 6
dCTP35S (µL) 12,5 25 50 75 100 200
  • le volume réactionnel pour chaque réaction est de 10 mL;
  • la réaction est déclenchée par addition de 100 µL d'enzyme;
  • la concentration d'enzyme dans le milieu réactionnel est 1 µM;
  • le temps de réaction est 10 minutes;
  • la solution mère de dCTP35S est à 108 dpm.ml-1 (dpm = désintégration par min) avec une activité spécifique de 500 µCi.mmole-1 (1 Ci = 2 1012 dpm).

Une fois la réaction arrétée, on prélève 1 mL de milieu réactionnel que l'on injecte sur une colonne HPLC. On sépare le substrat radioactif restant et l'ADN radioactif formé l'un de l'autre et on mesure la radioactivité correspondant au pic du produit.
Les résultats sont les suivants: 

réaction 1 2 3 4 5 6
dpm 1250 2500 4000 5000 5500 6500

1. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme.

2. Calculez la valeur de la constante catalytique.

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Exercice N°4

On étudie une réaction enzymatique (A ---> B) catalysée par une enzyme E, en suivant la cinétique d'apparition de B : 

[A]0 Temps (min)
1 2 3 4 5 6
Variation d'absorbance (unités arbitraires)
[A]0 = 1 mM 1 2 3 4 5 6
[A]0 = 2 mM 2 4 6 7,5 9 10
[A]0 = 5 mM 4 8 12 15 17,5 19,5
[A]0 = 10 mM 5 10 15 19 22 24
[A]0 = 20 mM 6 12 18 23 27 30

1. Tracez les cinétiques.

2. Déterminez les paramètres cinétiques de l'enzyme par la méthode graphique de votre choix.

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Exercice N°5

Partie A : On étudie la fixation d'un inhibiteur de protéase I sur l'élastase E. La masse molaire de l'enzyme est de 25 kDa. Celle du complexe enzyme - inhibiteur est de 75 kDa.

On fait agir différentes concentrations d'inhibiteur marqué au 32P pour une concentration fixe de l'enzyme : [E]0 = 100 µM.

L'inhibiteur non fixé et le complexe enzyme - inhibiteur sont séparés par chromatographie (gel de filtration).

Pour chaque concentration initiale d'inhibiteur, on obtient deux pics de radioactivité :

  • le pic 1 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en premier
  • le pic 2 correspond à la (ou aux) molécule(s) éluée(s) en second.
  • l'enzyme libre est exclue du gel.

Le tableau suivant donne les valeurs de concentration des molécules de chaque pic :

Concentration molécule(s) Pic 1 (µM) Concentration molécule(s) Pic 2 (µM)
10 5,60
20 12,3
40 34,0
55 60,0
70 117
90 437

1. A quelle(s) molécule(s) correspondent les pics 1 et 2 ?

2. Déterminez le nombre de site de fixation de l'inhibiteur et la constante de dissociation KD.

Partie B : On suit la réaction enzymatique, en absence et en présence de l'inhibiteur I, en mesurant l'absorbance du produit. Pour différentes concentrations initiales en substrat, on obtient les vitesses initiales suivantes (U.A. : Unité Arbsorbance):

[S]0 (mM) vi (U.A.min-1) - sans inhibiteur vi (U.A.min-1) - [I] = 9 mM
0,032 0,18 0,070
0,048 0,25 0.097
0,076 0,35 0,137
0,096 0,42 0,164
0,136 0,50 0,195
0,232 0,68 0,270
0,348 0,78 0,312

1. Déterminez les paramètres cinétiques (Vmax, KM et kcat) et les paramètres cinétiques en présence de l'inhibiteur. Pour Vmax la concentration doit être exprimée en molarité. Exprimez kcat en sec-1.

2. Précisez le type d'inhibition et calculez la constante d'inhibition KI.

Données : l = 1 cm ; εMproduit = 2600 M-1.cm-1 ; [E]0 = 27 nM

Voir un cours sur la radioactivité.

Voir un cours sur la chromatographie.

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