Détermination de la concentration de protéines par dosages colorimètriques
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1. Principe d'une gamme étalon et d'une droite étalon

2. Méthodes colorimétriques les plus courantes pour la détermination de la concentration en protéines

3. Complément sur la méthode de Marion Bradford

 

4. Expérience à analyser

Exercice d'application : énoncé

Exercice d'application : corrigé

 

1. Principe d'une gamme étalon et d'une droite étalon

On utilise trois types de solution :

1. une solution de la protéine dont on veut déterminer la concentration.

2. une solution de concentration connue d'une protéine considérée comme une référence ou un standard par rapport à la protéine dont on veut déterminer la concentration. Cette protéine de référence peut être la même protéine que celle que l'on veut doser.

3. une solution de réactif qui développe une coloration en réagissant avec des acides aminés spécifiques de ces protéines.

La solution de concentration connue permet de constituer une gamme étalon : série de tubes qui contiennent un volume identique mais des quantités croissantes et connues de la protéine de référence.

En parallèle, une série de tubes, contenant différents volumes de prise d'essai de la protéine dont on veut déterminer la concentration (l'échantillon à doser), est préparée.

La solution de réactif est ajoutée au même moment dans tous les tubes afin que la la coloration se développe dans les mêmes conditions pour la gamme étalon et l'échantillon à doser.

gamme etalon Dosage colorimetrique proteine Bradford protein assay spectrophotometry coomassie biuret lowry biochimej

L'absorbance de tous les tubes est ensuite mesurée.

Les valeurs obtenues à partir des tubes de la gamme étalon permettent de tracer une droite étalon : absorbance = f (quantité).

Droite etalon Dosage colorimetrique proteine Bradford gamme protein assay spectrophotometry coomassie biuret lowry biochimej

Cette proportionnalité permet de déterminer la quantité de protéine contenue dans un volume de prise d'essai de l'échantillon à doser.

On en déduit alors la concentration de la protéine à doser.

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2. Méthodes colorimétriques les plus courantes pour la détermination de la concentration en protéines

Méthode Bradford Biuret Lowry
Référence Bradford, M. (1976) Anal. Biochem. 72, 248 - 256 Gornall et al. (1949) J. Biol. Chem. 177, 751 Lowry et al. (1951) J. Biol. Chem. 193, 251
Réactif

Le bleu de Coomassie (s'adsorbe sur le verre des cuves qu'il faut nettoyer fréquemment)

Le biuret (NH2-CO-NH-CO-NH2) Le biuret et le réactif de Folin-Ciocalteu (phosphomolybdate et phosphotungstate - 1927)
Groupements réactifs

Réaction avec l'Arg et, dans une moinde mesure, avec l'His, la Lys et les acides aminés aromatiques

Formation d'un complexe pourpre avec la liaison peptidique en présence de cuivre à pH basique Le réactif de Folin-Ciocalteu réagit avec la Tyr et le Trp et, dans une moinde mesure, avec la Cys, l'His et la liaison peptidique
λ mesure 595 nm (bleu de Coomassie seul : 465 nm) 545 nm (ou 300 nm) 745 nm
Sensibilité Elevée (seuil = 1 g) Faible (seuil = 100 g) Elevée (seuil = 1 g)
Rapidité et complexité Méthode simple et très rapide Méthode simple et moyennement rapide Méthode moyennement simple et moyennement rapide
Interférence

Dosage peu influencé par la présence d'autres molécules sauf les détergents et les bases fortes

Dosage influencé par les autres solutés

Dosage fortement influencé par les autres solutés.
Variation d'une protéine à une autre

Forte : la protéine de référence (l'albumine de sérum bovin ou BSA, "Bovine Serum Albumin") est une protéine globulaire peu représentative de l'ensemble des protéines.
La γ-globuline, parfois employée, est une protéine qui est une meilleure protéine de référence.

Faible : la formation du complexe est à peu prés équivalente pour toutes les protéines puisque le biuret réagit avec la liaison peptidique

Forte

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3. Complément sur la méthode de Marion Bradford

Le nom anglais du réactif de Bradford est : "Bradford Coomassie brilliant blue G-250 protein-binding dye".

Le pigment ("dye") existe sous forme cationique, neutre et anionique.

Structure Coomassie reactif Bradford Dosage colorimetrique proteine gamme etalon protein assay spectrophotometry biuret lowry biochimej

Sa longueur d'onde d'absorbance maximale est 465 nm.

Le pigment forme un complexe avec les protéines : sa structure est modifiée par cette interaction et sa longueur d'onde d'absorbance maximale est déplacée de 465 à 595 nm.

Spectre absorbance Coomassie reactif Bradford Dosage colorimetrique proteine gamme etalon protein assay spectrophotometry biuret lowry biochimej

Source : "Pharmaceutical-int"

L'interaction pigment - protéine s'effectue essentiellement avec :

  • les résidus d'acides aminés hydrophobes
  • des résidus d'acides aminés basiques (arginine - lysine et histidine)
  • les forces de Van der Waals contribuent aussi à la formation du complexe

Le nombre de molécules de pigment fixé par molécule de protéine est approximativement proportionnel au nombre de charges positives portées par la protéine.

Le pigment ne réagit pas avec les acides aminés libres. La masse du peptide ou de la protéine doit être au moins de 3 kDa.

En absence de protéine, la couleur du réactif seul est marron (à gauche - figure ci-contre).

Plus la concentration en protéine est élevée, plus celle du complexe formé l'est aussi : la couleur est de plus en plus bleue (à droite - figure ci-contre).

Gamme etalon absorbance Coomassie reactif Bradford Dosage colorimetrique proteine gamme etalon protein assay spectrophotometry biuret lowry biochimej

Source : "EIROforum"

Le développement de cette couleur bleue n'est proportionnelle à la concentration en protéine que dans une gamme de quantité limitée (précisée par le fabriquant). Au-delà, il n'y a plus proportionnalité : d'où l'importance d'établir une gamme étalon précise.

Le complexe n'est stable que pendant un temps limité :

  • il faut donc préparer en même temps les mélanges pour la gamme étalon et pour les échantillons, à température ambiante.
  • il faut effectuer les lectures de la gamme étalon et des échantillons au même moment.

L'article de Marion Bradford est probablement l'un des plus cités (avec celui de U.K. Laemmli - électrophorèse en conditions dénaturantes) dans les publications scientifiques biologiques.

Il est à noter que le bleu de Coomassie est un moyen de réveler les protéines dans les gels d'électrophorèse même si ça n'est plus la méthode de choix du fait du développement de réactifs beaucoup plus sensibles qui permettent de détecter des quantités bien inférieures (par exemple les fluorophores).

Laemmli UK (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227 : 680 - 685

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4. Expérience à analyser

a. Gamme étalon

  • On dispose d'une solution mère de BSA à 1 mg.mL-1.
  • Le volume total [BSA + tampon] doit être de 100 µL dans tous les tubes.

Calculez les volumes à prélever de la solution mère de BSA et du tampon pour faire une gamme étalon : 0, 2, 4, 6, 8 et 10 g de BSA.

Remarque : il est peut-être nécessaire d'effectuer une dilution de la solution mère de BSA pour prélever des volumes suffisament importants pour minimiser les erreurs de pipetage.

b. Echantillon à doser

Dans une autre série de tubes, on prélève des volumes différents de la solution de protéines à doser (éventuellement diluée) complétés par une solution tampon.

De la même manière : le volume total [BSA + tampon] doit être de 100 µL dans tous les tubes.

On ajoute 1 mL de colorant dans les 2 séries de tube.

On mélange et on laisse 5 à 15 min à l'obscurité.

Les résultats des mesures d'absorbance à 595 nm sont dans les tableaux ci-contre.

Quantité de BSA (g) 0 2 4 6 8 10
A595 0,13 0,40 0,48 0,85 0,95 1,21
Volume prélevé de solution à doser (L) 10 60
Dilution préalable de la solution à doser Non diluée 3
A595 0,51 0,84

1. De quels matériel et consommable a-t-on besoin pour réaliser cette expérience ?

2. De quelle méthode s'agit-il ?

3. Pourquoi faut-il attendre avant de mesurer l'absorbance ?

4. Tracer la droite : A595 = f (quantité de BSA). Pourquoi l'absorbance du tube "0" de la gamme étalon n'est-elle pas nulle ?

5. Calculer la concentration en protéines de la solution à doser.

Exercice d'application : énoncé Exercice d'application : corrigé

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