Un peptide d'intérêt biologique a été purifié en quantité trés faible grâce à son activité hormonale.

1. Une quantité de 0,079 µg de peptide est traitée par l'iodoacétamide marquée au ¹⁴C :

• L'activité spécifique du radioélément = 2 Ci/mmole.
• Le rendement de marquage du peptide est 100%.
• On isole le peptide marqué : il contient 0,2 µCi de radioactivité.

2. On estime la masse molaire du peptide par filtration sur gel Séphadex G10 (limite d'exclusion = 1000 g/mole). V_o indique le volume mort du gel et V_e indique le volume d'élution du peptide.

3. On étudie l'effet d'enzymes protéolytiques sur le peptide marqué au ¹⁴C.
a. Par chromatographie puis électrophorèse suivie d'une autoradiographie. Les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous.

b. Par chromatographie sur un échangeur de cations après marquage, par le chlorure de dansyle tritié (³H-DNSCl / 20 Ci/mmole), des extrémités N-terminales des fragments obtenus par protéolyse. Les résultats sont présentés dans la figure ci-dessous. La position de l'élution des DNS-Lys et DNS-Arg sont indiquées.

4. Le produit qui correspond au pic II (figure ci-dessus) contient une radioactivité de 2 µCi de ³H.
Le produit qui correspond au pic II' totalement hydrolysé puis traité au ³H-DNSCl (20 Ci/mmole) ne donne qu'un produit, la DNS-Ala, avec une radioactivité de 6 µCi.

5. Le peptide intact et le produit qui correspond au pic I sont titrables en suivant leur absorption à 295 nm : ils ont un pK apparent =10.
La courbe de titration du peptide intact révèle (entre autres) 3 valeurs de pK : 6,0, 10 et 12,5.

Expliquer les modes opératoires des différentes étapes. Tirer des informations de ces données. Déterminer la masse molaire et la séquence du peptide intact.

1. Estimation de la masse molaire du peptide

L'iodoacétamide est un réactif des groupements thiols (-SH). L'iodoacétamide ne change pas la charge du peptide.

0,079 µg de peptide est traitée par l'iodoacétamide marquée au ¹⁴C.

• activité spécifique : 2 Ci/mmole.
• rendement de marquage : 100%
• peptide marqué : 0,2 µCi de radioactivité

La quantité de radioactivité incorporée dans le peptide est :

2 Ci -> 1 mmole d'iodoacétamide
0,2 µCi -> x mmole d'iodoacétamide
=> x = [0,2 10^-6 Ci . 1 mmole / 2 Ci] = 1 10^-10 moles d'iodoacétamide incorporée dans 0,079 µg de peptide.

Hypothèse 1 : 1 cystéine dans le peptide

1 10^-10 moles d'iodoacétamide incorporée correspond à 1 10^-10 moles de peptide, soit :
1 10^-10 moles de peptide -> 0,079 10^-6 g
1 mole de peptide -> x g
=> x = [0,079 10^-6 g x 1 mole / 1 10^-10 moles] = 790 g
=> masse molaire peptide = 790 g/mole

Hypothèse 2 : 2 cystéines dans le peptide

1 10^-10 moles d'iodoacétamide incorporée correspond à 0,5 10^-10 moles de peptide, soit :
0,5 10^-10 moles de peptide -> 0,079 10^-6 g de peptide
1 mole de peptide -> x g de peptide
=> x = [0,079 10^-6 g x 1 mole / 0,5 10^-10 moles] = 1580 g
=> masse molaire peptide = 1580 g/mole

2. Estimation du nombre d'acides aminés du peptide

Le volume d'élution Ve du peptide (profil d'élution ci-dessous) indique qu'il a une masse inférieure à la limite d'exclusion = 1000 g/mole. En conséquence, le peptide a une masse molaire inférieure à 1000 g/mole. C'est donc l'hypothèse 1 qui est correcte.

Si on considère une masse molaire moyenne de 110 g/mole pour un acide aminé, on peut estimer que le peptide contient : [790 / 110] # 7 acides aminés.

3a. Fingerprinting et autoradiographie

Remarque : la technique actuelle de "fingerprinting" d'un peptide ou d'une protéine est l'électrophorèse bi-dimensionnelle suivie d'une empreinte peptidique massique ou d'un séquençage par spectromètrie de masse.

Action de la chymotrypsine (EC 3.4.21.1) : la chymotrypsine hydrolyse la liaison peptidique après Tyr, Phe, Trp ou Leu. Les figures A et B (ci-dessous) indiquent qu'il existe (au moins) 1 site d'hydrolyse dans le peptide intact, puisque la tâche obtenue par autoradiographie change de position.

Ce changement de position indique que le fragment qui continue à porter la radioactivité (Cys-¹⁴C) :

• Est plus acide ou a une charge négative plus élevée (migration plus prononcée vers le pôle + lors de l'électrophorèse) que le peptide intact.
• Est plus hydrophobe (élué à une hydrophobicité plus forte lors de la chromatographie) que le peptide intact.

On peut supposer la perte d'un ou plusieurs acides aminés basique(s) et hydrophile(s). La figure ci-dessous montre 2 possibilités de localisation de la (Cys-¹⁴C) par rapport au site d'hydrolyse par la chymotrypsine.

L'hypothèse 2 (H2) semble moins probable car le fragment 4 qui continuerait à porter la radioactivité (Cys-¹⁴C) serait difficilement plus hydrophobe que le peptide intact en ayant perdu Tyr, Phe, Trp ou Leu.

Action de la trypsine (EC 3.4.21.4) : les figures A et C indiquent qu'il n'existe pas de site d'hydrolyse par la trypsine (Arg - X ou Lys - X) dans le peptide intact (les tâches sont à la même position).

Donc :

• Soit ces 2 acides aminés sont absents.
• Soit l'un des deux se trouve en position C-terminale ce qui renforcerait l'hypothèse 1 (H1 figure ci-dessus).

On peut proposer la séquence suivante pour le peptide intact : (Cys¹⁴C + n acides aminés) - [Y, F, W, L] - (m acides aminés) - [K, R]

Remarque : l'expression régulière [K, R] signifie K ou R.

3b. Chromatographie d'échange de cations, marquage au tritium et carboxypeptidase B

La figure 3A indique que le peptide intact est chargé :

• Plus positivement que Lys car il est élué après DNS-Lys.
• Moins positivement que Arg car il est élué avant DNS-Arg.

La figure 3B montre l'élution des produits obtenus après action de la chymotrypsine et marquage par le chlorure de dansyle tritié (³H-DNSCl) des extrémités N-terminales des fragments obtenus.

Le chlorure de dansyle (DNS) est un réactif fluorescent qui permet de déterminer le résidu N-terminal de la séquence d'un peptide ou d'une d'une protéine.

D'autres réactifs sont couramment utilisés à cette fin : le chlorure de dabsyle (réactif fluorescent), le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (réactif de Sanger), l'isocyanate de méthyle, la fluorescamine.

La figure 3B indique que :

• Le pic I correspond au fragment qui contient la (Cys-¹⁴C) puisque les 2 types de radioactivité co-éluent avec ce pic.
• Ce fragment est élué avant le peptide intact (pic P figure 3A) : il est chargé moins positivement que le peptide intact.

• Le pic II correspond au second fragment issu de l'hydrolyse par la chymotrypsine. La radioactivité (³H-DNSCl) est portée par l'acide aminé N-terminal.
• Ce second fragment est élué quasiment comme l'Arg, ce qui est en faveur d'une extrémité N-terminale du second fragment = (m acides aminés) - Arg.

Le produit qui correspond au pic II de la figure 3B (c'est-à-dire le second fragment issu de l'hydrolyse par la chymotrypsine), est hydrolysé par la carboxypeptidase B qui coupe préférentiellement les peptides qui ont un acide aminé basique en position C-terminale.

La figure 3C décrit l'élution du fragment obtenus après cette hydrolyse qui porte la radioactivité (³H-DNSCl).

La figure 3C indique que le pic II' apparaît bien avant le pic II (figure 3B) : le fragment issu de l'hydrolyse par la carboxypeptidase B est donc nettement moins cationique que le produit qui correspond au pic II : il porte une charge positive bien plus faible.

En d'autres termes, un acide aminé basique est éliminé par la carboxypeptidase sB. Cet acide aminé est probalement Arg.

4. Le produit qui correspond au pic II fixe 2 µCi de ³H avec du chlorure de dansyle à 20 Ci/mmole.

• Le produit qui correspond au pic II' est totalement hydrolysé : on obtient donc tous les acides aminés qui le constituent.
• Ces produits marqués au chlorure de dansyle à 20 Ci/mmole ne donne que la DNS-Ala avec une radioactivité de 6 µCi.
• Il n'y a donc qu'un type d'acide aminé (Ala) en quantité 3 fois plus importante : pic II' = Ala-Ala-Ala.

En conséquence, puisque le produit qui correspond au pic II' = produit qui correspond au pic II traité à la carboxypeptidase : pic II = Ala-Ala-Ala-Arg.

Des 2 propositions qui précèdent, on en déduit que le peptide intact = (Cys¹⁴C + 1 acide aminé) - [Y, F, W, L] - A - A - A - R

5a. Le peptide intact et le produit qui correspond au pic I sont titrables en suivant leur absorption à 295 nm : ils ont un pK apparent =10. Ils possèdent donc une tyrosine.

L'ionisation induit :

• Une augmentation du coefficient d'extinction molaire : ε _M ion phénolate = 2500 M^-1.cm^-1 - effet hyperchrome.
• Une augmentation de la longueur d'onde d'absorbance maximale (273 - 277 nm -> 293 - 297 nm) - effet bathochrome ("red shift").

On a donc la séquence suivante pour le peptide intact = (Cys¹⁴C + 1 acide aminé) - Y - A - A - A - R

5b. La courbe de titration du peptide intact révèle (entre autres) 3 valeurs de pK : 6,0, 10 et 12,5.

• pK apparent = 6 => His
• pK apparent = 10 => Tyr
• pK apparent = 12,5 => Arg C-terminale

Finalement, on peut proposer 2 séquences pour le peptide hormonal :

• His - Cys - Tyr - Ala - Ala - Ala - Arg
• Cys - His - Tyr - Ala - Ala - Ala - Arg

Ces séquences confirment que le peptide intact est plus basique que Lys et moins basique que Arg (figure 3A) : pI = 1/2 [pK_a Tyr + pK_a Arg] = 11,3

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