Insuline : cystéine et pont disulfure
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1. L'insuline

L'insuline est synthétisée sous la forme d'un précurseur, la pré-pro-insuline dans les cellules β des îlots de Langerhans.

Le peptide signal est clivé dans le réticulum endoplasmique.

Après synthèse, la partie centrale (le polypeptide C) est hydrolysée, ce qui génère les polypeptides A et B. L'insuline mature est constituée de ces 2 polypeptides A et B reliés par des pont disulfure.

La réduction de l'insuline suivie de sa ré-oxydation s'accompagne d'une perte d'activité de 93%. Ceci est le résultat de la formation aléatoire des ponts disulfure.

Comment ces données sont-elles en accord avec l'idée que la séquence primaire d'une protéine dicte son repliement ?


Deux ponts disulfure INTER-chaînes de l'insuline se forment dès la biosynthèse de la pro-insuline.

La chaîne C de la pro-insuline a pour rôle de positionner correctement les chaînes A et B.

Quand la pro-insuline est correctement repliée, le peptide C est éliminé et un pont disulfure INTRA-chaîne se forme.

L'insuline adopte alors sa forme fonctionnelle.

Maturation preproinsuline Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Cette maturation par l'élimination du peptide C retarde l'apparition de l'activité hormonale de l'insuline jusqu'à ce qu'elle soit empaquetée dans les granules de sécrétion.

Sequence preproinsuline Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Pont INTRA-chaîne : CYS A 6 - CYS A 11

Ponts INTER-chaînes : CYS A 7- CYS B 7 / CYS A 20- CYS B 19

Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Visualisation de l'insuline de porc à une résolution de 1,5 Å

Code PDB : 4INS

Les 4 chaînes (A, B, C et D) sont colorées.

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2. La cystéine et la méthionine

La cystéine est génétiquement codée par les 2 codons : UGU et UGC.

La cystéine est l'acide L-2-amino-3-mercaptopropionique.

methionine Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

La chaîne latérale de la cystéine porte un groupement sulfhydryle (-SH) extrêmement réactif. Son pKa est de 8.33.

L'autre acide aminé sulfuré, la méthionine, porte un groupe méthyle supplémentaire. La méthionine est plus hydrophobe, d'un encombrement stérique plus important et moins réactive.

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3. Formation d'un pont disulfure

a. Introduction

Un pont disulfure est une liaison covalente entre 2 atomes de soufre de la chaîne latérale de 2 résidus cystéines (Cys) réduits.

Les ponts disulfure sont formés dans un environnement cellulaire oxydant. Le cytoplasme n'étant pas un milieu oxydant, il y a trés peu de protéines intracellulaires qui possèdent des ponts disulfure.

Toutes les cystéines d'une protéine ne forment pas un pont disulfure :

  • en fait, si l'on examine le fichier PDB-select 25, on s'aperçoit que seulement 27% des protéines contiennent des ponts disulfure.
  • par ailleurs, on ne connait pas les règles qui régissent la sélection de telle ou telle cystéine d'une protéine pour établir un pont disulfure.

Un pont disulfure peut être établi entre 2 cystéines :

  • d'une même chaîne polypeptidique : on parle de pont inTRA - chaîne
  • appartenant à 2 chaînes polypeptidiques (identiques ou différentes) : on parle de pont inTER - chaîne.

Le nombre de ponts disulfure (intra et/ou inter) au sein des protéines varie trés grandement : les toxines, bien qu'étant de petites protéines (20 à 30 acides aminés) peuvent en contenir jusqu'à 5, voire 6.

L'énergie libre de liaison qui résulte de la formation d'un pont disulfure est d'environ - 3,5 kcal/mol (voir Czaplewski et al., 2004). C'est une énergie importante qui contribue "sur le papier" de manière trés significative à la stabilisation de la structure tridimentionnelle native de la protéine.

Cependant, les ponts disulfure ne jouent pas un rôle déterminant dans le repliement des protéines, puisque les intermédiaires adoptent des conformations transitoires qui peuvent être éloignées de celles qui mettent en jeu ces ponts disulfure.

b. Nombre de ponts

Exemple : quel est le nombre de combinaisons permettant de former 3 ponts disulfures à partir de 6 cystéines ?

  • la première cystéine peut être appariée avec n'importe laquelle des 5 autres cystéines pour former le premier pont
  • il reste 4 cystéines qui peuvent s'apparier de 3 manières différentes
  • il reste 2 cystéines qui s'apparient.

    Soit : 5 x 3 x 1 = 15 combinaisons

De manière générale :

  • pour n ponts disulfures
  • 2n cystéines

il existe [ (2n)! / 2nn! ] combinaisons.

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La distance entre les 2 carbones α de 2 résidus cystéine impliqués dans un pont disulfure est de 4.2 Å à 7.5 Å.

Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

L'entité structurale formé par 2 cystéines reliées par un pont disulfure s'appelle une cystine.

La formation d'un pont disulfure est une réaction d'oxydo-réduction réversible : cette réversibilité dépend du potentiel rédox du milieu et du pH.

Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

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c. La réaction de formation d'un pont disulfure

Au cours de la réaction d'échange [thiol - disulfure], un anion thiolate R1S- déplace un soufre du pont disulfure R2-S-S-R3.

echange thiol disulfure Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Dans l'état de transition, la charge négative du thiolate est délocalisée sur les 3 atomes de soufre.

Les ponts disulfure sont formés et réduits au sein des protéines par 2 réactions d'échange [thiol - disulfure] avec un agent oxydo-réducteur tel que :

  • le dithiothréitol (DTT oxydé / DTT réduit)
  • le glutathion (GSSG / GSH)

disulfure Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

disulfure Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

La réaction d'échange [thiol - disulfure] peut aussi avoir lieu au sein d'une même protéine : un groupe thiolate d'une protéine peut attaquer un pont disulfure de la même protéine, conduisant à un remaniement des ponts disulfure.

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4. Les protéines disulfide isomerases (PDI) et Ero1p

Les protéines disulfide isomerases (PDI - EC 5.3.4.1) catalysent le ré-arrangement correct dans le réticulum endoplasmique des ponts disulfure des protéines néo-synthétisées.

Ce sont des protéines à plusieurs domaines. Ci-dessous, structure des domaines prolyl 4-hydroxylase de la PDI de Homo sapiens - Kemmink et al. (1996 et 1999).

prolyl hydroxylase disulfure Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Le site actif du domaine prolyl 4-hydroxylase de la PDI est constitué par les 2 cystéines C36GHC39 qui forment un pont disulfure. Codes : PDB 1MEK et 2BJX

Pour oxyder les groupements thiols en disulfure des protéines cibles, les cystéines du site actif de la PDI doivent être maintenues dans l'état oxydé.

Ero1p est une flavoenzyme associée à la membrane qui forment des ponts disulfure et les transfère à la PDI. Cette dernière peut alors oxyder les cystéines des protéines substrats.

Le mécanisme de l'échange [thiol / disulfure] entre Ero1p et la PDI est le suivant :

  • un pont disulfure de Ero1p subit une attaque nucléophile par un anion thiolate issu de la cystéine C36 du site actif de la PDI.
  • l'intermédiaire disulfure mixte résultant subit à son tour une attaque intramoléculaire par un anion thiolate issu de la cystéine C39 du site actif de la PDI.

disulfure Insulin disulphide bridge bond cystine cysteine dithiothreitol glutathion proteine isomerase PDI Ero1p biochimej

Source : Frand et al. (2000)

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Source : Gross et al. (2004)

Les 5 ponts disulfure intra-chaînes de Ero1p
CYS 90 - CYS 349
CYS 100 - CYS 105
CYS 143 - CYS 166
CYS 150 - CYS 295
CYS 352 - CYS 355

Ero1p contient :

  • le motif du site actif : C349XXC352XXC355

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