Titration des tyrosines au sein d'une protéine
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Analyser les courbes de titration de 3 protéines différentes (A, B et C).

protein concentration phenylalanine tryptophane tyrosine phenol phenolate ionisation ionization chromophore hyperchrome spectre absorbance acide amine aromatique biochimej

Combien de tyrosines contiennent ces protéines ? Quel est le pKa d'ionisation de ces tyrosines ?

En déduire la localisation des tyrosines dans la structure tridimensionnelle de ces protéines.


Cours sur les acides aminés Synthèse de la tyrosine
Phosphorylation de la tyrosine Sulfatation de la tyrosine

La valeur du pKa d'ionisation du groupement phénol des Tyr dépend de leur environnement.
Protéine A B C
Tyr titrées 5 2 3 2 3
pKa 9,8 9,8 apparent : 11,75 9,8 apparent : de 10 à 12
localisation en surface donc accessibles au solvant en surface complètement enfouie en surface de la surface au coeur
Voir un exercice sur la titration d'un acide aminé.

L'aspect abrupt de la 2è partie de la courbe de transition de la protéine B ne traduit pas la titration de 3 Tyr.

Elle reflète la perte brutale de la structure de la protéine dûe au pH très basique : la protéine est dénaturée et les 3 Tyr sont exposées ensemble au solvant.

Le groupement phénol des Tyr s'ionise en ion phénolate avec un pKa = 10,1 à 10,5.

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Cette ionisation induit :

  • une augmentation du coefficient d'extinction molaire : εM ion phénolate = 2500 M-1.cm-1. C'est l'effet hyperchrome.
  • une augmentation de la longueur d'onde d'absorbance maximale : 273 - 277 nm ---> 293 - 297 nm. C'est l'effet bathochrome ("red shift").

En conséquence : à pH > 11, c'est essentiellement l'absorbance des Tyr (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on mesure l'absorbance à 295 nm.

Les échelles ne sont pas identiques dans la figure ci-dessous.

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Le spectre d'absorbance de Trp est représenté à l'échelle 1, celui de Tyr a été multiplié par 2, celui de Cys par 4 et celui de Phe par 20.

En conséquence : à pH7, c'est essentiellement l'absorbance des Trp (selon leur nombre et leur accessibilité) que l'on mesure quand on enregistre le spectre d'absorbance d'une protéine ou que l'on mesure directement l'absorbance à 280 nm.


Acide aminé ou liaison λmax absorbance εM (M-1.cm-1)
Tyr (Y) 273 - à 277 nm / épaulement à 283 nm 1280 à 1440
Trp (W) 282 nm 5050 à 5690
Phe (F) 3 pics majeurs : 254 nm - 262 nm - 267 nm 200 à 220
Cys (C) de 240 à 280 (bande large) 120
liaison peptidique 190 à 230 nm -----

 

Liens Internet et références bibliographiques

"Proteins, Peptides & Amino Acids"

"Tyrosine metabolism"

Aller au site

KEGG

Jaspard E. (2000) "Role of protein-solvent interactions in refolding: effects of cosolvent additives on the renaturation of porcine pancreatic elastase at various pHs" Arch. Biochem. Biophys. 375, 220 - 228 Article

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