Purification et caractérisation de la sapécine
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1. Enoncé

2. Réponse partie A

3. Réponse partie B

4. Réponse partie C

5. Complément d'information sur la sapécine

6. Liens Internet et références bibliographiques

 

1. Enoncé

Certains diptères synthètisent des polypeptides qui possèdent une fonction double.

L'un de ces polypeptides, la sapécine, synthètisé par la mouche Sarcophaga peregrine, est un facteur de croissance des cellules embryonnaires de la mouche et également un antibactérien.

Sur la base de ses propriétés antibactériennes, c'est-à-dire sa capacité à inhiber la croissance d'une culture bactérienne, la sapécine est purifiée à partir de cellules embryonnaires en culture.

Partie A

A partir de 900 mL de milieu de culture, les étapes de purification donnent les résultats présentés dans le tableau ci-contre.

Etapes Activité Totale (unités arbitraires) quantité de protéines (mg)
milieu de culture 6675 3258
chromatographie sur carboxyméthylcellulose 4247 26,8
concentration 2912 15,8
filtration sur gel 1986 5,3
chromatographie sur phase reverse 1540 0,53

a. Rappelez le principe des techniques utilisées à chaque étape. Comment l'activité totale est-elle mesurée ?

b. Calculez le rendement et le facteur de purification à chaque étape.

c. Le polypeptide obtenu à la dernière étape peut-il être considéré comme "pur" ? Justifiez la réponse.

Partie B

Une quantité inconnue du polypeptide purifié est prélevée dans le but d'en déterminer la composition en acides aminés.

a. Rappelez le principe de la technique.

b. Donnez la composition en acides aminés minimale à partir des résultats suivants :

Leu 45 / Thr 7,5 / Cys 45 / Glu 30 / Ile 7,5 / Asx 7,5 / Arg 30 / Ser 15 / His 7,5 / Lys 15 / Gly 7,5 / Tyr 15 / Ala 7,5 / Val 15

Partie C

Afin de déterminer la présence éventuelle de ponts disulfures, on fait réagir le polypeptide avec un mélange d'iodoacétamide et d'acide iodoacétique (iodoacétate), tous deux marqués au carbone 14.

Les composés qui se sont fixés sont ensuite visualisés par autoradiographie après séparation sur gel de polyacrylamide en conditions natives.

Dans ce but, des quantités arbitraires équivalentes du polypeptide purifié natif (figure A ci-contre) ou préalablement réduit par le dithiothréitol (figure B ci-contre) sont traitées de la manière suivante :

Piste 1 iodoacétamide radioactif 100%
Piste 2 iodoacétamide radioactif 66% - iodoacétate radioactif 33%
Piste 3 iodoacétamide radioactif 50% - iodoacétate radioactif 50%
Piste 4 iodoacétamide radioactif 33% - iodoacétate radioactif 66%
Piste 5 iodoacétate radioactif 100%
Piste 6 mélange de tous les dépôts des pistes 1 à 5

polypeptide iodoacetamide acide iodoacetique iodoacetate electrophorese purification protein biochimej

Le polypeptide natif et non traité par les réactifs radioactifs migre sous la forme d'une bande au même niveau que l'échantillon de la piste 1 du gel A ou du gel B (figure ci-dessus).

a. Expliquez l'apparition des bandes radioactives observées sur l'autoradiogramme.

b. Quel est le nombre de cystéines libres et/ou impliquées dans un pont disulfure ?

c. En faisant une recherche bibliographique, déterminer :

  • si la sapécine est synthétisée sous forme d'un précurseur
  • sa composition réelle en acides aminés
  • le nombre réel de ponts disulfure
  • sa masse molaire

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phase stationnaire principe de séparation catatéristiques de la phase stationnaire principe de la fixation et de l'élution
liquide partage liquide fixé sur un support inerte (papier, silice...) distribution des composants du mélange à séparer dans les deux phases liquides selon leur coefficient de partage 
solide adsorption adsorbant solide polaire phénomène de surface : formation de liaisons spécifiques entre les composants et la surface adsorbante
adsorption
(phase inverse)
molécules hydrophobes greffées sur de la silice interactions hydrophobes et élution par diminution de la polarité de la phase mobile
échange d'ions résine (polymères d'oses) porteuse de groupements chargés négativement ou positivement interactions électrostatiques avec les composants de charge opposée
exclusion
(filtration sur gel)
solide poreux les composants de diamètre supérieur à celui des billes du support sont "exclus" et ceux de diamètre inférieur y diffusent et sont freinés
affinité support sur lequel est greffée une molécule (le ligand) spécifiquement reconnue par un des composants de l'échantillon à analyser  déplacement de l'équilibre de liaison [molécule - ligand greffé] en faveur de l'équilibre [molécule - tierce molécule]

Les différents types d'échangeurs d'ions

Les échangeurs d'ions sont des billes qui portent des groupements ionisables dont la charge est :


positive : résines échangeuses d'anions qui fixent des molécules chargées négativement : ---R+...M- négative : résines échangeuses de cations qui fixent des molécules chargées positivement : ---R-...M+
nature de la fonction ionisable : ---R+ nature de la fonction ionisable : ---R-
base forte base faible acide fort acide faible

ammonium quaternaire : ---NR3+

exemple : triméthylammonium

---N(CH3)3+

forme protonnée d'une amine I, II ou III :

---NHR2+

exemple : diéthylaminoéthylammonium

groupement diethylaminoethylammonium purification protein biochimej

exemple : sulfonate

---SO3-

exemple : carboxyméthyl

---O-CH2-CO2-


Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le pH est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé :

  • dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le pH doit être inférieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5)
  • dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le pH doit être supérieur au pKa du groupement ionisable (exemple : le pKa du groupement carboxyméthyl est 4)
Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même pH) et en fonction de leur point isoélectrique (pI), elle porte une charge nette :
  • négative : le pI de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à pH 7
  • nulle
  • positive : le pI du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à pH 7

chromatographie echangeur anion cation purification protein biochimej

Il y a deux manières d'éluer les molécules fixées sur la résine :

  • En modifiant le pH de la phase mobile de telle sorte que les molécules qui sont chargées ne le soient plus (ou qu'elles portent une charge de même signe que l'échangeur d'ions) ; il n'y a plus alors d'interaction électrostatique entre les molécules et le groupement chargé porté par la résine et les molécules sont éluées.
  • En ajoutant un sel (à une concentration croissante) qui apporte forcément un ion de même charge que les molécules fixées à la résine : cet ion s'appelle un contre - ion.
L' ordre d'efficacité croissant des contre - ions pour les résines échangeuses de cations est le suivant :
  • cations monovalents : Li+ < H+ < Na+ < NH4+
  • cations divalents : Cd2+ < Mn2+ < Mg2+ < Zn2+ < Cu2+ < Ca2+ 
  • de plus, l'efficacité augmente avec la charge : K+ < Ca2+ < Al3+  

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Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

Le principe de la chromatographie d'exclusion (appelée aussi filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation) repose en première approximation sur la masse molaire des molécules à séparer.

En toute rigueur, le paramètre physico-chimique qui intervient est la dimension des molécules, donc leur volume et donc plus précisément leur rayon de Stokes. Mais cette relation univoque [masse molaire - rayon de Stokes] n'est valable que pour des protéines dites "globulaires", c'est-à-dire assimilées à des sphères.

Différents paramètres influencent le volume des molécules et peuvent fausser la détermination de la masse molaire réelle par ce type de chromatographie :

  • la géométrie : pour une même masse molaire, une protéine "allongée" (exemple, la calmoduline) n'aura pas les mêmes dimensions qu'une protéine globulaire.
  • les modifications post-traductionnelles : par exemple, les longues chaînes d'oses modifient fortement la géomètrie des protéines glycosylées et les rend plus denses ; à l'inverse, les lipoprotéines sont "allégées" par la présence de lipides.
  • la présence de sels, d'agents chaotropiques, de détergents ... 

La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (type "Sephadex") gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

  • le volume des billes est très finement calibré.
  • ainsi les molécules dont le volume est supérieur à celui des billes ne peuvent y pénétrer et sont éluées rapidement.
  • en revanche, les molécules dont le volume est inférieur à celui des billes y pénétrent et y subissent des frottements qui les retardent.
En conclusion, si l'on connait la masse molaire de la molécule que l'on veut séparer d'un mélange par cette technique, il faut choisir le gel le mieux adapté : c'est celui dont le domaine de fractionnement, c'est-à-dire la gamme des masses molaires pour lesquelles il y a diffusion partielle ou totale, englobe la masse molaire de la molécule à purifier.

Chromatographie à polarité de phase inversée ou en phase reverse

Les matrices pour chromatographie en phase reverse sont souvent à base de silice (SiO2), appelée aussi gel de silice car elle est plus ou moins hyratée.

La silice provient de la déshydratation de l'acide silicique et se présente sous forme d'une poudre dont les grains (les billes) sont très fins.

Ces billes peuvent être sphériques ou irrégulières.

A la surface de la silice on trouve des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-) qui lui confèrent un caractère polaire et acide et qui lui permettent de former des liaisons hydrogènes.

chromatographie phase reverse silice silanol purification protein biochimej

On utilise fréquemment une silice sur laquelle des chaînes alkylées (voir les différents groupes dans le tableau ci-dessous) sont greffées au niveau des groupements silanols.

Les chaînes alkylées confèrent à la silice un caractère très hydrophobe :

  • si la phase mobile est très polaire (donc très peu hydrophobe), certaines molécules hydrophobes vont établir des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire et ainsi être adsorbées
  • on augmente alors la concentration en solvant organique (apolaire donc hydrophobe) dans la phase mobile
  • à une concentration donnée l'hydrophobicité de la phase mobile étant plus importante que celle de la phase stationnaire, les molécules hydrophobes sont désorbées et éluées

chaines alkylees greffee a la silice chromatographie phase reverse purification protein biochimej

La phase mobile est donc constituée d'un mélange eau / solvant organique, en proportion variable :

La phase aqueuse : l'eau est le solvant le plus polaire (le moins hydrophobe).

On ajoute un sel pour tamponner le milieu. Cependant, on emploie souvent un acide fort (l'acide trifluoroacétique) et une amine quaternaire (la triéthylamine, par exemple) car ces deux composés ioniques forment des paires d'ions avec les molécules à séparer, neutralisant ainsi des charges portées par ces dernières. Celà a pour conséquence d'augmenter l'hydrophobicité des molécules et ainsi qu'elles s'adsorbent davantage sur la phase stationnaire.

Le solvant organique :

  • il en existe un grand nombre que l'on peut utiliser puisque la silice leur résiste. Cependant, les plus employés sont l'acétonitrile et le méthanol.
  • le choix du solvant organique dépend grandement de l'hydrophobicité des molécules à séparer : pour des molécules très hydrophobes, on peut choisir d'utiliser une forte concentration d'un solvant organique de polarité moyenne ou une faible concentration d'un solvant organique de polarité faible.
  • les solvants organiques ne doivent pas comporter d'impurétés ni avoir une forte absorbance aux faibles longueurs d'onde (ultra-violet) pour ne pas interférer avec les propriétés optiques des molécules à séparer. De plus selon sa qualité, on peut ou non utiliser un solvant organique pour un type d'analyse donnée. En conséquence, il faut prendre des solvants certifiés "ultra-purs" qui coûtent chers. 
Voir un cours sur les différentes techniques de chromatographie.

La concentration des protéines

L'ultrafiltration : l'échantillon est mis dans un tube. Ce tube contient une membrane semi-perméable dont les pores ont un diamètre tel que seules l'eau et des molécules au-dessous d'une certaine masse molaire choisie ("cut-off") peuvent la franchir. Le tube est placé dans une centrifugeuse et, sous l'action de la force centrifuge, l'eau et les petites molécules traversent la membrane.

Une autre méthode de concentration est la précipitation par un sel (exemple : le sulfate d'ammonium). La précipitation par un sel nécessite de dialyser l'échantillon après concentration.

Ces techniques de concentration occasionnent souvent des pertes importantes de matériel.

concentration ultrafiltration membrane semi permeable purification protein biochimej

Source : Millipore

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2. Réponse partie A

L'activité totale (AT) correspond à l'activité antibactérienne de la sapécine : 1 unité d'activité antibactérienne est la quantité de polypeptide qui entraine 50% d'inhibition de la croissance bactérienne (Escherichia coli) par rapport à un contrôle.


           AT étape n
R (%) = --------------
           AT étape 1
                      AT étape n
AS (UA/mg) = --------------
                     Q étape n
       AS étape n
FP = --------------
        AS étape 1

Etapes AT (unités arbitraires) Q protéines (mg) R (%) AS (UA/mg) FP
milieu de culture 6675 3258 100 2 1
chromatographie sur carboxyméthylcellulose 4247 26,8 63,6 158 79
concentration 2912 15,8 43,6 184 92
filtration sur gel 1986 5,3 29,8 375 187,5
chromatographie sur phase reverse 1540 0,53 23,1 2906 1453
R : rendement - AT : activité totale - Q : quantité de protéines - AS : activité spécifique - FP : facteur de purification

Le polypeptide peut être considéré comme "pur" car une forte activité totale (AT) est conservée pour une quantité minime de protéines en regard des valeurs initiales.

Bien évidemment, à l'échelle moléculaire et compte-tenu du nombre d'Avogadro, aucun corps (hormis sous forme de cristal "pur") ne peut être considéré comme totalement pur. A fortiori en ce qui concerne les protéines extraites de milieux extrêmement composites et complexes comme la cellule.

Cependant, l'enrichissement est tel (facteur de purification de 1453) que, macroscopiquement, on peut considérer que la solution ne contient quasi exclusivement que le polypetide purifié.


3. Réponse partie B

Conditions d'hydrolyse totale acide des liaisons peptidiques pour la détermination de la composition minimale en acides aminés : réduction des ponts disulfure / HCl 6N / 110°C pendant 24 à 72 h.

  • L'hydrolyse est ralentie par les acides aminés dont la chaîne latérale est encombrante.
  • Les fonctions amides sont transformées en fonction acide : Asn et Gln sont donc oxydés en Asp et Glu (Asx = Asp + Asn / Glx = Gln + Glu).
  • Le Trp est détruit sauf si le polypeptide est au préalable protégé par des groupements thiol ou phénol. La Tyr résiste davantage à l'hydrolyse.
Les acides aminés sont ensuite :
  • soit séparés par chromatographie d'échange d'ion puis quantifiés après dérivation par la ninhydrine (2,2-dihydroxyindane-1,3-dione - figure ci-contre). L'absorbance des dérivés est mesurée à 570 nm. Remarque : la proline ne réagit pas avec la ninhydrine.

ninhydrine purification protein biochimej

La composition en acides aminés est rapide (15 minutes) et nécessite environ 1 pmole de chaque acide aminé. On obtient une estimation du pourcentage de chaque acide aminé dans la chaîne polypeptidique.

Remarque : cette technique est de moins en moins utilisée car il n'est pas nécessaire de déterminer la composition en acides aminés pour déterminer la séquence. En effet, de plus en plus de séquences peptidiques sont :

  • soit traduites in silico à partir des séquençes des génomes, avec les risques d'erreur que celà comporte
  • soit déterminées par spectromètrie de masse en tandem (protéomique)

Les valeurs obtenues après hydrolyse acide sont multiples de 7,5 [Leu 45 / Thr 7,5 / Cys 45 / Glu 30 /Ile 7,5 / Asx 7,5 / Arg 30 / Ser 15 / His 7,5 / Lys 15 / Gly 7,5 / Tyr 15 / Ala 7,5 / Val 15].

La quantité correspondant à une unité est donc 7,5.

En divisant les valeurs par 7,5, on obtient la composition minimale : L6 / T1 / C6 / E4 / I1 / Asx1 / R4 / S2 / H1 / K2 / G1 / Y2 / A1 / V2 soit 34 acides aminés au minimum.

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4. Réponse partie C

L'iodoacétamide et l'iodoacétate sont des réactifs des groupements thiols (-SH) :

  • l'iodoacétamide ne change pas la charge
  • l'iodoacétate introduit une charge négative par -SH dérivé

reaction iodoacetamide cysteine purification protein biochimej

reaction iodoacetate cysteine purification protein biochimej

Il est donc capital de séparer les dérivés par électrophorèse en conditions natives afin que les différentes formes du polypeptide migrent seulement en fonction de leurs charges nettes respectives.

Plus le polypeptide est chargé négativement, moins il migre : c'est le traitement au iodoacétate radioactif 100% ===> piste 5 des gels A et B.

Le dithiothréitol (DTT - aussi appelé réactif de Wallace Cleland) réduit les ponts disulfures. Toutes les Cys sont accessibles aux réactifs.

Le dithioérythritol (épimère du DTT) est aussi un agent réducteur, mais moins efficace que le DTT.

Enfin, l'iodoacétamide et l'iodoacétate étant radioactifs, les Cys qui réagissent sont elles aussi marquées au 14C.

Lors de l'autoradiographie, la radioactivité impressionne le film aux endroits où migrent les différentes formes du polypeptide.

pont disulfure reaction dithiothreitol cysteine purification protein biochimej

Gel A : le polypeptide purifié est non réduit.

Seules les Cys libres sont marquées par l'un et l'autre des deux réactifs.

Gel B : le polypeptide purifié est d'abord traité par le dithiothréitol.

Toutes les Cys sont marquées.

polypeptide iodoacetamide acide iodoacetique iodoacetate electrophorese purification protein biochimej

polypeptide iodoacetamide acide iodoacetique iodoacetate electrophorese purification protein biochimej

Figure ci-dessous : interprétation de la figure du gel natif A.

separation sapecine marquage labeling purification protein biochimej

  • A 66% d'iodoacétamide, il existe des polypeptides totalement marqués par l'iodoacétate.
  • Inversement, à 66% d'iodoacétate, il existe des polypeptides totalement marqués par l'iodoacétamide.

Mais on ne peut pas visualiser de bandes car ces polypeptides sont à l'état de trace*.


Traitement piste polypeptide natif - gel A polypeptide réduit - gel B
iodoacétamide
radioactif 100%
1

1 bande qui migre le plus loin : le polypeptide est non chargé

1 forme ===> toutes les Cys sont sous la forme Cys-CO-NH2

La bande piste 1 - gel A migre aussi loin que la bande piste 1 - gel B.

iodoacétamide radioactif 66%
iodoacétate radioactif 33%
2

3 bandes = 3 formes variables du polypeptide selon le pourcentage respectif iodoacétamide - iodoacétate.

Par exemple, pour 66% - 33 %, co-existence des formes principales* :

Cys1-SH / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CO-NH2 / Cys4-CO-NH2 : pas de charge, forme qui migre le plus loin (identique à la piste 1)

Cys1-SH / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CO-NH2 / Cys4-CH2COO- : 1 charge négative

Cys1-SH / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CH2COO- / Cys4-CH2COO- : 2 charges négatives

4 bandes = 4 formes du polypeptide

===> 0 à 3 Cys marquées par l'iodoacétate
iodoacétamide radioactif 50%
iodoacétate radioactif 50%
3

5 bandes = 5 formes du polypeptide

===> 0 à 4 Cys marquées par l'iodoacétate
iodoacétamide radioactif 33%
iodoacétate radioactif 66%
4
iodoacétate
radioactif 100%
5

1 bande qui migre le moins loin : le polypeptide est totalement chargé négativement

1 forme ===> toutes les Cys sont sous la forme Cys-CH2COO-

La bande piste 5 - gel A migre plus loin que la bande piste 5 - gel B donc le polypeptide natif est moins négatif que le polypeptide réduit.

mélange :
tous les dépôts
des pistes 1 à 5

6

5 bandes = 5 formes du polypeptide :

Cys1-CO-NH2 / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CO-NH2 / Cys4-CO-NH2
Cys1-CO-NH2 / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CO-NH2 / Cys4-CH2COO-
Cys1-CO-NH2 / Cys2-CO-NH2 / Cys3-CH2COO- / Cys4-CH2COO-
Cys1-CO-NH2 / Cys2-CH2COO- / Cys3-CH2COO- / Cys4-CH2COO-
Cys1-CH2COO- / Cys2-CH2COO- / Cys3-CH2COO- / Cys4-CH2COO-

7 bandes = 7 formes du polypeptide

===> 0 à 6 Cys marquées par l'iodoacétate

Conclusions

1. Le polypeptide natif et non traité par les réactifs radioactifs migre exactement comme la bande 1 du gel A ou du gel B ===> la sapécine est un monomère.

2. Une bande apparaît dans la piste 1 du gel B et sept bandes apparaissent dans la piste 6 du gel B ===> la sapécine contient 6 cystéines.

3. Deux bandes additionnelles apparaissent dans la piste 6 du gel B par rapport à la piste 6 du gel A. La réduction par le DTT révèle 2 Cys supplémentaires ==> il y a 1 pont disulfure.

4. Voir un cours sur les cystéines et la formation des ponts disulfure.

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5. Complément d'information sur la sapécine

La sapécine mature contient 3 ponts disulfures (figure ci-contre) : Cys 3 - Cys 30 / Cys 16 - Cys 36 / Cys 20 - Cys 38 (numérotation par rapport à la forme mature - voir ci-dessous).

L'énoncé présente donc des profils électrophorètiques qui ne reflètent pas la réalité, et ce, dans un but pédagogique afin de mieux comprendre la démarche pour déterminer le nombre de cystéines et de ponts disulfures dans une protéine.

Quels seraient les profils électrophorètiques avec 6 cystéines impliquées dans 3 ponts disulfures ?

pont disulfure sapecine purification protein biochimej

Sapécine de Sarcophaga peregrina
Hanzawa et al. (2002)

Code d'accès : MMDB : 19110 / PDB ID: 1L4V

Visualisation de la sapecine de Sarcophaga peregrina - RMN en solution.

Code PDB : 1L4V

La sapécine (P18313) est synthétisée sous forme d'un précurseur qui contient :
  • un peptide signal (acides aminés 1 à 23)
  • un propeptide (acides aminés 24 à 54)

La forme mature de la sapécine correspond donc aux acides aminés 55 à 94, soit 40 acides aminés et une masse molaire de 4080 Daltons.

Séquence de la sapécine mature : A1TC3DLLSGTGINHSAC16AAHC20LLRGNRGGYC30NGKAVC36VC38RN40

La sapécine appartient à la famille des défensines des insectes.

Elle réprime la croissance des bactéries Gram+.

Source : Takeuch et al. (2004)

sapecine defensine alignement sequence acide amine purification protein biochimej

C'est une protéine basique avec une charge nette cationique de +3 au pH physiologique.

Des interactions électrostatiques s'établissent entre les acides aminés basiques et un phospholipide acide, la cardiolipine.

Ces interactions entraînent la formation de pores puis la perméabilisation de la membrane des bactéries. Lors de cette interaction, la sapécine adopterait une structure oligomèrique.

structure sapecine purification protein biochimej

Source : Takeuch et al. (2004)

 

6. Liens Internet et références bibliographiques

"Horst Ibelgaufts' COPE: Cytokines & Cells Online Pathfinder Encyclopaedia"

Aller au site

Matsuyama & Natori (1988) "Purification of three antibacterial proteins from the culture medium of NIH-Sape-4, an embryonic cell line of Sarcophaga peregrina" J. Biol. Chem. 263, 17112 - 17116

Kuzuhara et al. (1990) "Determination of the Disulfide Array in Sapecin, an Antibacterial Peptide of Sarcophaga peregrina (Flesh Fly)" J. Biol. Chem. 107, 514 - 518

Takeuch et al. (2004) "Channel-forming membrane permeabilization by an antibacterial protein, sapecin - Determination of membrane-buried and oligomerization surfaces by NMR" J. Biol. Chem. 279, 4981 - 4987

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