1ère partie : cystéine et pont disulfure

1. La cystéine

2. Formation d'un pont disulfure

• a. Introduction
• b. La réaction de formation d'un pont disulfure
• c. Le glutathion
• d. Les protéines disulfide isomerases (PDI) et Ero1p

3. Exemples

• a. Les toxines
• b. Les "knottins"
• c. Pont INTRA et INTER : l'insuline
• d. Pont INTRA et INTER : les cathepsines
• e. Le lysozyme

4. Fixation des métaux lourds par les métallothionines

2ème partie : prédiction des cystéines impliquées dans un pont disulfure

5. Description de la problématique

• a. Séquence en acides aminés et structure tridimensionnelle
• b. Un trés grand nombre de configurations des ponts disulfure
• c. Définition d'une fenêtre d'environnement autour des cystéines

6. Les différentes approches pour la prédiction de cystéines impliquées dans un pont disulfure

7. Liens Internet et références bibliographiques

8. Module Bioinformatique M1 (G. Hunault & E. Jaspard)

1. La cystéine

La cystéine est génétiquement codée par les 2 codons : UGU et UGC.

La cystéine est l'acide L-2-amino-3-mercaptopropionique.

La chaîne latérale de la cystéine porte un groupement sulfhydryle (-SH) extrêmement réactif. Son pKa est de 8.33.

L'autre acide aminé sulfuré, la méthionine, porte un groupe méthyle supplémentaire. La méthionine est plus hydrophobe, d'un encombrement stérique plus important et moins réactive.

• Voir le cours sur la synthèse de la cystéine.
• Voir la voie métabolique : KEGG

2. Formation d'un pont disulfure

a. Introduction

Un pont disulfure est une liaison covalente entre 2 atomes de soufre de la chaîne latérale de 2 résidus cystéines (Cys) réduits.

Les ponts disulfure sont formés dans un environnement cellulaire oxydant. Le cytoplasme n'étant pas un milieu oxydant, il y a trés peu de protéines intracellulaires qui possèdent des ponts disulfure.

Toutes les cystéines d'une protéine ne forment pas un pont disulfure :

• en fait, si l'on examine le fichier PDB-select 25, on s'aperçoit que seulement 27% des protéines contiennent des ponts disulfure.
• par ailleurs, on ne connait pas les règles qui régissent la sélection de telle ou telle cystéine d'une protéine pour établir un pont disulfure.

Un pont disulfure peut être établi entre 2 cystéines :

• d'une même chaîne polypeptidique : on parle de pont inTRA - chaîne
• appartenant à 2 chaînes polypeptidiques (identiques ou différentes) : on parle de pont inTER - chaînes

Le nombre de ponts disulfure (intra et/ou inter) au sein des protéines varie trés grandement : les toxines, bien qu'étant de petites protéines (20 à 30 acides aminés) peuvent en contenir jusqu'à 5, voire 6.

L'énergie libre de liaison qui résulte de la formation d'un pont disulfure est d'environ - 3,5 kcal/mol (voir Czaplewski et al., 2004). C'est une énergie importante qui contribue "sur le papier" de manière trés significative à la stabilisation de la structure tridimentionnelle native de la protéine.

Cependant, les ponts disulfure ne jouent pas un rôle déterminant dans le repliement des protéines, puisque les intermédiaires adoptent des conformations transitoires qui peuvent être éloignées de celles qui mettent en jeu ces ponts disulfure.

Nombre de ponts

Exemple : quel est le nombre de combinaisons permettant de former 3 ponts disulfures à partir de 6 cystéines ?

• la première cystéine peut être appariée avec n'importe laquelle des 5 autres cystéines pour former le premier pont
• il reste 4 cystéines qui peuvent s'apparier de 3 manières différentes
• il reste 2 cystéines qui s'apparient

  Soit : 5 x 3 x 1 = 15 combinaisons

De manière générale :

• pour n ponts disulfures
• 2n cystéines

il existe [(2n)! / 2ⁿn!] combinaisons.

La distance entre les 2 carbones a de 2 résidus cystéine impliqués dans un pont disulfure est de 4.2 Å (Czaplewski et al., 2004) à 7.5 Å.

L'entité structurale formé par 2 cystéines reliées par un pont disulfure s'appelle une cystine.

La formation d'un pont disulfure est une réaction d'oxydo-réduction réversible : cette réversibilité dépend du potentiel rédox du milieu et du pH.

b. La réaction de formation d'un pont disulfure

Au cours de la réaction d'échange [thiol - disulfure], un anion thiolate R₁S^- déplace un soufre du pont disulfure R₂-S-S-R₃.

Dans l'état de transition, la charge négative du thiolate est délocalisée sur les 3 atomes de soufre.

Les ponts disulfure sont formés et réduits au sein des protéines par 2 réactions d'échange [thiol - disulfure] avec un agent oxydo-réducteur tel que :

• le dithiothréitol (DTT oxydé / DTT réduit)
• le glutathion (GSSG / GSH)

c. Le glutathion

C'est un tripeptide formé de glycine, de cystéine et de glutamate.

Cependant, il a une particularité : c'est le groupement carboxylique en position γ de la chaîne latérale du glutamate qui établit la liaison peptidique avec la cystéine. C'est donc le γ-glutamyl-cystéinyl-glycine (structure ci-dessous).

Le glutathion existe sous forme réduite ou oxydée. La forme oxydée correspond à l'association de 2 molécules de glutathion reliées par un pont disulfure (G-S-S-G).

L'enzyme qui catalyse cette réaction est la glutathion réductase :

G-S-S-G + NADPH + H+ <===> 2 G-SH + NADP+

L'une de ses fonctions biologiques est l'élimination de produits dérivés de l'oxygène qui sont hautement réactionnels et donc toxiques pour la cellule :

• l'anion superoxyde O2°^- est transformé en oxygène et peroxyde d'hydrogène par la superoxyde dismutase
• puis le peroxyde d'hydrogène (H2O2) est éliminé par la catalase ou la glutathion peroxydase selon la réaction :

2 glutathion-SH + H-O-OH -----> glutathion-S-S-glutathion + 2 H₂O

d. Les protéines disulfide isomerases (PDI) et Ero1p

Les protéines disulfide isomerases (EC 5.3.4.1) catalysent le ré-arrangement correct dans le réticulum endoplasmique des ponts disulfure des protéines néo-synthétisées.

Ce sont des protéines à plusieurs domaines.

Pour oxyder les groupements thiols en disulfure des protéines cibles , les cystéines du site actif de la PDI doivent être maintenues dans l'état oxydé.

Ero1p est une flavoenzyme associée à la membrane qui forment des ponts disulfure et les transfère à la PDI. Cette dernière peut alors oxyder les cystéines des protéines substrats.

Le mécanisme de l'échange [thiol / disulfure] entre Ero1p et la PDI est le suivant :

Source : Frand et al. (2000)

• un pont disulfure de Ero1p subit une attaque nucléophile par un anion thiolate issu de la cystéine C₃₆ du site actif de la PDI.

• l'intermédiaire disulfure mixte résultant subit à son tour une attaque intramoléculaire par un anion thiolate issu de la cystéine C₃₉ du site actif de la PDI.

Ero1p contient :

• 9 sites potentiels de N-glycosylation (Asn-X-Ser/Thr)

• le motif du site actif : C₃₄₉XXC₃₅₂XXC₃₅₅

Source : Gross et al. (2004)

3. Exemples

a. Les toxines

On s'aperçoit que beaucoup de "petites" protéines (selon la classification SCOP - "Structural Classification of Proteins") possèdent des ponts disulfure.

La bungarotoxine de venin de serpent est un antagoniste compétitif hautement sélectif et lentement réversible du récepteur nicotinique neuronal α3β2.

La bungarotoxine est un homodimère (2 x 66 acides aminés). Chaque sous-unité contient 10 cystéines qui forment 5 ponts disulfure intra-chaîne !

R₁TC₃LISPSSTPQTC₁₄PNGQDIC₂₁FLKAQC₂₇DKFC₃₁SIRGPVIEQGC₄₂VATC₄₆PQFRSNYRSLLC₅₈C₅₉TTDNC₆₄NH₆₆

La mutagénèse dirigée a permis de montrer que :

• la suppression de l'un des 2 ponts disulfure prés de la boucle C-terminale (ponts : Cys 46 - Cys 58 ou Cys 59-Cys 64) modifie l'aptitude de la toxine à se replier.

• en revanche, la suppression de l'un des 3 autres ponts disulfure n'empeche pas la toxine de se replier dans sa conformation active, c'est-à-dire la conformation apte à se fixer aux récepteurs neuronaux cibles.

• la suppression du pont disulfure Cys₂₇ - Cys₃₁ entraîne une diminution drastique de l'affinité pour le récepteur d'un facteur 47. Ce pont disulfure joue probablement un rôle dans l'interaction spécifique de la toxine avec les récepteurs neuronaux.

Visualisation de la bungarotoxine de Bungarus multicinctus obtenue par RMN

Code PDB : 2NBT

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

• clic sur "Jmol" (Mac)
• clic droit sur "Jmol" (PC)

b. Les "knottins"

En 1982, Rees & Lipscomb (J. Mol. Biol. 160, 475 - 498) ont découvert un nouveau type de repliement en déterminant la structure tridimensionnelle de l'inhibiteur de la carboxypeptidase.

Ce type de repliement est le suivant : un pont disulfure pénètre dans un "macrocycle" formé par 2 autres ponts disulfure qui connectent des segments de la chaîne polypeptidique.

Une telle structure évoque un "noeud" ou "knot" en anglais. Les membres de cette famille structurales sont ainsi appelés "knottin" ou "inhibitor cystine knots".

A ce jour :

• 19 familles de protéines sont caractérisées par ce repliement. Exemples : inhibiteurs de la trypsine, certaines conotoxines, lectines de plantes et défensines d'insectes.
• 122 structures tridimensionnelles ont été déterminées
• ces protéines ont la particularité d'être trés petites et trés riches en ponts disulfure

Ci-contre, représentation schématique du repliement des "knottins" :

Les flèches indiquent le triple feuillet β antiparallèle trouvé dans la majorité des "knottins".

Les cystéines impliquées dans le "noeud" sont marquées par des chiffres romains. Ces 6 cystéines forment 3 ponts disulfure : le pont (III - VI) pénètre dans le "macrocycle" formé par les 2 ponts (I - IV) et (II - V).

Les lettres "a" à "f" indiquent la longueur de la boucle entre les cystéines.

Source : Gelly et al. (2004)

c. Pont INTRA et INTER : l'insuline

L'insuline est synthétisée sous la forme d'un précurseur, la pré-pro-insuline, dans les cellules β des îlots de Langerhans :

• Le peptide signal est clivé dans le réticulum endoplasmique.
• Deux ponts disulfure INTER-chaînes de l'insuline se forment dès la biosynthèse de la pro-insuline.
• La chaîne C de la pro-insuline a pour rôle de positionner correctement les chaînes A et B.
• Quand la pro-insuline est correctement repliée, le peptide C est éliminé et un pont disulfure INTRA-chaîne se forme.

L'insuline adopte alors sa forme fonctionnelle.

Cette maturation par l'élimination du peptide C retarde l'apparition de l'activité hormonale de l'insuline jusqu'à ce qu'elle soit empaquetée dans les granules de sécrétion.

Ponts INTRA chaîne : CYS 6 chaîne A - CYS 11chaîne A

Ponts INTER chaînes : CYS 7 chaîne A - CYS 7 chaîne B et CYS 20 chaîne A - CYS 19 chaîne B

d. Pont INTRA et INTER : les cathepsines

Les cathepsines sont des protéases et il en existe différents types (voir famille des peptidases EC 3.4):

• cathepsine X : cystéine-type carboxypeptidase (EC 3.4.18.1)
• cathepsine G : serine endopeptidase (EC 3.4.21.20)
• cathepsines B, F, H, K, L, O, S, T et V : cystéine endopeptidase (EC 3.4.22)
• cathepsines D et E : aspartic endopeptidase (EC 3.4.23)

La cathepsine B (EC 3.4.22.1) est une thiol protéase : l'acide aminé du site actif responsable de l'acitivité catalytique est la cystéine 29. L'histidine 199 et une asparagine constituent les 2 autres acides aminés de la triade catalytique.

Elle hydrolyse préférentiellement la liaison [Arg-Arg-X] et possède aussi une activité peptidyl-dipeptidase qui libère des dipeptides C-terminaux.

La cathepsine B est synthétisée sous la forme d'un précurseur de 339 acides aminés avec un peptide signal (acides aminés 1 à 17). Elles est activée sous la forme d'une chaîne légère (acides aminés 80 à 126 du précurseur) et d'une chaîne lourde (acides aminés 129 à 333).

La forme mature est un dimère (1 chaîne légère et 1 chaîne lourde) qui contient 6 ponts disulfure :

• 1 pont INTRA-chaîne légère : Cys 14 - Cys 43
• 5 ponts INTRA-chaîne lourde : Cys 62 - Cys 128 / Cys 63 - Cys 67 / Cys 100 - Cys 132 / Cys 108 - Cys 119
• 1 pont INTER-chaînes : Cys 26 - Cys 71

4. Fixation des métaux lourds par les métallothionines

Les métallothionines sont des protéines de 60 à 68 acides aminés dont 20 cystéines !

Elles constituent une super famille de protéines qui contient 15 sous-familles (animaux, plantes et procaryotes).

Elles fixent les métaux lourds tels que le cuivre, le zinc, le cadmium et le mercure. Quand le métal se fixe au groupe sulfhydryle, les ponts disulfure sont rompus et la protéine perd sa structure, la rendant ainsi non fonctionnelle.

Les métallothionines contiennent 2 domaines de fixation du métal. Cette fixation se fait via les cystéines de chaque domaine.

Ci-dessous, structure des domaines alpha (à gauche) et beta (à droite) de la métallothionine 2 complexée au cadmium de Homo sapiens - Braun et al. (1990).

Les métallothionines ne contiennent pas de pont disulfure.

Codes accès : MMDB 1673 (alpha) et 2810 (beta)

Codes accès : PDB 1MHU (alpha) et 2MHU (beta)

Les métallothionines jouent également un rôle protecteur vis-à-vis des espèces oxygénées réactives qui comportent des radicaux libres.

L'albumine, la transferrine, la ceruloplasmine, la myoglobine et la ferritine font partie de ce groupe d'antioxidants protéiques.

2ème partie : prédiction des cystéines impliquées dans un pont disulfure

5. Description de la problématique

a. Séquence en acides aminés et structure tridimensionnelle de la bungarotoxine

Oswald et al. (1997) - Code accès : PDB 2NBT

R₁TC₃LISPSSTPQTC₁₄PNGQDIC₂₁FLKAQC₂₇DKFC₃₁SIRGPVIEQGC₄₂VATC₄₆PQFRSNYRSLLC₅₈C₅₉TTDNC₆₄NH₆₆

Conclusion : la répartition des cystéines dans la séquence en acides aminés et la répartition spatiale des ponts disulfure ne sont pas corrélés de manière évidente !

On remarque 2 cystéines contigües (C₅₈ et C₅₉) impliquées dans 2 ponts distincts.

b. Un trés grand nombre de configurations des ponts disulfure

Il existe un trés grand nombre nombre d'agencement des ponts disulfure les uns par rapport aux autres au sein des protéines.

Lenffer et al. (2004) qui ont développé le programme (et le recueil de données) "CysView" ont recensé 224 configurations, allant de 1 pont (882 séquences) à 36 ponts disulfure (1 séquence).

En voici quelques exemples.

Source : "CysView"

Le précurseur de la pappalysine 1 du plasma humain (EC 3.4.24.79) contient 36 ponts disulfure (traits gris sur la figure ci-dessous).

Source : PFAM ("Protein families database of alignments and HMMs")

c. Définition d'une fenêtre d'environnement autour des cystéines

L'étude de Fariselli et al. (1999) a porté sur une fenêtre de 11 acides aminés autour d'une cystéine (AA_-5 ... - C - ... AA_-5).

Les résultats montrent que la formation d'un pont disulfure par la cystéine centrale C est grandement favorisée si l'on trouve dans cet environnement :

• une cystéine, sauf si celle-ci occupe la position +3 qui correspond généralement à des cystéines dont le rôle est de chélater des métaux
• des acides aminés hydrophiles et/ou chargés. A l'inverse la présence d'acides aminés hydrophobes est défavorable à la formation d'un pont disulfure

Exemple d'un environnement en acides aminés autour de cystéines impliquées dans des ponts disulfure : signature "Prosite" de la famille des α conotoxines (séquence consensus).

C - C - [SHYN] - X(0,1) - [PRG] - [RPATV] - C - [ARMFNHG] - X(0,4) - [QWHDGENFYVP] - [RIVYLGSDW] - C

Selon cette notation, on remarque que cet environnement n'est pas défini de manière univoque.

En d'autres termes, la même cystéine est impliquée dans un pont disulfure que l'on trouve les acides aminés [R ou P ou A ou T ou V] dans le "voisinage gauche" et que l'on trouve les acides aminés [A ou R ou M ou F ou N ou H ou G] dans le "voisinage droite" .

Celà signifie un nombre impressionant de séquences distinctes compatibles avec la formation d'un pont disulfure.

Figure ci-contre, exemple d'un environnement.

J.-M. Richer, G. Hunault & E. Jaspard

6. Les différentes approches pour la prédiction de cystéines impliquées dans un pont disulfure

Ces méthodes sont les suivantes :

• optimisation stochastique globale
• optimisation combinatoire
• techniques d'apprentissage :
  1. réseau de neurones ("neural network")
  2. modèles de Markov cachés ("hidden Markov models" - HMMs)
  3. méthode hybride : réseau de neurones et modèles de Markov cachés ("hidden neural network")
  4. machine support de vecteur ("support vector machines" - SVMs)

Exemple de l'approche pour la prédiction de cystéines impliquées dans un pont disulfure : 2D DAG - RNN ("Two Dimensional Directed Acyclic Graph - Recursive Neural Network")

Figure ci-dessous : diagramme d'un réseau de neurone (a) et du graphe orienté acyclique ("DAG", b) pour l'analyse d'objets bi-dimensionnels tels que les contacts entre cystéines impliquées dans un pont disulfure.

Des noeuds sont disposés de manière régulière dans un plan d'entrée, un plan de sortie et 4 plans cachés . Dans chaque plan, les noeuds sont disposés selon un maillage carré.

Les plans cachés contiennent des bordures associées au maillage. Ces bordures sont orientées vers l'un des 4 points cardinaux (NE, NW, SW et SE).

Des bordures additionnelles sont orientées verticalement (colonne) du plan d'entrée à chaque plan caché et de chaque plan caché au plan de sortie.

Dans la figure (b), sont indiquées les connections au sein d'une colonne (i, j) du DAG.

• I_(i,j) est la variable d'entrée
• O_(i,j) est la variable en sortie
• NE_(i,j) sont les variables cachées dans le plan caché Nord - Est (NE)
• Idem pour les autres variables

Dans une carte de prédiction de contacts entre cystéines (impliquées dans un pont disulfure), l'entrée (i, j) représente la probabilité que la i^ème et la j^ème cystéine soit ou non liées par un pont disulfure.

Cette prédiction dépend directement de l'entrée (i, j) et des 4 unités cachées de la même colonne, associée à la propagation dans les plans cachés.

"Why cysteine is special ?" - Jacek Leluk

Frand et al. (2000) "Pathways for protein disulphide bond formation" Trends in Cell Biology 10, 203 - 210

Gross et al. (2004) "Structure of Ero1p, Source of Disulfide Bonds for Oxidative Protein Folding in the Cell" Cell 117, 601 - 610

"Metallothionein" : Site du département de Biochimie (Université de Zurich) et "Swiss Institute of Bioinformatics" (SIB)

"The KNOTTIN website and database" : A new information system dedicated to the knottin scaffold (Université de Montpellier - CNRS - INSERM)

Gelly et al. (2004) "The KNOTTIN website and database : a new information system dedicated to the knottin scaffold" Nucleic Acids Res. 32, D 156 - 159

Article

PDB-select 25 : Selection of a representative set of PDB chains - Most recent 25% list homologs.

Fariselli et al. (1999) "The role of evolutionary information in predicting the disulfide bonding state of cysteines in proteins" Proteins 36, 340 - 346

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• CysView : Tool facilitating the grouping of entries in a database by similar disulfide bridge patterns ("disulfide connectivity patterns").
• Lenffer et al. (2004) "CysView: protein classification based on cysteine pairing patterns" Nucleic Acids Res. 32 , W 350 - 355

• DIANNA : Unified software for cysteine state and disulfide bond partner prediction.
• Ferre & Clote (2005) "DiANNA: a web server for disulfide connectivity prediction" Nucleic Acids Res. 33, W 230 - 232

• Sacan, A. (2004) "Prediction of cysteine bridges using sequence alignments"

DISpro (SCRATCH protein predictor) : DIpro is a cysteine disulfide bond predictor based on 2D recurrent neural network, support vector machine, graph matching and regression algorithms.

GDAP: Genomic disulfide analysis program.

DISULFIND : Cysteines Bonding State and Connectivity Predictor. Web interface to a set of Machine Learning programs trained to predict the disulfide bonding state and connectivity pattern of the cysteines in a given amino acid sequence.

DSDBASE : Database on disulphide bonds in proteins that provides information on native disulphides and those which are stereochemically possible between pairs of residues in a protein.

Triads : A program for identifying Cys-Cys-Trp triad motifs in protein structures.