La biophysique - analyse des macromolécules biologiques

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1. Définition de la biophysique et rappel sur la structure des protéines

2. Quelques brefs rappels de physique

3. Les techniques spectroscopiques

3a. La spectroscopie ultraviolet / visible et la spectroscopie infrarouge

3b. La fluorescence

3c. Le dichroïsme circulaire

4. La résonance magnétique nucléaire (RMN)

5. La cristallographie ou diffraction des rayons X

6. La spectrométrie de masse

7. Application de la spectrométrie de masse à la protéomique

8. La résonance paramagnétique électronique (RPE)

9. La chromatographie liquide à haute performance

10. La mécanique et la modélisation moléculaires

11. Liens Internet

 

1. Définition de la biophysique et rappel sur la structure des protéines

Discipline qui analyse les phénomènes biologiques (biomécanique, imagerie médicale, fonction des organes, ...) et la structure des macromolécules biologiques à l'aide de théories et de techniques de la physique (voire de la chimie).

Ce cours focalise sur certaines méthodes biophysiques employées pour l'analyse de la structure des protéines.

Il existe quatre niveaux de structure des protéines (voir les structures) :

  • la structure primaire : c'est la séquence en acides aminés ou enchaînement polypeptidique (voir les cours "La bioinformatique")
  • les structures secondaires : c'est l'ensemble des structures locales spécifiques qu'adoptent certaines parties d'une protéine. C'est une étape du repliement des protéines
  • la structure tertiaire ou structure tridimensionnelle : parmi les innombrables structures que peut adopter une protéine, c'est la seule structure qui lui confère sa fonction biologique
  • la structure quaternaire : certaines protéines sont constituées de plusieurs chaînes polypeptidiques (appelées sous-unités) identiques ou non. La structure quaternaire est l'arrangement spatial de ces différentes sous-unités
2. Quelques brefs rappels de physique

a. Structure de l'atome

Un atome est constitué :

  • d'un noyau qui est lui-même formé de neutrons et de protons (de charge positive), aussi appelés nucléons. La masse globale des nucléons est quasiment celle de l'atome
  • d'un cortège d'électrons (de charge négative) autour du noyau et dont la charge équilibre celle du noyau
  • le noyau est de 10 00 à 100 000 fois plus petit que l'ensemble de l'atome avec son nuage d'électrons. Entre le noyau et les électrons : le vide.

Structure de l'atome

Source : SFEN

  • la masse de l'électron est environ 1800 fois plus faible que celle d'un nucléon
  • la charge de l'électron est 1,6 10-19 C (Coulombs)
  • les énergies de liaison ou de dissociation sont donc exprimées en puissance de l'unité de base d'énergie qui est l'électron - volt (eV) avec 1 eV = 1,6 10-19 J

Au sein de l'atome résident différents types de forces ou interactions qui assurent la cohésion et l'interaction entre les différents constituants de l'atome.

La cohésion du noyau atomique est assurée par l'interaction forte, qui attire les nucléons entre eux et empêche les protons de se repousser.

                                                                       A
La nomenclature d'un atome s'écrit :           X
                                                                        Z
  • X représente le symbole chimique de l'élément auquel l'atome appartient
  • A est le nombre de de masse = nombre de protons + nombre de neutrons
  • Z est le numéro atomique = nombre de protons donc d'électrons

Les isotopes sont les différents atomes qui appartiennent à un même élément chimique. Ils ont :

  • des propriétés chimiques identiques
  • le même numéro atomique Z donc le même nombre de protons
  • un nombre de masse A différent, donc un nombre de neutrons différent
exemple : 12353I  - 12453I  - 12553I  - 12953I  - 13153I - 13253I - 13553I
 

Les isobares sont des atomes qui ont :

  • le même nombre de masse
  • un numéro atomique différent, donc un nombre de protons différent
exemple : 12250Sn (étain) - 12251Sb (antimoine) - 12252Te (tellure)

b. La lumière

La lumière est la partie visible du rayonnement électromagnétique.

Un rayonnement électromagnétique est une oscillation couplée du champ électrique et du champ magnétique (l'un étant perpendiculaire à l'autre) qui se propage en ligne droite à partir d'une source constituée par un mouvement alternatif de charges électriques.

Source : Wikipédia

Auteur : C. Dang Ngoc Chan

rayonnement électromagnétique

  • un rayonnement électromagnétique se caractérise par sa longueur d'onde λ ou sa fréquence ν, qui sont inversement proportionnelles : ν = c / λ
  • dans le vide, le rayonnement électromagnétique, et en particulier la lumière, se déplace à la vitesse : c = 299.792.458 m.s-1. C'est une constante physique fondamentale

c. Le photon

Le photon est un concept utilisé pour représenter les interactions entre les rayonnements électromagnétiques et la matière.

Les travaux de Heinrich Hertz sur l'effet photoélectrique et de Max Planck sur le corps noir ont montré que la matière recevait ou émettait de l'énergie électromagnétique par paquets et de valeur bien déterminée, ou quanta.

Tout rayonnement électromagnétique est constitué de photons.

Le photon est un grain d'énergie qui se déplace à la vitesse de la lumière (v = c) avec une fréquence d'oscillation ν :

  • son énergie est : E = hν = hc / λ où h est la constante de Planck
  • sa quantité de mouvement est : p = hν / c

Lors d'une interaction entre un photon et un atome, l'énergie totale du système (photon + atome) et la quantité de mouvement totale (photon + atome) sont conservées.

  • E01 = énergie de l'atome au repos dans l'état fondamental (avant interaction avec le photon)
  • E02 = énergie de l'atome au repos dans l'état excité (après interaction avec le photon)
  • ΔE12 = hν12 = E02 - E01 est l'énergie de la transition entre l'état excité et l'état fondamental.

L'énergie d'un photon est exprimée en électron-volt (eV), soit l'énergie d'1 électron accéléré par un potentiel de 1 volt.

  • les photons de lumière visible les plus énergétiques (violet) sont de 3 eV
  • les rayons X couvrent la gamme 100 eV à 100 keV
  • les rayons γ sont au-delà de 100 keV
  • des photons γ de plus de 100 MeV ont été détectés après émission par un quasar

Illustration : l'effet Compton

d. Spectre électromagnétique

Le spectre électromagnétique est la décomposition du rayonnement électromagnétique en fonction :

  • de sa longueur d'onde
  • de sa fréquence (via l'équation de propagation)
  • de l'énergie de ses photons (via la loi de Planck)

Ci-dessous, les catégories du spectre par longueur d'onde décroissante :

ondes radio (λ > 10 m)

ondes radar (1 m ≤ λ ≤ 10 m)

micro-ondes (10-3 m ≤ λ ≤ 1 m)

infrarouge (10-6 m ≤ λ ≤ 10-3 m)

visible (400 10-9 m ≤ λ ≤ 700 10-9 m)

ultraviolet (180 10-9 m ≤ λ ≤ 400 10-9 m)

rayons X (λ ≤ 1 10-8 m)

rayons γ (λ ≤ 1 10-11 m)

spectre electromagnetique

Source : Wikipédia - Auteur : C. Dang Ngoc Chan

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3a. La spectroscopie ultraviolet / visible - la spectroscopie infrarouge

Les méthodes spectroscopiques sont utilisées pour analyser les macromolécules parce que ce sont des techniques d'analyse non destructrices.

La spectroscopie ultraviolet / visible - la spectroscopie infrarouge

3b. La fluorescence

Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (ou lumière d'excitation) et de la restituer rapidement (< 1 nsec) sous forme de lumière fluorescente (ou lumière d'émission).

Cependant :

  • une partie de l'énergie de la lumière d'excitation est absorbée par d'autres molécules du milieu
  • une autre partie de l'énergie est dissipée sous forme de chaleur

En conséquences, l'énergie de la lumière d'émission est plus faible que celle de la lumière d'excitation : la lumière d'émission (la fluorescence) a donc une longueur d'onde plus élevée.

Remarque : si l'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation c'est la fluorescence. Si la matière continue d'émettre de la lumière après avoir été éclairée, c'est la phosphorescence.

Application : la microscopie de fluorescence

Le principe général est d'associer des cellules ou des molécules non fluorescentes avec des fluorochromes pour les visualiser.

Par exemple, le 4',6-Diamidino-2-phenylindole ou DAPI marque l'ADN qui fluoresce en bleu.

De nombreuses autres techniques se sont développées :

  • le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer
  • l'immunomarquage direct ou indirect qui utilise un anticorps marqué par un élément radioactif
  • la technique du FISH ("Fluorescence In Situ Hybridization") sert à marquer des séquences nucléotidiques
  • la technique du FRET ("Fluorescence Resonance Energy Transfer") utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules
  • la GFP ("Green Fluorescent Protein") consiste à intégrer dans le génome de la cellule à observer un géne de protéine fluorescente, la protéine synthétisée est alors fluorescente

3c. Le dichroïsme circulaire

Le dichroïsme circulaire s'appuie sur la capacité des molécules qui ont une activité optique d'absorber différemment à droite et à gauche la lumière polarisée circulairement.

L'activité optique est la propriété que possède une structure chirale d'interagir avec un rayonnement électromagnétique.

L'activité optique est à l'origine :

  • du dichroïsme circulaire
  • du pouvoir rotatoire
  • de la dispersion optique
  • de la polarisation circulaire d'émission

Application : Le dichroïsme circulaire est une technique qui permet d'analyser le contenu en structures secondaires des protéines ou des acides nucléiques.

Pour déterminer la proportion de chaque type de structure secondaire, il faut effectuer une déconvolution en composantes élémentaires du spectre de dichroïsme avec des logiciels appropriés.

Cette une technique non destructive qui permet d'étudier les changements de conformation des protéines dans différents environnements (pH, agents dénaturants, température).

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4. La résonance magnétique nucléaire (RMN)

Application : Son caractère non destructif a conduit à divers développements de cette méthode qui est employée :

  • en biologie : cette technique permet de déterminer la structure de certaines protéines ou de fragments d'ADN
  • en chimie organique pour des analyses structurales
  • en génomique structurale pour obtenir une image tridimentionnelle des molécules du vivant
  • en médecine pour étudier le corps humain (image à résonance magnétique nucléaire - IRM)

5a. La cristallographie ou diffraction des rayons X

La cristallographie est la science qui se consacre à l'étude des substances cristallines à l'échelle atomique. L'état cristallin est défini par un caractère périodique et ordonné à l'échelle atomique ou moléculaire. Ce caractère périodique est appelé la maille élémentaire.

La cristallogénèse est la formation d'un cristal, soit en milieu naturel, soit de façon expérimentale. C'est le passage d'un état désordonné liquide à un état ordonné solide, contrôlé par la température, la pression, le temps d'évaporation et des lois cinétiques complexes :

  • 1ère phase : la germination correspond à l'apparition d'une phase cristalline stable à partir d'un liquide surfondu ou d'une solution sursaturée
  • 2ème phase : la croissance est le processus qui va suivre la germination et permettre l'augmentation de taille des germes pour conduire aux cristaux

La plupart des subtances minérales et des petites molécules organiques cristallisent facilement et les cristaux obtenus sont en général sans défaut.

En revanche les macromolécules biologiques, comme les protéines, sont souvent très difficiles à cristalliser.

C'est par cristallographie que J. Watson, F. Crick, M. Wilkins et R. Franklin ont pu déterminer la structure hélicoïdale de l'ADN en 1953 (Prix Nobel en 1962).

5b. La banque de données "Protein data Bank" (PDB)

Elle contient l'ensemble des données structurales des protéines (plus de 85.500 structures en 2012) obtenues par cristallographie ou par RMN.

  • Le nombre de repliements connues de protéines significativement différentes (c'est-à-dire qui ont moins de 25% d'acides aminés identiques) est de 1500.

  • La distribution observée des repliements est très hétérogène (certains sont très peuplés, d'autres beaucoup moins).

  • On évalue à environ 10.000 le nombre total de structures protéiques originales qui suffirait à modéliser la quasi-totalité des protéines connues.

  • les fichiers PDB sont de divers formats

6. la spectrométrie de masse

Les protéines sont de grosses molécules biologiques. La spectrométrie de masse permet de les fractionner (actuellement jusqu'à 2 105 Daltons) en les ionisant, puis de déduire la masse de ces molécules (ou la masse de leurs fragments) selon leurs trajectoires.

Les fragments sont accélérés par un champ magnétique et/ou électrique et ils sont triés en fonction de leur rapport : masse/charge (M/z).

L'une des principales applications de la spectrométrie de masse en biologie est la protéomique qui a pour but d'identifier (et de quantifier) l'ensemble des protéines synthétisées ou protéome, à un moment donné et dans des conditions données au sein d'un tissu, d'une cellule ou d'un compartiment cellulaire.

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8. La résonance paramagnétique électronique (RPE)

Un radical libre est un atome ou une molécule qui possède un ou plusieurs électron célibataire (non-appariés). Un électron célibataire engendre une grande instabilité de la molécule.

Les espèces radicalaires sont produites naturellement par phénomène d'oxydation et peuvent s'attaquer aux composés vitaux des cellules.

La résonance paramagnétique électronique est une méthode directe d'étude des phénomènes radicalaires.

Elle permet donc de mettre en évidence des composés possédant au moins un électron célibataire.

9. La chromatographie liquide à haute performance

10. La mécanique et la modélisation moléculaires

Ce type d'approche est complémentaire des techniques physiques qui précèdent. Ces objectifs sont entre autres :

  • la "visualisation" informatique des molécules à partir de données structurales (cristallographiques, RMN, spectroscopiques , ...)
  • l'obtention d'informations sur la dynamique et l'énergie des molécules
  • calculer le champ de force pour déterminer les propriétés des molécules
  • corréler ces propriétés à une structure moléculaire
  • valider la structure moléculaire

Différents outils informatiques sont utilisés pour :

  • visualiser la structure des molécules en 3 dimensions
  • les "manipuler" (rotation, translation, changement de conformation)
  • calculer les paramètres géométriques (distance inter atomique, angle, ...)

 

11. Liens Internet
"Mathématiques MPSI-PCSI + eText" (2011)  Debeaumarché, Dorra & Hochart - Ed. Pearson - ISBN 13: 978-2-7440-7554-4

Sylvain Robert (Université du Québec)

Notes de cours Chimie Organique

La biophysique (Wikipédia)

Wikipédia

Cours de Loic Portelette

La diffraction des rayons X

"La structure cristalline des solides inorganiques" (Université du Mans)

cours d'enseignement à distance

Protein data bank

PDB

Introduction à la modélisation moléculaire

GMM

Folding@home

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