L'électrophorèse des protéines et des acides nucléiques
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1. Principe

2. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes

3. Détermination de la masse molaire d'une protéine

4. Gel d'électrophorèse d'ADN

5. Révélation des bandes d'ADN (coloration) par le bromure d'éthidium

6. Détermination de la taille d'un fragment d'ADN

7. Expérience à analyser

8. Gels bidimensionnel en protéomique

 

1. Principe

L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.

Les molécules se déplacent vers le pôle de charge opposée à leur charge nette z, à une vitesse v proportionnelle à cette charge : v = E. z / f où E est la force du champ éléctrique et f la force de friction.

La mobilité électrophorétique d'une molécule peut-être exprimée (de manière simplifiée) par la relation : mobilité = k . (pH — pI) / masse molaire où pI est le point isoélectrique de la molécule.

Cette technique permet, entre autre, de :

  • déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur masse molaire respective
  • d'évaluer le degré de purification d'une protéine
  • de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction avec un ou des anticorps)
  • de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en protéomique), selon 2 paramètres : point isoélectrique (isofocalisation) puis masse molaire
  • ...
  • de séquencer l'ADN
  • de déterminer la taille de fragments d'ADN
  • de séparer des acides nucléiques pour les analyser par la technique du Northen blot (ARN) ou du Southern blot (ADN)
  • d'établir le profil de restriction (hydrolyse par des enzymes de restriction) de fragments d'ADN
  • ...

2. Gel d'électrophorèse des protéines en conditions dénaturantes

La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été décrite par Ulrich Laemmli en 1970.

C'est l'une des techniques (et donc l'un des articles) les plus cité(e)s dans la littérature scientifique :

Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4" Nature 227, 680 - 685

On fait bouillir un mélange de protéines en présence :

En conséquence :

  • les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
  • les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique

sodium dodecyl sulfate

Les protéines de l'échantillon sont ensuite séparées par une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS.

C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation :

  • d'acrylamide qui forme des chaînes
  • et de bis-acrylamide qui ponte les chaînes d'acrylamide

La réaction de polymérisation est :

  • initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium
  • catalysée par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane - toxique)

polymere acrylamide bis-acrylamide

Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les mailles du réseau sont serrées.

En conséquence :

  • plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses peuvent migrer
  • une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant moins que sa masse molaire est élevée
Pourcentage d'acrylamide Gamme de séparation en kDa
7,5 45 - 400
10 22 - 300
12 13 - 200
15 2,5 - 100

Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support et un peigne est enchâssé entre ces plaques.

Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant ainsi des puits.

La taille et le nombre des dents des peignes sont variables ce qui permet de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL d'échantillon de protéines à séparer.

Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans une cuve d'électrophorèse.

Du tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis dans la cuve et la migration s'effectue sous l'action d'un champ électrique :

  • tampon d'électrophorèse : Tris 50 mM - Glycine 0,2 M - SDS 0,1% - pH 8,3 - 8,8
  • Tris : nom commun du 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol
  • Glycine : acide faible (forme zwitterion non chargé ou anion)
  • voltage : 100 V - 150 V

Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans les puits.

Appareillage d'electrophorese

Source : Bio-Rad

Appareil d'electrophorese

Après migration, le gel est démoulé.

Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol et de l'acide acétique qui dénaturent de manière irréversible les protéines dans les mailles du gel.

Les protéines sont révélées par une coloration : par exemple avec le bleu de Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible).

On obtient différentes bandes pour chaque piste de la figure ci-contre (la flèche indique le sens de migration).

La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des protéines standards de masses molaires connues (piste de droite).

Exemple de marqueurs :

  • myosine (205 kDa)
  • β galactosidase (116 kDa)
  • phosphorylase β (97,4 kDa)
  • albumine (66 kDa)
  • ovalbumine (45 kDa)
  • anhydrase carbonic(29 kDa)

bande de migration revelee au bleu de coomassie

Source : E. Jaspard (2004)

3. Détermination de la masse molaire d'une protéine

La mobilité relative est le rapport :

distance de migration d'une bande
-------------------------------------------------------
distance de migration du front de migration

La droite : log (masse molaire) = f(mobilité relative) permet de déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue.

Determination graphique de la mase molaire mobilite relative

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4. Gel d'électrophorèse d'ADN

L'agarose est un polymere

Source : Pharmacia®

L'agarose est un polymère

(masse molaire d'environ 120.000 Da)

d'un diholoside.

Structure de l'agarose

Agarose

Description du système i-MUPID®

cuve electrophorese

preparation

peigne electrophorese

plaque electrophorese

Tampon d'électrophorèse

  • TAE : Tris/Acétate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8
  • TBE : Tris/Borate 40mM - EDTA 1 mM - pH 8

Tampon de charge : bleu de bromophénol 0,02% - xylène cyanol 0,02% - glycérol 3% - tampon TBE.

Les 2 colorants permettent de suivre la migration des fragments d'ADN :

  • la migration du bleu de bromophénol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 300 paires de base
  • la migration du Xylène cyanol est "comparable" à celle d'un fragment d'ADN de 4000 paires de base.

migration du bleu de bromophenol

Migration

--->

migration du xylene cyanol

5. Révélation des bandes d'ADN (coloration) par le bromure d'éthidium

Des hétérocycles organiques à noyaux accolés comme le bromure d'éthidium se lient à l'ADN bicaténaire par intercalation.

Ils occupent un site interbase sur deux jusqu'à saturation. Ce type de liaison est dit par "exclusion du voisinage".

Les intercalants sont séparés les uns des autres par des intervalles de 10,2 Å.

Le bromure d'éthidium (concentration d'utilisation finale : 0.5 g/ml) est extrèmement dangereux et nécessite de porter des gants pour manipuler les gels lors de la révélation et après.

bromure d'ethidium

Helice ADN

Intercalation

--->

Helice ADN avec le bromure d'ethidium intercale

Ethidium

Source figures : "Principes de Biochimie Minérale" - Lippard & Berg (1997), Ed. DeBoeck Universités

La visualisation des bandes révélées avec le bromure d'éthidium nécessite un transilluminateur UV (longueur d'onde : 302 nm, voire 254 nm et 365 nm).

Les rayons UV sont dangereux pour les yeux : il faut porter des lunettes, ou disposer d'une enceinte dans laquelle sont placés le transilluminateur et une caméra.

transilluminateur UV

visualisation des bandes revelees avec le bromure d'ethidium necessite

Il existe des méthodes de coloration de l'ADN qui ne nécessitent pas l'emploi d'UV mais sont moins sensibles que la révélation par le bromure d'éthidium :

  • le bleu de méthylène
  • l'azure A
  • le bleu de toluidine

La coloration au bleu de Nile semble une méthode à la fois sensible et non dangereuse.

6. Détermination de la taille d'un fragment d'ADN

Gel d'électrophorèse sur agarose (ci-dessous) sur lequel on voit :

  • les marqueurs (ou échelle, "ladder") de longueur (en paires de base) de fragments d'ADN

  • un fragment d'ADN inconnu

Marqueurs de migration

La droite : log (taille) = f(distance de migration) permet de déterminer la taille en paires de base d'un fragment d'ADN inconnu (figure de droite).

droite etalon representation log taille en fonction distance de migration

7. Expérience à analyser

Voir une simulation de migration électrophorètique d'ADN.

Analyse du gel de la figure ci-contre :

a. De quels type d'électrophorèse s'agit-il ?

b. De quels appareils, produits et consommables a-t-on besoin pour réaliser cette expérience ?

c. Quelle masse d'agarose faut-il peser pour obtenir 60 mL de gel 1,2 % ?

d. Calculer la taille du fragment d'ADN inconnu.

Exemple de separation su gel d'agarose

8. L'électrophorèse sur gel bi-dimensionnel en protéomique (SWISS-2DPAGE)
a. Principe

La stratégie la plus courante est de séparer dans un premier temps les protéines par électrophorèse bidimensionnelle en gel de polyacrylamide (ou 2D - PAGE - "two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis").

En effet, du fait de leur composition en acides aminés, les protéines diffèrent les unes des autres par leur masse molaire et leur charge nette à un pH donné. Cette valeur est caractérisée par le point isoélectrique ou pI.

Les protéines ont :

  • des pI qui s'échelonnent de 2 (glucose-1-phospho-D-mannosylglycoprotéine phosphodiestérase) à 12 (cathepsine G)
  • des masses molaires de 5 kDa à 590 kDa (calossine - 5322 acides aminés !)

L'une des difficultés majeures de la séparation est de trouver des conditions d'électrophorèse qui couvrent de telles gammes de propriétés physico-chimiques.

La séparation se fait en deux temps.

1ère dimension : une isoélectrofocalisation (IEF) où les polypeptides migrent jusqu'à un pH égal à leur pl.

La séparation selon la charge utilisait auparavant des ampholytes pour obtenir un gradient de pH. Mais ce procédé n'était pas assez reproductible pour la comparaison de gels par superposition.

On utilise maintenant des gradients de pH immobilisés (IPG), formés avec des immobilines.

Les immobilines sont des dérivés de l'acrylamide et leur structure générale est décrite dans la figure ci-contre.

R correspond à un groupement carboxyle ou à une amine tertiaire qui forment une série de molécules tampon avec différentes valeurs de pKa d'ionisation (exemples : 3,6 - 4,4 - 4,6 - 6,2 - 7,0 - 8,5 - 9,3).

acrylamide

Les immobilines co-polymérisent avec les molécules d'acrylamide (voir figure ci-dessus) dans le gel d'IEF.

Ainsi, les groupes chargés portés par les immobilines qui forment le gradient de pH sont covalamment attachés (via une liaison vinyle) à la matrice de polyacrylamide et donc immobilisés.

Cette technique permet d'obtenir des gradients de pH reproductibles et très étroits : une pente de 0.01 unité pH / cm peut séparer un mélange de protéines avec une différence de pI de 0.001 unité pH !

2ème dimension : une séparation selon la masse molaire est un gel d'électrophorèse de polyacrylamide en conditions dénaturantes (sodium dodécyl sulfate ou SDS et réduction des ponts disulfure).

polyacrylamide 

Source : Piercenet

Ces deux électrophorèses sont effectuées de manière perpendiculaire l'une par rapport à l'autre.

Comme les paramètres de la séparation sont indépendants, cette technique est particulièrement résolutive : plusieurs centaines de chaînes polypeptidiques peuvent être séparées sous forme de taches de protéines ou spots sur un gel.

Gel bidimensionnel

Source : Humboldt - Universität Berlin

Voir des exemples de gels bi-dimensionnels.

Remarque : de plus en plus de techniques de protéomiques emploient une séparation (ou plusieurs successivement) par la chromatographie liquide à haute performance ("high performance liquid chromatography" - HPLC).

Exemples : nano-LC-MS/MS ou 2D-LC-MS/MS.

b. Les méthodes de révélation des protéines

Coloration des gels pour la révélation des protéines (100 ng à 0,1 ng de protéine par spot) :

  • Bleu de coomassie : 30 - 50 ng, faible sensibilité
  • bleu colloïdal : 5 à 10 fois plus sensible
  • nitrate d'argent : forte sensibilité (0,1 ng) (photo de droite ci-contre)
  • fluorophore "Sypro Ruby®" : forte sensibilité (1 à 10 ng) (photo de gauche ci-contre)

Les logiciels d'analyse d'image des gels repèrent les spots et calculent leur coordonnées et leur intensité.

La sélection des spots à prélever est transmise au couteau à gel. Les morceaux de gels sont déposés dans les puits de plaques à 96 puits.

Coloration des gels

Source : Sigma- Aldrich

Exemple d'appareillage :

  • électrophorèse 1ère dimension : "Protean IEF Cell" (BioRad)
  • électrophorèse 2ème dimension : "Ettan DALTsix Large Vertical System" (Amersham Biosciences)
  • logiciel : "ImageMaster 2D" (Amersham Biosciences)
  • couteau à gel : "Spot cutter" (BioRad)

Voir un développement de la protéomique et de la spectromètrie de masse.

 

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