Étude du facteur de croissance du nerf ("Nerve growth factor" - NGF)
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1. Énoncé

2. Préambule pour la compréhension de l'exercice

3. Réponse partie A

4. Réponse partie B

5. Synthèse des résultats et complément d'informations

a. Sous-unités α-NGF et γ-NGF

b. Sous-unités précurseur β-NGF et β-NGF mature

c. Aperçu de la réparation des lésions des neurones

6. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Énoncé

Le facteur de croissance du nerf béta ou "β-nerve growth factor" ou β-NGF est une hormone de croissance qui contrôle la différenciation et le maintien de certains neurones. Chez la souris, cette protéine est produite par la glande sous-maxillaire.

Le β-NGF contient un grand nombre d'acides aminés soufrés, on peut donc étudier sa biosynthèse in vivo en mesurant l'incorporation de 35S-cystéine dans des coupes de glandes.

Partie A

Après incubation de coupes de glandes en présence de 35S-cystéine, on extrait les protéines solubles. Elles sont déposées sur un gel d'immuno-adsorbant constitué par des anticoprs anti-NGF immobilisés sur des billes d'agarose. Les produits retenus par l'immuno-adsorbant sont élués et analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturante (SDS-PAGE).

Cette expérience (extraction, fixation/élution, électrophorèse) est réalisée après incubation des coupes avec de la 35S-cystéine pendant 1 heure puis addition d'un excès de cystéine froide (non radioactive) pendant un temps variable (technique de poussée-chasse ou "pulse-chase").

  • 1. 35S-cystéine 1 h puis cystéine froide en excès pendant l'extraction des protéines (t = 0)
  • 2. 35S-cystéine 1 h puis cystéine froide en excès pendant 5 min avant l'extraction des protéines (t = 5)
  • 3. 35S-cystéine 1 h puis cystéine froide en excès pendant 15 min avant l'extraction des protéines (t = 15)
  • 4. 35S-cystéine 1 h puis cystéine froide en excès pendant 60 min avant l'extraction des protéines (t = 60)

Les profils d'électrophorèse (figure 1 ci-dessous) montrent l'évolution de la radioactivité à divers temps suivant la chasse par la cystéine froide.

Electrophorese radioactivite chasse pulse chase biochimej

La flèche indique la position de la chaîne catalytique de l'aspartate transcarbamylase (MM = 34000 Da).

Partie B

1. Le β-NGF est obtenu à l'état pur.

  • sa masse molaire déterminée par sédimentation à l'équilibre est : MM = 24000 Da en tampon normal / MM = 12000 Da en milieu dénaturant
  • la réaction avec le chlorure de dansyle (diméthylamino-5-naphtalènesulfonyle-1 chlorure - DNS) forme 2 nmoles de DNS-Ser pour 25 µg de β-NGF
  • la réaction avec la carboxypeptidase Y révèle un acide aminé basique

2. Le β-NGF ne réagit avec le réactif d'Ellman (dinitro-2,2'-dithio-5,5'-benzoïque - DNTB) qu'après traitement au β-mercaptoéthanol :

  • la réaction de 0,125 mg/mL de β-NGF avec le DNTB (après réduction) donne A412 = 0,816
  • le coefficient d'extinction molaire du chromophore formé est : εM = 13600 M-1.cm-1

3. La réaction du β-NGF avec le N-bromo-succinimide (NBS) se traduit par une baisse de A280. La disparition d'1 mole du résidu d'acide aminé qui réagit avec le NBS correspond à ΔεM = 4000 M-1.cm-1. Ainsi le β-NGF à 1,25 mg/mL traité par le NBS done une absorbance :

  • de 2 au début de la réaction
  • de 0,8 à la fin de la réaction

4. L'espèce A marqué par la 35S-cystéine (figure 1) est purifiée :

  • la réaction de A avec le DNS suivie de l'hydrolyse acide révèle la DNS-Ser
  • par contre, le traitement de A par la trypsine dans des conditions ménagées produit l'espèce B (figure 1)

Sur la base de ces données, apportez toutes les précisions sur la structure primaire, tertiaire (liaison covalente) et quaternaire du β-NGF.

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2. Préambule pour la compréhension de l'exercice

Il est nécessaire d'avoir une idée de la complexité du NGF ("high molecular weight 7S NGF complex").

Il est constitué de trois types de sous-unités :


molécule type activité
sous-unité α-NGF protéases à sérine de la famille des kallikréines hydrolyse du précurseur β-NGF en β-NGF mature
sous-unité γ-NGF

inhibe l'activité de la sous-unité α-NGF

précurseur β-NGF --------------------------
sous-unité β-NGF mature homodimère (paire de feuillets β antiparallèles enroulés) avec 3 ponts disulfures et 2 atomes de zinc médiateur des fonctions biologiques du NGF
--> Le NGF ("high molecular weight 7S NGF complex") est donc le complexe : [α-NGF]2 - [γ-NGF]2 - [β-NGF]2

3. Réponse partie A

1. Marquage à la 35S-cystéine, technique de poussée-chasse

Le souffre 35 est un émetteur β peu stable, principalement utilisé dans le marquage métabolique des protéines. En effet on peut obtenir facilement de la [35S]-méthionine ou cystéine avec des activités spécifiques extrêmement élevées.

Cette méthode permet d'étudier la synthèse protéique in vivo par marquage avec des acides aminés marqués (voir un cours sur les radioéléments en biologie).

Description de la technique de poussée-chasse ("pulse-chase")

Ces expériences sont de type cinétique ou "poussée" ("pulse"), elles permettent d'étudier les phénomènes qui se passent quand le précurseur marqué arrive dans le système biologique étudié.

Un des problèmes est que les molécules du précurseur qui n'entrent pas immédiatement dans le métabolisme étudié restent dans le système et masquent le comportement de celles qui y sont entrées les premières. Pour contourner ce problème on emploie la technique de la chasse froide ("cold chase").

La technique est la suivante : après une poussée rapide du précurseur radioactif, on envoie dans le système des quantités massives du précurseur non radioactif (froid). Cela dilue énormément les quantités résiduelles de précurseur radioactif non métabolisé.

Seuls sont marqués les produits synthétisés durant la poussée et on peut les suivre sans le bruit de fond dû à ce qui est synthétisé après la poussée.

Cette technique a été utilisée notamment :

  • pour la mise en évidence des fragments d'Okazaki (réplication de l'ADN)
  • pour l'étude des voies de sécrétion des protéines (George Palade)
  • pour la description de la photosynthèse (Calvin & Benson)
  • ...

2. Immuno-adsorption et électrophorèse en conditions dénaturantes

L'immuno-adsorbtion est une chromatographie d'affinité : des anticoprs anti-NGF immobilisés sur des billes d'agarose. Les produits retenus puis élués et analysés par SDS-PAGE (pics A et B) sont donc le NGF (ou des sous-unités du NGF).

Les profils d'élution de la figure 1 mettent en évidence 2 espèces :

  • l'espèce A est présente dés l'extraction. Sa masse molaire est supérieure à 34000 Da puisqu'elle migre moins loin que l'aspartate transcarbamylase.
  • l'espèce B, de masse molaire trés inférieure à 34000 Da, est néo-synthétisée au détriment de l'espèce A, puisque A disparaît au fur et à mesure que B apparaît.

==> Hypothèse : la molécule B est une forme maturée de A. En d'autres termes, A est une forme précurseur de B

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4. Réponse partie B

1. Masse molaire

a. Les conditions dénaturantes dissocient les sous-unités d'un oligomère :

  • conditions non dénaturantes : oligomère β-NGF = 24000 Da
  • conditions dénaturantes : sous-unités β-NGF = 12000 Da

==> Le β-NGF est un dimère.

Réaction avec le chlorure de dansyle (DNS)

structure chlorure dansyle biochimej

On détermine le résidu N-terminal d'une protéine en faisant agir, par exemple :

  • le chlorure de dansyle ou le chlorure de dabsyle (réactifs fluorescents)
  • le fluorodinitrobenzène (réactif d'Edman)
  • l'isocyanate de methyle

Quantité de β-NGF et de DNS - Ser

25 µg β-NGF ==> (25 10-6 g / 24 103 g.mol-1) = 1 10-9 mole = 1 nmole β-NGF

2 nmoles de DNS-Ser formées par nmole de β-NGF <==> 1 nmole de DNS-Ser formées par sous-unité β-NGF

==> L'acide aminé en position N-terminale de chaque sous-unité β-NGF est une sérine.

Réaction avec la carboxypeptidase Y : d'après l'alignement présenté ci-dessous, l'acide aminé à caractère basique en position C-terminale d'une sous-unité β-NGF serait une arginine.

2. Le réactif d'Ellman (dinitro-2,2'-dithio-5,5'-benzoïque - DNTB)

Structure  reactif Ellman biochimej

Il réagit avec les cystéines libres (groupements -SH).

Les cystéines impliquées dans un pont disulfure doivent être préalablement réduites (traitement au β-mercaptoéthanol).

Le chromophore formé est la DNTB-Cys.

  • la réaction de 0,125 mg/mL de β-NGF avec le DNTB (après réduction) donne A412 = 0,816
  • le coefficient d'extinction molaire du chromophore formé est εM = 13600 M-1.cm-1

a. La masse molaire du β-NGF est : MM = 24000 Da = 24000 g/mol (voir un rappel sur le Dalton)

b. [β-NGF] = 0,125 mg/mL = 0,125 g/L ==> [β-NGF] = (0,125 g/L / 24000 g/mol) = 5,2 10-6 M

c. [DNTB-Cys] = (0,816 / 13600) = 60 10-6 M

d. nombre de DNTB-Cys = (60 10-6 / 5,2 10-6) = 12 Cys

Conclusions

  • le β-NGF ne réagit avec le DNTB qu'après réduction ==> toutes les Cys sont initialement impliquées dans un pont disulfure
  • le β-NGF est un dimère (2 sous-unités de 12000 Da)
  • Il y a 12 DNTB-Cys ==> 6 Cys par sous-unité

==> Il y a 3 ponts disulfure intra-chaînes ou 6 ponts disulfure inter-chaînes.

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3. Réaction avec le N-bromo-succinimide (NBS)

Structure bromosuccinimide biochimej

Il coupe les protéines en réagissant avec les résidus tryptophane, tyrosine et histidine.

Mais à 280 nm, c'est la disparition du tryptophane que l'on suit.

  • la réaction de 1,25 mg/mL de β-NGF avec le NBS donne : ΔA412 = (2 - 0,8) = 1,2
  • le coefficient d'extinction molaire des tryptophane modifiés est : εM = 4000 M-1.cm-1

a. La masse molaire du β-NGF est : MM = 24000 Da = 24000 g/mol

b. [β-NGF] = 1,25 mg/mL = 1,25 g/L ==> [β-NGF] = (1,25 g/L / 24000 g/mol) = 5,2 10-5 M

c. Δ[Trp] = (0,8 / 4000) = 3 10-4 M

d. nombre de tryptophane modifiés = (3 10-4 / 5,2 10-5) = 6

==> Il y a 3 tryptophanes par sous-unité β-NGF.

4. Réaction du chlorure de dansyle et action de la trypsine sur la molécule A

L'acide aminé en position N-terminale de la molécule A est une sérine (comme dans le cas du β-NGF).

La trypsine hydrolyse la liaison peptidique après les résidus basiques ==> juste avant la séquence en acide aminé de la molécule B, on doit trouver une arginine ou une lysine.

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5. Synthèse des résultats et complément d'informations

a. Sous-unités α-NGF et γ-NGF (voir préambule)

  • la sous-unité α-NGF (Uniprot : P00757) est une protéase à sérine de la famille des kallikréines qui hydrolyse le précurseur β-NGF en β-NGF mature (Uniprot : P01139)
  • la sous-unité γ-NGF (Uniprot : P00756) est une protéase à sérine de la famille des kallikréines inactive

L'alignement ci-dessous montre le trés fort taux d'identité entre les acides aminés des 2 types de sous-unités (encadrés en fond rouge).

Alignement nerve growth factor NGF biochimej

Alignement généré avec MULTALIN - Figure générée avec ESPript 2.2

b. Sous-unités précurseur β-NGF et β-NGF mature

Dans cet exercice, le précurseur β-NGF est la molécule A (N° d'accession NCBI : gi 223655 pour la souris)

Dans cet exercice, la sous-unité β-NGF mature est la molécule B (Uniprot : P01139 - PDB : 1BTG pour la souris)

Ci-dessous, alignement des 2 séquences en acides aminés

  • Les 2 résidus sérine en positions N-terminales (molécules A et B) sont représentés en rouge avec une astérisque.
  • Le résidu arginine (molécule A) qui permet de générer la molécule B par action de la trypsine est en rose avec un point. De même que le résidu arginine C-terminal de la molécule B.
  • La position des 6 cystéines impliquées dans les 3 ponts disulfure est indiquée en vert (les numéros indiquent les couples de Cys).
  • Les éléments de structure secondaire (feuillets β) sont indiqués en noir au dessus de l'alignement.

Alignement nerve growth factor precurseur biochimej

Figure ci-dessous : structure du β-NGF mature (gauche : monomère - droite : dimère fonctionnel - vert et marron)

structure du facteur de croissance du nerf

Figure ci-dessous : sous-unité β-NGF mature fixée à l'un de ses récepteurs

structure du dimere du facteur de croissance du nerf

Source : "Le Cerveau (McGill)"

c. Aperçu de la réparation des lésions des neurones

Des études chez les Vertébrés ont permis de caractériser des protéines qui interviennent à la suite d'une lésion du tissu nerveux (figure ci-dessous). Le facteur de croissance NGF et les facteurs neurotrophiques comme la neurotrophine 3 (NT3) et le GDNF ("glial cell line-derived neurotrophic factor") permettent la reconnexion d'axones endommagés chez le rat.

Figure ci-dessous : schéma de synthèse des effecteurs impliqués dans la réparation nerveuse chez les Vertébrés.

Schema de synthese des effecteurs impliques dans la reparation nerveuse chez les Vertebres

Source : Laboratoire de Neuroimmunologie des Annélides

De plus, deux protéines associées à la croissance axonale : GAP-43 ("growth associated protein") et CAP-43 ("cone associated protein"), permettent conjointement le bourgeonnement et l'élongation des axones.

L'action de ces protéines est liée à la surexpression de leur gène respectif, induite par la lésion.

  • Ramer et al. (2000)
  • Bomze et al. (2001)

 

6. Liens Internet et références bibliographiques

Ramer et al. (2000) Nature 403, 312-316

Bomze et al. (2001) Nat Neurosci 4, 38-43

Facteurs de croissances non hématopoiétiques

"Cell signaling"

Gouet et al. (1999) "ESPript: multiple sequence alignments in PostScript" Bioinformatics 15, 305 - 308

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Extrait de l'article : "Nerve growth factor: structure/function relationships" - Bradshaw et al. (1994) Protein Science 3, 1901 - 1913

Nerve growth factor which has a tertiary structure based on a cluster of 3 cystine disulfides and 2 very extended, but distorted beta-hairpins, is the prototype of a larger family of neurotrophins. Residues involved in these interactions and in the maintenance of tertiary and quaternary structure have been identified by chemical modification and site-directed mutagenesis, and this information can be related to their location in the 3-dimensional structure.

For example, interactions between aromatic residues contribute to the stability of the NGF dimer, and specific surface lysine residues participate in receptor contacts.

The conclusion from these studies is that receptor interactions involve broad surface regions, which may be composed of residues from both promoters in the dimer.

Extrait de l'article : "Processing of the native nerve growth factor precursor to form biologically active nerve growth factor" Edwards et al. (1988) J Biol Chem 263, 6810 - 6815

In the mouse submaxillary gland β nerve growth factor (β-NGF) forms a complex with two members of the kallikrein family of serine proteases, termed the alpha and gamma subunits of NGF. We demonstrate that the β-NGF precursor produced in mammalian cells via a recombinant vaccinia virus can be cleaved by stoichiometric quantities of the γ-subunit to produce β-NGF.

Trypsin in catalytic quantities also produces native β-NGF. Proper cleavage depends critically on the conformation of the precursor. β-NGF has at least 10-fold more biological activity than its precursor.

Extrait de l'article : "Subunit interactions of the nerve and epidermal growth factor complexes: protection of the biological subunit from proteolytic modification" Nichols & Shooter (1985) Dev Neuroscience 7, 216

The nerve growth factor dimer (β-NGF) can undergo two proteolytic modifications, one near the amino terminus where a unique histidine/methionine bond is cleaved and the other at the carboxy terminus releasing the terminal arginine residue.

The modification near the amino terminus, releasing the first eight amino acids as an octapeptide, occurs as the result of the action of a specific endopeptidase present in the submaxillary gland. The amino terminal octapeptide of beta NGF is protected by both the alpha and gamma subunits of 7S NGF and its loss has no effect on 7S NGF complex stabilization by zinc.

The carboxy terminal arginine is protected only by the γ subunit.

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