Étude d'un peptide hormonal
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Un peptide d'intérêt biologique a été purifié en quantités trés faibles grâce à son activité hormonale.

1. Une quantité de 0,079 µg de peptide est traitée par l'iodoacétamide marquée au 14C.

  • activité spécifique du radioélément = 2 Ci/mmole.
  • rendement de marquage du peptide est 100%.

On isole le peptide marqué : il contient 0,2 µCi de radioactivité.

2. On estime la masse molaire du peptide par filtration sur gel Séphadex G10 (limite d'exclusion = 1000 g/mole). Vo indique le volume mort du gel et Ve indique le volume d'élution du peptide.

iodoacetamide radioactivite peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

3. On étudie l'effet d'enzymes protéolytiques sur le peptide marqué au 14C.

a. Par la méthode du "fingerprinting" (chromatographie - électrophorèse) suivie d'une autoradiographie.

Les résultats sont présentés dans la figure ci-contre.

fingerprinting chromatographie autoradiographie peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatographie chromatography hormone lysine biochimej

b. Par chromatographie sur un échangeur de cations après marquage, par le chlorure de dansyle tritié (3H-DNSCl / 20 Ci/mmole), des extrémités N-terminales des fragments obtenus par protéolyse.

Les résultats sont présentés dans la figure ci-contre.

La position de l'élution des DNS-Lys et DNS-Arg sont indiquées.

chromatographie chlorure dansyle peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

4. Le produit qui correspond au pic II (figure ci-dessus) contient une radioactivité de 2 µCi de 3H.

Le produit qui correspond au pic II' totalement hydrolysé puis traité au 3H-DNSCl (20 Ci/mmole) ne donne qu'un produit, la DNS-Ala, avec une radioactivité de 6 µCi.

5. Le peptide intact et le produit qui correspond au pic I sont titrables en suivant leur absorption à 295 nm : ils ont un pK apparent =10.

La courbe de titration du peptide intact révèle (entre autres) 3 valeurs de pK : 6,0, 10 et 12,5.

Expliquez les modes opératoires des différentes étapes. Tirez des informations de ces données.

Déterminez la masse molaire et la séquence du peptide intact.

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1. Estimation de la masse molaire du peptide

L'iodoacétamide est un réactif des groupements thiols (-SH).

L'iodoacétamide ne change pas la charge du peptide.

action iodoacetamide

0,079 µg de peptide est traitée par l'iodoacétamide marquée au 14C.

  • activité spécifique : 2 Ci/mmole.
  • rendement de marquage : 100%
  • peptide marqué : 0,2 µCi de radioactivité
 

La quantité de radioactivité incorporée dans le peptide est :

2 Ci ----> 1 mmole d'iodoacétamide
0,2 µCi ----> x mmole d'iodoacétamide
==> x = [0,2 10-6 Ci . 1 mmole / 2 Ci] = 1 10-10 moles d'iodoacétamide incorporée dans 0,079 µg de peptide.


Hypothèse 1 : 1 cystéine dans le peptide

1 10-10 moles d'iodoacétamide incorporée correspond à 1 10-10 moles de peptide, soit :

1 10-10 moles de peptide ----> 0,079 10-6 g
1 mole de peptide ----> x g
==> x = [0,079 10-6 g x 1 mole / 1 10-10 moles] = 790 g
==> masse molaire peptide = 790 g/mole

marquage iodoacetamide cysteine peptide hormonal radioactif iodiacetate chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej


Hypothèse 2 : 2 cystéines dans le peptide

1 10-10 moles d'iodoacétamide incorporée correspond à 0,5 10-10 moles de peptide, soit :

0,5 10-10 moles de peptide ----> 0,079 10-6 g de peptide
1 mole de peptide ----> x g de peptide
==> x = [0,079 10-6 g x 1 mole / 0,5 10-10 moles] = 1580 g
==> masse molaire peptide = 1580 g/mole

marquage iodoacetamide cysteine peptide hormonal radioactif iodiacetate chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej


2. Estimation du nombre d'acides aminés du peptide

Le volume d'élution Ve du peptide (profil d'élution ci-contre) indique qu'il a une masse inférieure à la limite d'exclusion = 1000 g/mole.

En conséquence, le peptide a une masse molaire inférieure à 1000 g/mole.

C'est donc l'hypothèse 1 qui est correcte.

gel filtration radioactivite peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

Si on considère une masse molaire moyenne de 110 g/mole pour un acide aminé, on peut estimer que le peptide contient : [790 / 110] # 7 acides aminés.

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3a. Fingerprinting et autoradiographie

Remarque : la technique actuelle de "fingerprinting" d'un peptide ou d'une protéine est l'électrophorèse bi-dimensionnelle suivie d'une empreinte peptidique massique ou d'un séquençage par spectromètrie de masse.

Action de la chymotrypsine (EC 3.4.21.1)

La chymotrypsine coupe après Tyr, Phe, Trp ou Leu.

Les figures A et B indiquent qu'il existe (au moins) 1 site de coupure dans le peptide intact, puisque la tâche obtenue par autoradiographie change de position.

Ce changement de position indique que le fragment qui continue à porter la radioactivité (Cys-14C) :

  • est plus acide ou a une charge négative plus élevée (migration plus prononcée vers le pôle + lors de l'électrophorèse)
  • est plus hydrophobe (élué à une hydrophobicité plus forte lors de la chromatographie)
que le peptide intact.

Fingerprinting et autoradiographie

On peut supposer la perte d'un ou plusieurs acides aminés basique(s) et hydrophile(s).

La figure ci-contre montre 2 possibilités de localisation de la (Cys-14C) par rapport au site de coupure par la chymotrypsine.

L'hypothèse 2 (H2) semble moins probable car le fragment 4 qui continuerait à porter la radioactivité (Cys-14C) serait difficilement plus hydrophobe que le peptide intact en ayant perdu Tyr, Phe, Trp ou Leu.

chymotrypsine peptide et acide amine hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

Action de la trypsine (EC 3.4.21.4)

Les figures A et C indiquent qu'il n'existe pas de site de coupure par la trypsine (Arg - X ou Lys - X) dans le peptide intact (les tâches sont à la même position).

Donc :

  • soit ces 2 acides aminés sont absents
  • soit l'un des deux se trouve en position C-terminale ce qui renforcerait l'hypothèse 1 (H1 figure ci-dessus)

peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

Sur la base de ces donnés, on peut proposer la séquence suivante pour le peptide intact :

(Cys-14C + n acides aminés) - [Y, F, W, L] - (m acides aminés) - [K, R]

chymotrypsine acide amine peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatographie chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

Remarque : l'expression régulière [K, R] signifie K ou R.

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3b. Chromatographie d'échange de cations, marquage au tritium et carboxypeptidase B

La figure 3A indique que le peptide intact est chargé :

  • plus positivement que Lys (il est élué après DNS-Lys)
  • moins positivement que Arg (il est élué avant DNS-Arg)

chlorure dansyle chromatographie echange cation peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

La figure 3B montre l'élution des produits obtenus après action de la chymotrypsine et marquage par le chlorure de dansyle tritié (3H-DNSCl) des extrémités N-terminales des fragments obtenus.

chlorure dansyle chromatographie echange cation peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

Le chlorure de dansyle (DNS) est un réactif fluorescent qui permet de déterminer le résidu N-terminal de la séquence d'un peptide ou d'une d'une protéine.

D'autres réactifs sont couramment utilisés à cette fin :

  • le chlorure de dabsyle (réactif fluorescent)
  • le 1-fluoro-2,4-dinitrobenzène (réactif de Sanger)
  • l'isocyanate de methyle
  • la fluorescamine

reactif fluorescent chlorure dabsyle dansyle fluorescamine chromatographie echange cation peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography fingerprinting hormone lysine biochimej

La figure 3B indique que :
  • le pic I correspond au fragment qui contient la (Cys-14C) puisque les 2 types de radioctivité co-éluent avec ce pic.
  • ce fragment est élué avant le peptide intact (pic P figure 3A) : il est chargé moins positivement que le peptide intact.
 
  • le pic II correspond au second fragment issu de l'hydrolyse par la chymotrypsine. La radioactivité ((3H-DNSCl) est portée par l'acide aminé N-terminal.
  • ce second fragment est élué quasiment comme l'Arg, ce qui est en faveur d'une extrémité N-terminale du second fragment = (m acides aminés) - Arg.

Le produit qui correspond au pic II de la figure 3B (c'est-à-dire le second fragment issu de l'hydrolyse par la chymotrypsine), est hydrolysé par la carboxypeptidase B qui coupe préférentiellement les peptides qui ont un acide aminé basique en position C-terminale.

chymotrypsine peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography hormone biochimej

La figure 3C décrit l'élution du fragment obtenus après cette hydrolyse qui porte la radioactivité (3H-DNSCl).

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La figure 3C indique que le pic II' apparaît bien avant le pic II (figure 3B) : le fragment issu de l'hydrolyse par la carboxypeptidase B est donc nettement moins cationique que le produit qui correspond au pic II : il porte une charge positive bien plus faible.

En d'autres termes, un acide aminé basique est éliminé par la carboxypeptidase B. Cet acide aminé est probalement Arg.


4. Le produit qui correspond au pic II fixe 2 µCi de 3H avec du chlorure de dansyle à 20 Ci/mmole.

Le produit qui correspond au pic II' est totalement hydrolysé : on obtient donc tous les acides aminés qui le constituent.

Ces produits marqués au chlorure de dansyle à 20 Ci/mmole ne donne que la DNS-Ala avec une radioactivité de 6 µCi. Il n'y a donc qu'un type d'acide aminé (Ala) en quantité 3 fois plus importante : pic II' = Ala-Ala-Ala.

En conséquence, puisque le produit qui correspond au pic II' = produit qui correspond au pic II traité à la carboxypeptidase : pic II = Ala-Ala-Ala-Arg.

Des 2 propositions qui précèdent, on peut retenir : peptide intact = (Cys-14C + 1 acide aminé) - [Y, F, W, L] - A - A - A - R


5a. Le peptide intact et le produit qui correspond au pic I sont titrables en suivant leur absorption à 295 nm : ils ont un pK apparent =10.

Ils possèdent donc une tyrosine.

Le groupement phénol des Tyr s'ionise en ion phénolate avec un pK apparent = 10,1 à 10,5 selon l'environnement polaire ou pas des Tyr.

ionisation tyrosine ion phenolate peptide hormonal marquage radioactif iodiacetate iodoacetamide chromatography fingerprinting hormone biochimej

L'ionisation induit :

  • une augmentation du coefficient d'extinction molaire : ε M ion phénolate = 2500 M-1.cm-1 - effet hyperchrome.
  • une augmentation de la longueur d'onde d'absorbance maximale (273 - 277 nm ---> 293 - 297 nm) - effet bathochrome ("red shift").

On a donc la séquence suivante pour le peptide intact = (Cys-14C + 1 acide aminé) - Y - A - A - A - R

5b. La courbe de titration du peptide intact révèle (entre autres) 3 valeurs de pK : 6,0, 10 et 12,5.

  • pK apparent = 6 ===> His
  • pK apparent = 10 ===> Tyr
  • pK apparent = 12,5 ===> Arg C-terminale

Finalement, on peut proposer 2 séquences pour le peptide hormonal :

  • His - Cys - Tyr - Ala - Ala - Ala - Arg
  • Cys - His - Tyr - Ala - Ala - Ala - Arg

Ces séquences confirment que le peptide intact est plus basique que Lys et moins basique que Arg (figure 3A) : pI = 1/2 [pKa Tyr + pKa Arg] = 11,3

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