Les déshydrogénases à NAD+ ou NADP+
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1. Les familles de déshydrogénases

2. Les déshydrogénases à NAD+ ou NADP+

2a. Structure quaternaire

2b. Structure tertiaire : les 2 domaines de l'alcool-DH NAD-dépendante

3. Structure du domaine liant le NAD(P)+ : le pli Rossmann

4. Motif β1-αA-β2 de la lactate-DH lié au NAD+

5. Mécanisme de transfert de H+ de l'éthanol à la nicotinamide (alcool-DH)

6. Représentation de la poche qui accomode la nicotinamide et stéréoisomérie du groupement carboxamide

7. Séquence des acides aminés du motif β1-αA-β2 de l'alcool, de la lactate et de la G-3-P DH

8. La glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.4

 

1. Les familles de déshydrogénases

La base de données PFAM ("Protein families database of alignments and HMMs") contient 13672 familles de protéines (Novembre 2011).

En choisissant l'option "Keyword search" et en tapant "dehydrogenase", on obtient plus de 1200 résultats.

Remarque : le groupe des déhydrogénases à NAD(P)+ (E. C. 1.4.1.X ) est un sous-ensemble du groupe des oxydoréductases.

Les oxydoréductases ne contiennent pas le même nombre de membres, par exemple :


famille description nombre
GLFV_dehydrog Glu/Leu/Phe/Val dehydrogenase 382
FAD_binding_2 FAD binding domain 537
NAD_binding_1 Oxidoreductase NAD-binding domain 1069
FMN_dh FMN-dependent dehydrogenase 178
Les nombres augmentent régulièrement et ne sont donc qu'indicatifs.

 

2. Les déshydrogénases à NAD(P)+


Exemples de déshydrogénases (DH) à NAD+ ou NADP+ Rôle ou voie métabolique

Toutes les déshydrogénases avec NAD+ ou NADP+ comme accepteurs d'électrons

(EC : Enzyme Commission)

EC 1.1.1

EC 1.2.1

EC 1.3.1

EC 1.4.1

  • déshydrogénation d'un aldéhyde en carboxylate
  • conversion de l'acétaldéhyde en acide acétique
  • alcool DH
  • lactate DH
  • glutamate DH
  • glycéraldéhyde 3-phosphate DH
  • glycérol 3-phosphate DH
  • isocitrate DH
  • alpha-cétoglutarate DH
  • malate DH

cycle de Krebs

  • dihydrolipoamide déshydrogénase (complexe pyruvate DH)
  • succinate DH
  • NAD(P)H déshydrogénases interne et externe
glucose 6-phosphate DH voie des pentoses phosphate

Les co-enzymes nicotinamide adénine dinucléotide NAD+ et NADP+ ne se distinguent que par un groupement phosphate sur le carbone 2' du ribose lié à l'adénine (figure ci-dessous).

Ils sont donc extrêmement proches du point de vue structural.

Cependant :

  • les DH qui participent aux voies de biosynthèse réductrices (anabolisme) utilisent essentiellement le NADP+
  • les DH qui participent aux voies de dégradation oxydatives (catabolisme) emploient quasi exclusivement le NAD+

Cette discrimination entre les deux formes du co-enzyme est un exemple admirable du pouvoir de reconnaissance des molécules par les enzymes en général et par les déshydrogénases en particulier.

deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP NADPH nicotinamide protein structure function relationship pli Rossmann fold quaternary biochimej

2a. Structure quaternaire des DH

Les DH sont souvent des enzymes multimériques constituées de 2, 4 ou 6 sous-unités identiques.

Ci-contre la structure quaternaire (assemblage des sous-unités) de la glutamate DH.

L'une des 6 sous-unités est en orange (figure ci-contre).

GDH deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold quaternary biochimej

 

2b. Structure tertiaire des DH : les 2 domaines de l'alcool-DH NAD-dépendante

Les séquences en acides aminés des DH n'ont que peu d'homologie.

Les DH sont structurées en deux domaines :

  • un domaine de fixation du NAD(P)+. Ces domaines ont des structures tridimensionnelles très semblables
  • un domaine de fixation du substrat qui est spécifique de la DH considérée (lactate DH, malate DH, alcool DH ...). Ces domaines ont des structures très différentes. En effet, chaque domaine a une topologie optimisée pour assurer la spécificité de reconnaissance du substrat.

Domaine deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold quaternary biochimej

Source : "Introduction à la structure des protéines"
Branden & Tooze (1996) - ed. De Boeck Université

Ces 2 domaines sont reliées par une région dite "charnière" (hinge-bending") qui assure la souplesse conformationnelle nécessaire à l'activité catalytique.

Le rapprochement des 2 domaines exclue les molécules de solvant lors de la catalyse.

Le centre actif (site de fixation et site catalytique) est constitué par les acides aminés du sillon inter-domaine.

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3. Structure du domaine liant le NAD(P)+ : le pli Rossmann

Voir un rappel sur les structures secondaires.

Le pli Rossmann ("Rossmann fold") est une structure super-secondaire (assemblage de plusieurs types de structures secondaires) : il est composé de 3 feuillets β liés à 2 hélices α de manière alternée (β-α-β-α-β).

Le nom a été donné en hommage à Michael Rossmann.

deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Branden & Tooze (1996)

deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : "Phaser - method for solving crystal structures"

Un pli Rossmann peut fixer un nucléotide : le domaine de fixation d'un dinucléotides (tel que NAD+ ou NADP+) contient donc 2 plis Rossmann appariés, chacun d'eux fixant l'un des nucléotides du co-facteur.

4. Visualisation de la lactate DH de Squalus acanthias, non complexée au calcium, à une résolution de 3 Å

Code PDB : 3LDH

Seuls les acides aminés 20 à 83 sont représentés.

Pour faire apparaître de multiples fonctions du menu Jmol :

  • clic sur "Jmol" (Mac)
  • clic droit sur "Jmol" (PC)

Les DH à flavine mononucléotide (FMN), appelées flavoenzymes, ne contiennent qu'un pli Rossmann.

Figure ci-contre :

  • la FMN correspond à la partie en noir de la molécule
  • la flavine adénine dinucléotide (FAD) correspond à l'ensemble de la molécule

Le centre réactionnel est un noyau aromatique tricyclique, l'isoalloxazine (la partie en rouge).

flavine adenine dinucleotide FAD deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : "Principes de Biochimie" Horton et al. (1994)

La FMN est une sorte de "convertisseur" d'un flux bi-électronique en un flux mono-électronique, puisqu'elle cède ses électrons à des centres [Fe - S], accepteurs mono-électroniques.

+H+, + H                                   -H+ , - e                                   -H+ , - e-
FMN    ------------------------>    FMNH2    ---------------------->   FMNH.    ---------------------->    FMN

Base de données :

Il existe des DH qui fixent le NAD(P)+ mais qui n'ont pas de pli Rossmann dans leur domaine de fixation du nucléotide.

La structure est un tonneau (α/β)8 : 8 hélices et 8 feuillets qui s'alternent ("TIM-barrel fold").

Voir : "The (αβ)8-barrel motif of Aldo-Keto Reductases".

Source : Richter et al. (2010)

TIM barrel deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

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4. Motif β1-αA-β2 de la lactate-DH lié au NAD

La présence de chaînes latérales hydrophobes à certaines positions (en vert sur la figure ci-contre) est nécessaire pour l'empilement des brins β contre les hélices α.

Le motif qui contient 31 résidus (de la lysine 22 à l'aspartate 52 en rouge) permet à cet aspartate de former une liaison hydrogène avec le 2'OH de l'adénosine.

Source : Branden & Tooze (1996)

Acide amine deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

5. Mécanisme de transfert de H de l'éthanol à la nicotinamide (alcool-DH)

La position spatiale du noyau nicotinamide du NAD+ et du substrat (l'éthanol dans cet exemple) explique la très haute stéréospécificité du transfert de l'ion hydrure sur le carbone 4 de la nicotinamide.

Dans l'alcool DH, un atome de zinc du site catalytique établit une liaison avec la fonction alcool du substrat.

Cette liaison s'ajoute à celles qui stabilisent de manière optimale le substrat dans le site catalytique et, en polarisant la liaison C-OH de la fonction alcool du substrat, elle facilite le transfert de l'atome d'hydrogène.

Stereospecifcite transfert hydrure alcool deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Branden & Tooze (1996)

Stéréospécificité du transfert de l'atome d'hydrogène

La réaction est : NAD(P)+ + H2 <==> NAD(P)H

Lors de la déshydrogénation (H2 = 2 H+ + 2 e-) du substrat, les transferts suivants s'opèrent :

  • l'atome d'hydrogène (H+ + e-) est transféré sur le carbone 4 de la nicotinamide
  • l'électron de l'atome d'hydrogène du groupement hydroxyle est transféré sur l'azote de la nicotinamide et neutralise la charge positive du groupement nicotinique
  • l'ion hydrure (H+) restant est éliminé dans le milieu

hydrogenation deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

6. Représentation de la poche qui accomode la nicotinamide et stéréoisomérie du groupement carboxamide

Les déshydrogénases sont divisées en 2 classes : A et B, en fonction de la stéréospécificité du transfert de l'atome d'hydrogène sur l'atome C4 de la nicotinamide.

Le cycle est asymétrique à cause du substituant sur le C3 : le groupement carboxamide.

En conséquence, les 2 atomes d'hydrogène sur le C4 dans la forme réduite (au-dessus et au dessous du cycle nicotinamide) ne sont pas équivalents.

La lactate DH appartient à la classe A : l'atome d'hydrogène est transféré du substrat vers la position au-dessus du cycle (en rouge sur la figure ci-contre).

La GAPDH appartient à la classe B : l'atome d'hydrogène est transféré du substrat vers la position au-dessous du cycle (en vert).

2 configuration spatiale poche deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Branden & Tooze (1996)

L'explication structurale est que pour chaque classe de déshydrogénases, le groupement carboxamide est fixé dans une "poche" de sorte qu'une seule des faces du cycle nicotinamide est accessible lors du transfert de l'atome d'hydrogène.

7. Séquence des acides aminés du motif β1-αA-β2

L'aspartate en rouge est conservé comme l'indique l'alignement ci-contre : alcool, lactate et glycéraldéhyde-3 phosphate déshydrogénases.

  • dans le cas des déshydrogénases à NAD+ , cet aspartate établit une liaison avec le 2'-OH du ribose de l'adénosine
  • comme, il est chargé négativement, il empêche aussi la fixation du NADP+, chargé négativement (groupement phosphoryle)

Celà permet aux déshydrogénases de discriminer les deux formes du coenzyme.

Acide amine conserve glutamate deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Branden & Tooze (1996)

Les déshydrogénases à NADP+ (exemple : la thréonine déshydrogénase) ont pour leur part :

  • une glycine conservée à la place de l'aspartate. Le faible encombrement stérique de la chaîne latérale de Gly (H) permet au groupement phosphoryle de se placer
  • une arginine conservée (à la place d'une Asn) dont la charge positive établit une liaison ionique avec le groupement phosphoryle

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8. La glutamate déshydrogénase EC 1.4.1.4

A βαβ fold is found in the coenzyme-binding sub-domain (β7-α8-β8) of the three isoforms of glutamate dehydrogenases (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 and EC 1.4.1.4).

Motif fixation jaspard deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Jaspard E. (2006)

This Rossmann fold begins with the motif G313AGNVA318 in the case of plant GDH4 (Ref).

By comparison, the motifs described in the literature are GXGXXG, GXGXXA and even GXGXXS as for example in the case of very large GDH from Streptomyces clavuligerus.

Modeling of the coenzyme-binding motifs and key residues of GDH4 from Chlorella sorokiniana with NADPH (NDP562) and glutamate

Some interactions (plain lines) between the motif G313AGNVA318 or key residues and the coenzyme are indicated.

  • NDP562AO3 - Gly313CA
  • NDP562AO1 - Asn316ND2
  • NDP562AO1 - Val317N
  • NDP562AO2 - Gly244N
  • NDP562NC4 - Thr285OG1

site fixation jaspard deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej

Source : Jaspard E. (2006)

The distances between the protonated carbon atom of the nicotinamide moiety (NDP562NC4) are too long for direct interactions with the motif G313AGNVA318.

However, this motif is stabilized by the H-bond Gly315O - Ala318N (dotted line).

Two distances (Glu557OE2 - Lys166NZ and Glu557O - Lys190NZ) are compatible with salt-bridges between the enzyme and glutamate.

The position of the motif G266VLTGKG272 is shown with the potential H-bond Lys166NZ - Thr269OG1.

Global organization of GDH subunits

All GDHs share a common pattern called the central domain flanked by an N-terminal region of various lengths and, for large GDHs, by a shorter C-terminal one.

The upper scheme shows the structural features specific of the central domain from plant GDH4.

The length indicated includes the gaps generated by the alignment.

deshydrogenase dehydrogenase NAD NADP nicotinamide protein structure quaternaire GDH glutamate function relationship pli Rossmann fold helix sheet helice feuillet quaternary biochimej jaspard

Source : Jaspard E. (2006)

 

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