Spectrophotomètrie ultra-violet et visible
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1. Cuves

2. Loi de Beer - Lambert

3. Spectrophotomètres

4. Spectres d'absorbance

5. Expérience à analyser

6. Réponse de l'exercice

 

C'est une méthodologie extrèmement courante pour :

  • déterminer la concentration d'une molécule
  • suivre la cinétique de formation d'un produit au cours d'une réaction enzymatique
  • mesurer l'absorbance d'un éluat au cours d'une chromatographie pour tracer le profil d'élution
  • apprécier le degré de pureté d'une molécule purifiée

Elle présente les avantages suivants :

  • molécules biologiques en solution
  • méthode facile à mettre en oeuvre
  • simplicité des mesures
  • permet de déterminer la concentration de molécules
  • permet de tester l'effet de divers paramètres (pH, température, ...)
  • appareillage parmi les moins "onéreux" (?) pour ce genre de gros matériel de laboratoire

1. Cuves

Précautions d'usage :

  • choisir le type de cuve adapté à la longeur d'onde : cuve en quartz pour les ultra-violets (190 - 400 nm) / cuve en verre ou en polystyrène pour le visible (400 nm - 800 nm)
  • ne jamais mettre les doigts sur les faces dépolies des cuves
  • bien orienter la cuve par rapport à l'axe du faisceau lumineux
  • supprimer toutes les bulles d'air

spectrophotometre spectre absorbance ADN coefficient extinction loi beer lambert

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2. Loi de Beer - Lambert

L'absorbance est fonction de la concentration du soluté comme le montre la loi de Beer - Lambert :

A = log (Io/I) = ε . l . C

  • A = absorbance sans unité
  • Io = intensité lumineuse incidente (avant interaction avec le soluté)
  • I = intensité lumineuse transmise
  • ε = coefficient d'extinction (qui dépend de la longueur d'onde)
  • l = longueur du trajet otique (en cm)
  • C = concentration du soluté (l'unité dépend de celle du coefficient d'extinction)

spectrophotometre spectre absorbance ADN coefficient extinction tyrosine tryptophane phenylalanine proteine

 

  • si la concentration du soluté est en M (ou mol.L-1), ε est en M-1.cm-1 et on l'appelle coefficient d'extinction molaire : εM
  • si la concentration du soluté est en % (masse/volume), ε est en g-1.L.cm-1 et on l'appelle coefficient d'extinction pondéral : ε1%

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3. Spectrophotomètres

Un spectrophotomètre analyse l'énergie lumineuse réflechie ou transmise d'une molécule.

Un spectrophotomètre possède un système qui sépare les différentes longueurs d'onde d'un faisceau lumineux : le monochromateur. Il y a 2 types de monochromateur :

  • dispersion de la lumière par un prisme
  • diffraction de la lumière par un réseau ou par un cristal

Le spectre est reconstruit par un logiciel à partir des mesures effectuées à des intervalles de longueur d'onde fixés (exemple : mesures tous les 1, 3, 5 nm, ...).

Sources lumineuses :

  • lampe à décharge au deutérium : domaine 190 à 400 nm (maximum d'émission à 652 nm)
  • lampe à filament de tungstène : domaine 350 à 800 nm
  • lampe à décharge au xénon (très énergétique ) utilisée dans le domaine UV et visible. Elle fonctionne sous forme de flash, au moment de la mesure

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Spectrophotomètre double faisceau

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Figure ci-contre : spectrophotomètre Perkin-Elmer modèle "Lambda 950".

Ce type de spectrophotomètre "haut de gamme" délivre des longeurs d'onde allant de 190 nm à 1100 nm qui couvrent donc les régions de l'ultra-violet, du visible et du proche infra-rouge.

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a. Un densitomètre mesure l'opacité d'un film (densitomètre par transmission) ou l'absorption de la lumière par un objet réfléchissant (densitomètre par réflexion).

b. Un colorimètre contient système de détection constitué d'un capteur associé à au moins 3 filtres interférentiels. Ces filtres ont des propriétés proches de celles des pics de la courbe spectrale de l'oeil humain pour simuler la réponse trichromatique de l'oeil.

c. Un spectrocolorimètre a plus de détecteurs qu'un colorimètre standard. Il mesure la réflectance spectrale d'un objet pour chaque longeur d'onde.

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4. Spectres d'absorbance

Précautions :

  • vérifier qu'il n'y a pas de bulle d'air dans la cuve
  • enregistrer un spectre sur une large gamme de longueur d'onde avec comme point de départ une longueur d'onde où le soluté n'absorbe pas

Figure ci-contre : spectre d'absorbance d'une protéine.

Malgré son apparente simplicité, ce spectre est trés complexe puisqu' il est la résultante des spectre des acides aminés chromophores qui constituent la protéine.

spectre absorbance ADN coefficient extinction tyrosine tryptophane phenylalanine proteine

Or, les acides aminés chromophores :

  • sont en nombre variable d'une protéine à l'autre
  • d'accessibilité variable (en surface ou enfouis à l'intérieur de la protéine)
  • ont des spectres d'absorbance caractérisés par des longueurs d'onde d'absorbance maximales distinctes (voir ci-dessous)
  • ont des coefficient d'extinction de valeurs trés différentes (voir ci-dessous)
  • enfin, cette valeur dépend du pH puisque la tyrosine peut s'ioniser (voir ci-dessous)

  λmax absorbance εM (M-1.cm-1)
Tyr (Y) 273 - à 277 nm / épaulement à 283 nm 1280 à 1440
Trp (W) 282 nm 5050 à 5690
Phe (F) 3 pics majeurs : 254 nm - 262 nm - 267 nm 200 à 220
Cys (C) de 240 à 280 (bande large) 120
liaison peptidique 190 à 230 nm -----

Remarque : les échelles ne sont pas identiques dans la figure ci-contre. Le spectre d'absorbance du Trp est représenté à l'échelle 1, celui de la Tyr a été multiplié par 2, celui de la Cys par 4 et celui de la Phe par 20 !

En conséquence : à pH7, c'est essentiellement l'absorbance des Trp (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on enregistre le spectre d'absorbance d'une protéine ou que l'on mesure directement l'absorbance à 280 nm.

spectre absorbance ADN coefficient extinction tyrosine tryptophane phenylalanine

Le groupement phénol des Tyr s'ionise en ion phénolate avec un pKa = 10,5. Cette ionisation induit :

  • une augmentation du coefficient d'extinction molaire : εM ion phénolate = 2500 M-1.cm-1. C'est l'effet hyperchrome.
  • une augmentation de la longueur d'onde d'absorbance maximale : 273 - 277 nm ---> 293 - 297 nm. C'est l'effet bathochrome ("red shift").

spectre absorbance ADN coefficient extinction tyrosine phenol ion phenolate

En conséquence : à pH > 11, c'est essentiellement l'absorbance des Tyr (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on mesure l'absorbance à 295 nm.

Figure ci-contre : spectres d'absorbance d'ADN simple brin à différents temps (5 à 180 min) d'exposition à des radiations ultra-violettes.

  A260 / A280
ARN purifié 2
ADN purifié 1,8

spectre absorbance ADN coefficient extinction

Source : Veligura et al. (2005) "UV induced ds(ss)-DNA damage: optical and electrical recognition" BMC Plant Biology 5, S32


Nucléotide λmax (nm) à pH 7 εM (M-1.cm-1)
5' dAMP 259 15400
5' dCMP 271 9100
5' dGMP 252 13700
5' dTMP 267 9600
5' UMP 262 10000

5. Expérience à analyser

a. Une solution d'un composé X à 2 % transmet 75 % de la lumière incidente à une longueur d'onde donnée.

Calculez l'aborbance de cette solution et εM  du composé X.

b. Les protéases à sérine comme l'élastase contiennent 11 tyrosines dont 10 sont accessibles au solvant à pH 7. Une solution d'élastase 50 ÁM a une absorbance de 0,7 à pH 7.

A quelle longueur d'onde cette absorbance est-elle mesurée?

Calculez le coefficient d'extinction molaire du groupement phénol.

Calculez l'absorbance de cette solution à pH 13.

  • M. M. de X = 250
  • pKa phénol = 10,5
  • l = 1 cm
  • εM ion phénolate = 2500 M-1.cm-1

Voir la correction.

 

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