Effets de paramètres physico-chimiques (pH, température, pression, force ionique et viscosité) sur l'activité enzymatique
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1. Effets du pH

a. Incidence du pH sur la structure et la fonction des enzymes
b. Equilibres de fixation du proton et formes de l'enzyme
c. Formalisme des paramètres cinétiques en fonction du pH
d. Représentations de la vitesse de catalyse en fonction du pH
e. Cas d'un substrat qui s'ionise
f. Cas plus complexes

2. Effets de la température

a. Effet de la température sur la constante d'équilibre
b. Energie d'activation d'une réaction et constante de vitesse
c. Théorie de l'état de transition et constante de vitesse
d. Cinétique de l'inactivation thermique

 

3. Effets de la pression

a. Effet de la pression sur la constante d'équilibre et la constante catalytique : volume d'activation
b. Ecart à la linéarité de la variation de la constante catalytique en fonction de la pression
c. Effet de la pression sur la fixation du substrat sur l'enzyme
d. Diagramme de phase de la dénaturation induite par la pression

4. Effets de la force ionique

a. Solubilité des enzymes
b. Effet sur l'activité des enzymes

5. Effet de la viscosité du milieu

6. Liens Internet et références bibliographiques

 

Introduction

Les paramètres physico-chimiques tels que le pH, la température, la force ionique, la pression et d'autres, conditionnent l'activité des enzymes. Ce sont des caractéristiques particulières car la très grande majorité des organismes vit dans des conditions qui correspondent à une plage réduite de ces paramètres.

Il existe cependant des organismes dits extrêmophiles dont les conditions de vie sont létales pour les autres organismes. Exemples :

  • les organismes hyperthermophiles vivent dans des milieux dont la température peut dépasser 110°C
  • à l'inverse, les organismes psychrophiles vivent à des températures qui peuvent être inférieures à -20°C.
  • D'autres organismes vivent dans des conditions de pressions très élevées ou dans des milieux très salins ou très acides ou bien dans d'autres conditions exceptionnelles.

L'étude de la variation de ces paramètres physico-chimiques sur l'activité enzymatique permet d'obtenir des informations sur le complexe ES et sur l'état de transition ES, et aussi sur les étapes critiques (souvent limitantes) de la réaction.

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1. Effets du pH

a. Incidence du pH sur la structure et la fonction des enzymes

Les enzymes sont des macromolécules amphotères qui contiennent un grand nombre de groupements ionisables (acides ou basiques) portés par les 2 acides aminés situés aux extrémités N- et C-terminales et par les chaînes latérales des acides aminés qui constituent la chaîne polypeptidique.

Figure ci-dessous : Equilibre d'ionisation des groupements chimiques des acides aminés des protéines.

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic active site actif pH biochimej

La majorité de ces groupements étant à la surface des protéines, leur charge dépend de leur pKa et du pH de l’environnement cellulaire.

Groupement pKa ΔHionisation (kcal.mol-1)
α-carboxylique (C-terminal) 3,0 - 3,2 ± 1,5
α-carboxylique (Asp ou Glu) 3,0 - 5,0
imidazole (His) 5,5 - 7,0 6,9 - 7,5
α-aminé (N-terminal) 7,5 - 8,0 10 - 13
ε-aminé (Lys) 9,5 - 10,6
sulfhydryle (Cys) 8,0 - 8,5 6,5 - 7,0
phénol (Tyr) 9,8 - 10,5 6
guanidinium (Arg) 11,6 - 12,6 12 - 13

La gamme de valeurs de pKa indique que la valeur réelle est conditionnée par l'environnement physico-chimique du groupement considéré (structure tridimensionnelle et dynamique conformationnelle de l'enzyme, accessibilité au solvant). Par exemple, le groupement γ-carboxylique du Glu (acide aminé libre) a un pKa = 4 mais il se comporte comme un acide plus faible dans un environnement fortement non polaire comme l'intérieur de la structure de l'enzyme.

La variation des charges des acides aminés affecte évidemment la charge nette globale des enzymes et la distribution des charges à leur surface. En conséquence, la variation du pH affecte la stabilité et la solubilité des enzymes. A des pH extrêmes, il y a un excès de charge de même signe (charges négatives portée par les groupements aminés à pH acide et charges positives portées par les groupements acides à pH alcalin). De plus, les interactions électrostatiques et les liaisons hydrogène qui ont un rôle clé (de par leur nombre notamment) dans la stabilisation de la structure tridimensionnelle des enzymes sont rompues. La dénaturation induite par le pH est un processus d'autant plus irréversible que l'enzyme est exposée à des pH extrêmes.

La variation des charges des acides aminés affecte également la réactivité des groupes impliqués dans la réaction enzymatique (fixation du substrat et/ou catalyse) :

  • En conséquence, la variation du pH affecte l'activité des enzymes. Pour la grande majorité des enzymes, des valeurs de pH acides ou basiques induisent une perte totale, irréversible, de l'activité enzymatique.
  • A l'inverse, pour chaque enzyme, il existe une zone (relativement étroite) de pH optimal pour son activité.
Enzyme pH optimum Enzyme pH optimum
Catalase - E.C. 1.11.1.6 7,0 Myeloperoxidase - E.C. 1.11.2.2 4,7 - 6,0
Lipase (estomac) - E.C. 3.1.1.3 4,0 - 5,0 Lipase (pancréas) - E.C. 3.1.1.3 8,0
Amylase (malt) - E.C. 3.2.1.1 4,6 - 5,2 Amylase (pancréas) - E.C. 3.2.1.1 6,7 - 7,0
Maltase - E.C. 3.2.1.20 6,1 - 6,8 Invertase - E.C. 3.2.1.26 4,5
Trypsine - E.C. 3.4.21.4 7,8 - 8,7 Pepsine - E.C. 3.4.23.1 1,5 - 1,6
Uréase - E.C. 3.5.1.5 7,0 Triose-phosphate isomérase - E.C. 5.3.1.1 6,0 - 8,4

Les valeurs de pH optimal sont très variables d'une famille d’enzymes à une autre, et sont souvent liées au compartiment subcellulaire ou à l’organe (exemple : pH 8 dans le duodénum) dans lequel elles agissent.

Compartiment pH Potentiel électrique (mV)
Cytosol 7,2 0
Fluide extracellulaire 7,4 30
Appareil de Golgi 6,3 0
Lysosome 3,5 - 5,5 19
Mitochondrie 8,0 - 155
Noyau 7,2 0
Réticulum endoplasmique 7,2 0
Peroxisome 7,0 12
Potentiel électrique relatif à celui du cytosol, à 37°C et pour une force ionique de 0,15 M.

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b. Equilibres de fixation du proton et formes de l'enzyme

Le site actif d'une enzyme peut contenir plusieurs groupements ionisables, certains impliqués dans la fixation du substrat, d'autres dans la catalyse de la réaction enzymatique.

Figure ci-dessous : Equilibres d'ionisation de groupements chimiques d'acides aminés qui contrôlent l'activité d'une enzyme. Exemple de 2 groupements impliqués dans l'activité :

  • Forme En-1 : les 2 groupements sont déprotonés (exemple : -COO- et -NH2)
  • Forme En+1 = les 2 groupements sont protonés (exemple : -COOH et -NH3+)
  • Seule la forme de l'enzyme qui a un groupement protoné et l'autre non protoné (En) est active.

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En regard de la complexité tant du nombre de réactions mises en jeu que de leur formalisme, il est nécessaire de faire des simplifications justifiées :

  • Les diverses formes de l'enzyme dans le schéma représentent, respectivement : En+1 = EH2 ou EH2+ ou EH22+ et ainsi de suite ; En = EH- ou EH0 ou EH+ et ainsi de suite ; En-1 = E2- ou E- ou E0 et ainsi de suite. Les 3 formes de E peuvent fixer le substrat mais seul le complexe EnS catalyse la réaction.
  • Une seule forme ionique du substrat S est prise en compte. Cela implique que : S est non chargé ou S a la même charge à toutes les valeurs de pH étudiées ou toutes les formes ioniques de S se fixent de manière équivalente ou la concentration totale de S est ajustée à chaque valeur de pH de sorte que la concentration de la forme ionique « active » est constante.
  • Pour la plupart des enzymes, les réactions « verticales » (addition ou dissociation de H+) sont très rapides par rapport à l'étape catalytique. On peut donc émettre l'hypothèse que les étapes d'addition ou de dissociation de H+ sont à l'équilibre.
  • Les réactions « horizontales » (addition ou dissociation de S) peuvent ou non être rapides par rapport à l'étape catalytique. Cependant, afin d'obtenir une équation de la vitesse sans terme en [H+]2, on doit faire l'hypothèse que l'étape catalytique est lente et donc limitante.

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Le facteur multiplicatif de [S]0 est la fonction de saturation en fonction du pH pour toutes les formes « ES ». Par exemple :

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Les 6 termes du dénominateur correspondent respectivement à En-1 (forme de « référence »), En, En+1, En-1S, EnS et En+1S.

Le terme ([S]0/βKS) est identique au terme ([H+][S]0Kes2/Ke2KS[H+]) car la constante d'équilibre globale entre En-1 et En-1S est la même quel que soit le chemin suivi dans le schéma réactionnel. En remplaçant par ce terme et en multipliant le numérateur et le dénominateur par (Ke2/[H+]), on aboutit à la relation 4 énoncée précédemment.

En conclusion, la même équation est obtenue quelle que soit la forme de l'enzyme considérée comme « référence ».

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c. Formalisme des paramètres cinétiques en fonction du pH

On retrouve bien évidemment la relation de Michaelis-Menten-Henri. Pour n’importe quelle valeur de pH, le formalisme est :

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d. Représentations de la vitesse de catalyse en fonction du pH

Si les valeurs de pKa d'ionisation des groupements impliqués dans la catalyse sont séparées par au moins 3,5 unités pH (c'est-à-dire K1 > 3160 K2), les représentations graphiques de VMaxapp = f(pH) et de VMaxapp / KSapp = f(pH) ont une forme en cloche :

  • Leur maximum est proche de VMax et de VMax /KS, respectivement.
  • Les valeurs de pKa sont les valeurs de pH qui correspondent aux ordonnées VMaxapp/2 et (VMaxapp / KSapp)/2, respectivement.

Figure ci-dessous : représentation de VMaxapp (enzyme liée) et de VMaxapp/KSapp (enzyme libre) en fonction du pH

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Figure ci-dessous : représentation logarithmique de Dixon-Webb

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e. Cas d'un substrat qui s'ionise

Si le substrat a des groupements ionisables dont les valeurs de pKa (pKa1 et pKa2) sont dans la gamme de pH étudiés, l'équation de vitesse s'écrit :

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f. Cas plus complexes

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2. Effets de la température

L'activité de la plupart des enzymes est optimale entre 15°C et 45°C. La vitesse des réactions chimiques non catalysées augmente de manière exponentielle avec la température. En ce qui concerne les réactions biochimiques catalysées par des enzymes, les effets de la température sont complexes.

En effet, la température affecte le type et la force des interactions intramoléculaires et avec le solvant. Or ces interactions régissent la stabilité de la structure de l'enzyme donc la géométrie du site actif. Cette géométrie se répercute sur la fixation du substrat et/ou la libération du produit (effet sur les constantes d'équilibre) et/ou la réactivité des groupements impliqués dans la catalyse (effet sur la constante catalytique).

a. Effet de la température sur la constante d'équilibre

La constante d'équilibre Keq et la température sont liées par la relation de Jacobus Henricus van 't Hoff (1852 - 1911, Prix Nobel en 1901) :

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ΔG0, ΔH0 et ΔS0 sont respectivement les variations d’énergie libre de Gibbs, d’enthalpie et d’entropie du système. T est la température absolue (K) et R est la constante des gaz parfaits (8.314 J.mol-1.K-10). En intégrant cette équation entre Keq1 et Keq2 à des températures T1 et T2 :

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Cette équation (Gibbs-Helmholtz) permet de calculer la variation du pKa d'un groupement ionisable en fonction de la température (pKa = -log10app), d'où la constante 2.303).

Le changement de pKeq en fonction de la température peut être conjugué à la variation en fonction du pH pour identifier les groupements impliqués dans la catalyse. On trace les graphiques VMaxapp = f(pH) et de VMaxapp / KSapp = f(pH) à différentes températures et les valeurs de pKes et de pKe sont reportées en fonction de 1/T. La pente permet de déterminer la valeur d'enthalpie ΔH0 du groupement ionisable.

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b. Energie d'activation d'une réaction et constante de vitesse

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c. Théorie de l'état de transition et constante de vitesse

L'état de transition (ou complexe activé) est un état intermédiaire entre l'état initial et l'état final de la réaction enzymatique.

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium temperature etat transition state entropie enthalpie enthalpy entropy biochimej

Selon la théorie de l'état de transition, la concentration du complexe activé ES est proportionnelle à la concentration des réactifs : cette proportionnalité est traduite par une constante d'équilibre K.

Donc l'équilibre (supposé s'établir rapidement) entre les réactifs et le complexe activé (E+S <=> ES) permet d'écrire :

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Ainsi, plus la différence entre l'énergie libre des réactifs et celle de l'état de transition est grande (moins le complexe activé ES est stable), plus la réaction est lente.

Il faut évaluer la constante de vitesse k'.

Le complexe activé ES est maintenu par une liaison établie entre les réactifs : cette liaison est associée à la coordonnée de réaction et elle est supposée être si faible qu'elle se rompt lors de la première vibration.

Par conséquent, k' = κν où :

  • ν est la fréquence de vibration de la liaison qui se brise lorsque le complexe activé se transforme en produit.
  • κ (appelé coefficient de transmission) est la probabilité que la transformation du complexe activé ES se déroule dans le sens de formation du produit versus qu'elle se déroule dans le sens retour vers les réactifs.

La loi de Planck stipule que ν = ε/h où :

  • ε est l'énergie moyenne de la vibration qui mène à la décomposition de ES.
  • h est la constante de Planck.

La mécanique statistique nous dit qu'à une température T, l'énergie classique d'un oscillateur est ε = kb/T où :

  • kb est la constante de Boltzmann.
  • kb/T représente essentiellement l'énergie thermique disponible.

En combinant ces différentes relations, on obtient :

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d. Cinétique de l'inactivation thermique

Selon le modèle classique, l'activité enzymatique augmente jusqu'à la température optimale pour l'enzyme considérée puis diminue en raison de la dénaturation irréversible de l'enzyme. A température basse, la vitesse de dénaturation est faible. En revanche, puisque Eadénaturation > Eacatalytique, la vitesse de dénaturation augmente davantage que la vitesse de catalyse quand la température augmente.

Figure ci-dessous : variation de l'activité enzymatique en fonction de la température

  • (a) : accroissement de l'activité à des températures sub-optimales.
  • (b) : activité enzymatique maximale à la température optimale.
  • (c) : inactivation induite par la dénaturation thermique.

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Figure ci-dessus : variation de la vitesse en fonction de la température et du temps d'incubation. Graphique tracé avec les valeurs : ΔGcat = 50 kJ.mol-1 ; ΔGinact = 96 kJ.mol-1 ; [E]0 = 10-5 M. La température optimale apparente diminue quand le temps de l'essai enzymatique augmente.

Voir le script Python - Matplotlib.

Le modèle précédent a été sophistiqué de diverses manières. Par exemple, en introduisant une forme intermédiaire inactive mais non dénaturée : cette forme inactive est en équilibre rapide avec la forme active et c'est la forme inactive qui subit la dénaturation irréversible.

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Valeurs de grandeurs thermodynamiques pour des enzymes qui suivent le modèle impliquant un intermédiaire inactif non dénaturé
Enzyme Classification ΔGcat (kJ.mol-1) ΔGinact (kJ.mol-1) ΔHeq (kJ.mol-1)
Glutamate déshydrogénase E.C. 1.4.1.2 63 93 264
Dihydrofolate réductase E.C. 1.5.1.3 67 93 104
γ-Glutamyl transférase E.C. 2.3.2.2 63 98 109
Citrate synthase E.C. 2.3.3.1 77 103 164
Phosphatase alcaline E.C. 3.1.3.1 72 99 305
Phosphatase acide E.C. 3.1.3.2 79 95 142
β-Glucosidase E.C. 3.2.1.21 88 103 149
Fumarase E.C. 4.2.1.2 60 92 378
Source : Daniel & Danson(2013)

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3. Effets de la pression

Des pressions de 1000 à 2000 bars (pression atmosphérique : P0 = 1 atm = 1.013 bar = 1.013 105 Pa) dissocient les protéines oligomèriques (structure quaternaire) en sous-unités, des pressions de 4000 à 8000 bars dénaturent les structures tertiaires et les structures secondaires ne sont affectées qu'à partir de pressions de 10000 bars.

Les changements de pression affectent les réactions enzymatiques : une augmentation de la pression d'un facteur 1000 peut résulter en une diminution d'un facteur 2 de kcat et/ou de KM.

  • Par exemple, les réactions impliquant un gaz (réactions catalysées par les oxygénases ou les décarboxylases) sont modifiées par l'augmentation de la solubilité du gaz à des pressions élevées.
  • L'équilibre de la réaction peut être déplacé du fait d'une différence de volume molaire entre les substrats et les produits.
  • De plus, bien que faible, le changement de volume résultant de la liaison [enzyme - substrat] et de la catalyse a une incidence sur les réactions enzymatiques.
  • Certains mélanges réactionnels peuvent subir une variation de volume de 50 à 100 ml.mol-1 au cours de la réaction en raison de contraintes conformationnelles (formation de l'état de transition) et du changement d'hydratation des molécules.

La pression peut diminuer l'activité enzymatique jusqu'à inactivation complète à 2000 bars : cette inactivation est associée à des modifications de l'étape limitante provoquées par une hydratation accrue du site actif et/ou des changements conformationnels mineurs du site actif qui ont lieu lors de la compression.

De telles pressions n'ont rien à voir avec les conditions physiologiques même extrêmes. Elles ont cependant un intérêt majeur du point de vue théorique car elles permettent d'obtenir des informations concernant un état difficile à caractériser : l'état de transition. En conséquence, on obtient des informations quant aux différences entre le complexe ES (le substrat fixé de manière lâche à l'enzyme) et l'état de transition (ES).

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a. Effet de la pression sur la constante d'équilibre et la constante catalytique : volume d'activation

Selon le principe de Henry Louis Le Chatelier (1850 - 1936), toute pression change la répartition entre les équilibres observés à la pression atmosphérique. Ces changements de distribution obéissent à la relation :

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b. Ecart à la linéarité de la variation de la constante catalytique en fonction de la pression

Pour de nombreuses enzymes, les données expérimentales ne correspondent pas à une droite (relation 2 - paragraphe précédent).

Cette non-linéarité peut être interprétée en termes d'interdépendance entre la pression et d'autres paramètres (pH, température, propriétés physique du solvant - l'eau dans les conditions physiologiques), de dépliement de l'enzyme induit par la pression, de changements de compressibilité ou de changements de vitesse.

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Figure ci-dessus : variation non linéaire de la constante catalytique en fonction de la pression. (a) : T = 37°C; (b) : T = 25°C. Les données sont lissées avec un polynôme de degré 4. Valeurs issues de Decaneto et al. (2015) avec la métalloprotéase 14 de la matrice extracellulaire (E.C. 3.4.24.80).

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  • Les valeurs de ΔVcat sont positives : le volume de l'état de transition ES est donc plus grand que le volume du complexe ES. Cela signifie que la pression réduit la vitesse de catalyse en favorisant un état réactif ES de volume plus faible.
  • A pression "basses", la faible augmentation du volume (5 ± 0,6 mL.mol-1) peut s'expliquer par le relargage de molécules d'eau du site actif lors de la formation de ES et, en conséquence, par la création d'un certain vide dans le site actif.
  • De plus, à pression "basses", ΔVcat est quasiment identique à 25°C et à 37°C ce qui indique que la compaction de l'état de transition n’est pas modifiée.

Exemple : la butyrylcholine estérase de l’homme (E.C. 3.1.1.8) subit une augmentation du volume hydrodynamique au-dessus d'une pression critique. Cette augmentation reflète probablement l'intercalation de molécules d'eau entre les éléments de structure secondaire, la structure de la protéine "gonflant comme une éponge gorgée d'eau".

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c. Effet de la pression sur la fixation du substrat sur l'enzyme

La réaction enzymatique inclue une étape initiale de fixation du substrat sur l'enzyme (E+S -> ES), régie par la constante KM. Le volume d'activation de la réaction enzymatique (ΔVréaction) a donc 2 contributions :

  • le volume d'activation lié à l'étape de fixation (ΔVfixation)
  • le volume d'activation lié à l'étape catalytique (ΔVcat)

La relation générale de Briggs-Haldane s'écrit :

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d. Diagramme de phase de la dénaturation induite par la pression

Le volume de réaction et l'enthalpie du processus de dénaturation (enzyme native -> enzyme dénaturée) dépendent de la température et de la pression. Quand une enzyme se dénature, la dilatation thermique, la compressibilité et la capacité thermique changent.

L'équation développée par Hawley (1971) pour un système simple à 2 états (enzyme native et enzyme dénaturée) décrit la différence d'énergie libre de Gibbs en fonction de la température et de la pression :

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Où : ΔG = différence d'énergie libre de Gibbs entre les formes native et dénaturée de l'enzyme ; Δα = différence des facteurs de dilatation thermique ; Δβ = différence des facteurs de compressibilité ; ΔCp = différence des capacités thermiques molaires.

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Figure ci-dessus : variation d'énergie libre de Gibbs du processus de dénaturation en fonction de la température et de la pression. Graphique tracé avec les valeurs : Δα = - 1 mL.K-1.mol-1; Δβ = 0,65 mL.MPa-1.mol-1; ΔCp = 5,7 kJ.K-1.mol-1; ΔV0 = -8 mL.mol-1; ΔS0 = 0,28 kJ.mol-1; ΔG0 = 10,8 kJ.mol-1; T0 = 310 K; P0 = 0,1 Mpa.

Voir le script Python - Matplotlib.

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4. Effets de la force ionique

a. Solubilité des enzymes

L'expression la plus simple de la force ionique I est :

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium force ionique ionic strength pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Où Ci est la concentration molaire de l'ion i et zi sa charge.

Exemple : la force ionique d'une solution de CaCl2 0,1 M = 0.5 x [(0,1 x 22) + (2 x 0,1 x (-1)2)] = 0,3 M.

Une enzyme n'est active que si elle est solubilisée dans le milieu où elle agit. En solution, chaque molécule d'enzyme est hydratée, c'est-à-dire en interaction avec des molécules d'eau. Si on introduit un sel dans cette solution, il est aussi hydraté. Cependant, si ce sel est à une concentration beaucoup plus grande que l'enzyme, il monopolise toutes les molécules d'eau et l'enzyme n'a plus d'enveloppe d'hydratation : elle est séparée du solvant aqueux. C'est le processus de relargage ou "salting-out".

En dehors de l'étude des propriétés catalytiques des enzymes, cette modification de la solubilité des enzymes (des protéines en général) est aussi utilisée pour purifier les enzymes ou les protéger de la dénaturation (par exemple).

Les interactions [enzyme - eau] et [sel - eau] (voire [enzyme - sel]) dépendent :

  • De la répartition des charges à la surface de l'enzyme et de leur accessibilité au solvant, donc de la conformation de l'enzyme.
  • Des propriétés physico-chimiques du cation et de l'anion constitutif du sel.

La relation entre la solubilité d'une enzyme et la force ionique s'écrit :

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium force ionique ionic strength pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Où S0 est la solubilité de l'enzyme en absence de sel, S la solubilité de l'enzyme en présence du sel étudié, A est une constante (enzyme, pH, température), za et zb sont les charges des ions du sel et KS est le coefficient de relargage du sel.

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium force ionique ionic strength pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Figure ci-dessus : effet du type de sel (racine carrée de la force ionique) sur la solubilité de l'hémoglobine. (a) : NaCl; (b) : KCl; (c) : MgSO4; (d) : (NH4)2SO4; (e) : Na2SO4. La solubilité (mesurée à 25°C) est en g.(1000 g H20)-1. Valeurs adaptées de Green (1932).

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b. Effet sur l'activité des enzymes

Outre le pH, la charge de la chaîne latérale des acides aminés dépend de la force ionique : c'est donc un paramètre qui affecte l'activité enzymatique. C'est particulièrement probant quand la catalyse dépend du mouvement les unes vers les autres de molécules chargées : la fixation des substrats chargés dans le site catalytique et leur mouvement sont influencés par la composition en ions du milieu.

La constante de vitesse d'une réaction dans des conditions standard (k0) est liée à la constante de vitesse de cette réaction dans d'autres conditions (k) par la relation :

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium force ionique ionic strength pression pressure activation volume etat transition state biochimej

Où kcatI est la constante catalytique de la réaction à la force ionique étudiée, kcatI0 est la constante catalytique à une force ionique = 0, za et zb sont les charges des molécules réactives (exemples : enzyme et substrat, deux groupements réactifs de l'enzyme, …). Cette relation indique que :

  • Si les charges sont identiques, la vitesse de réaction augmente quand la force ionique augmente.
  • A l'inverse, si les charges sont opposées, la vitesse de réaction diminue quand la force ionique augmente.

Exemple : l'étape qui contrôle la vitesse de catalyse par la chymotrypsine implique le rapprochement de 2 groupes chargés positivement, His57 et Arg145. L'augmentation de la force ionique du milieu réactionnel augmente de manière significative la valeur de kcat.

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5. Effet de la viscosité du milieu

Le frottement augmente l'énergie d'activation nécessaire pour atteindre l'état de transition : la constante de vitesse de la réaction kcat est donc diminuée quand la friction de la protéine avec le solvant augmente.

Le frottement étant fonction de la viscosité macroscopique du solvant η, kcat est proportionnelle à la viscosité :

Enzyme equation kinetics cinetique activite enzymatique rate constant catalytic vitesse reaction Vmax KM active site actif stationary equilibrium viscosite friction frottement biochimej

En traçant VMax = f(η-1) on obtient une droite.

La viscosité ralentit également les d'étapes qui impliquent le mouvement de petites molécules comme la fixation du substrat et la libération du produit :

  • Dans le cas d'une étape catalytique limitante où la libération du produit est associée à des changements conformationnels de l'enzyme, la représentation log(kcat) = f(logη) est une droite.
  • Si cette libération s'effectue sans changement conformationnel, la représentation log(kcat) = f(η2) est une droite.

Les additifs fréquemment utilisés pour accroître la viscosité (viscogène) du milieu pour les mesures de vitesse des réactions enzymatiques sont le sucrose, le glycérol, l'éthylène glycol, le Ficoll 400. L'unité de la viscosité dynamique est Pa.s.

 

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