Mécanisme d'activation du récepteur de la thrombine (RCPG)
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Le récepteur de la thrombine (PAR1 - "Protease-Activated Receptor") est une protéine transmembranaire de 425 acides aminés.

La séquence partielle N-terminale extracellulaire du récepteur est la suivante : SKATN35 ATLDP40 RSFLL45 RNPND50 KYEPF55 WEDEE60

La thrombine est une enzyme qui hydrolyse entre autre la protéine C et la protéine S aux sites suivants :
protéine C : QKDQL DPR / IV
protéine S : TNAYP DLR / SC

En comparant la séquence clivée des substrats de la thrombine avec le fragment N-terminal de son récepteur, que peut-on suggérer ?

Dans la séquence N-terminale du récepteur, on remarque le site potentiel de clivage par la thrombine :

ATLDPR41 / SFLL45

Recepteur  KATNATLDPR SFLLRNPND
    ProtS  ..TNAYPDLR SC.......
    ProtC  ..QKDQLDPR IV.......
Consensus  ..tnaqlDpR sv.......

Le fait que l'hirudine ne possède par d'arginine empêche qu'elle soit clivée par la thrombine qui hydrolyse la liaison peptidique après Arg et Lys.

La thrombine protéolyse spécifiquement la liaison Arg / Gly du fibrinogène, libérant le fibrinopeptide A. La perte de ce petit peptide n'est cependant pas suffisante pour rendre insoluble la molécule de fibrine résultante.

activation recepteur thrombine RCPG hirudine PAR1 fibrin Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood receptor vorapaxar Gq biochimej

Source : Sigma

La thrombine hydrolyse alors un second peptide de la fibrine : le fibrinopeptide B. Les monomères de fibrine polymérisent alors spontanément pour former un gel insoluble.

L'activation du récepteur de la thrombine est testée avec les composés suivants :

  • la thrombine (noté : T)
  • le peptide de synthèse SFLLR NPNDK YEPF (noté : SFLL)
  • le peptide de synthèse FSLLR NPNDK YEPF (noté : FSLL)
  • le peptide de synthèse DFEEI PEEYL qui correspond au fragment C-terminal de l'hirudine sans la Gln (noté Hir)
  • le récepteur naturel de la thrombine (noté : WT)
  • le récepteur de la thrombine muté : R41A

Les résultats obtenus sont présentés dans la figure ci-dessous :

activation recepteur thrombine mutant RCPG hirudine PAR1 Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation receptor vorapaxar Gq biochimej

Sachant que le fragment Hir de l'hirudine et que la séquence YEPF WEDEE60 du récepteur se fixent de manière réversible à la thrombine, que peut-on conclure sur le mécanisme probable d'activation du récepteur ?

Récepteur Thrombine ou peptide Activation Interprétation
aucun thrombine 0 Témoin négatif.
WT : LDPR41 / SFLL45 thrombine 100 Témoin positif.
R41A : LDPA41 / SFLL45 thrombine 0

Pas d'hydrolyse N-terminale du récepteur ?
Ou hydrolyse mais pas de reconnaissance entre la nouvelle extrémité N-terminale et son domaine transmembranaire ?

WT SFLL 100

Le peptide de synthèse SFLL mime celui qui apparait quand il y a coupure du récepteur ==> S est indispensable pour l'autoactivation du récepteur.
---> voir ci-dessous le schéma du mécanisme de l'activation de PAR1 par la thrombine.

R41A SFLL 100 Donne la réponse aux questions ci-dessus : R41 est indispensable pour que l'extrémité N-terminale du récepteur soit coupée par la thrombine.
WT FSLL 0 Confirme que S est indispensable à cette position pour l'autoactivation du récepteur.
R41A FSLL 0 Confirme que S est indispensable à cette position pour l'autoactivation du récepteur.
WT thrombine + Hir 0

Confirme que c'est l'extrémité C-terminale de l'hirudine (DFEEI PEEYL) qui est indispensable pour l'inactivation (irréversible) de la thrombine.
C'est confirmé par la fixation réversible du fragment 52 - 60 du récepteur (YEPF55 WEDEE60).

interaction hirudine thrombine activation recepteur RCPG Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation receptor PAR PAR1 vorapaxar Gq biochimej


Mécanisme de l'autoactivation de PAR1 par la thrombine

La thrombine (sphère verte) hydrolyse un peptide (R41 / SF) près de l'extrémité N-terminale de son récepteur PAR1.

La nouvelle extrémité N-terminale du récepteur SF interagit avec son domaine transmembranaire. Cette interaction modifie la conformation du récepteur ce qui l'active.

interaction hirudine thrombine activation RCPG Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation recepteur receptor mutant PAR PAR1 vorapaxar Gq biochimej

Source : Coughlin (2000)

Le récepteur de la thrombine PAR1 ("Protease-Activated Receptor") est un récepteur couplé à une protéine G (RCPG).

Dans les plaquettes humaines, PAR1 (couplé à une protéine G de la classe Gi/o) active la phosphoinositide 3-kinase (PI3K). Les phosphoinositides sont des dérivés phosphorylés du phosphatidylinositol.

L'activation de PI3K :

  • régule l'activation de l'intégrine αIIbβ3 plaquettaire et donc l'agrégation plaquettaire
  • potentialise l'augmentation de la concentration de calcium intra-plaquettaire

autoactivation thrombine recepteur Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation receptor mutant PAR PAR1 vorapaxar Gq biochimej

Source : Zhang et al. (2012)

Figure ci-dessous : structure de PAR1.

  • précurseur de PAR1 : 425 acides aminés
  • acides aminés 1 à 26 : peptide signal
  • acides aminés 27 - 41 : propetide clivé pour l'activation du récepteur

autoactivation thrombine recepteur Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation receptor mutant PAR PAR1 vorapaxar Gq biochimej

Source : Zhang et al. (2012)

Le vorapaxar (SCH 530348 - molécule en vert) est un antagoniste de PAR1, basé sur un alcaloïde naturel, l'himbacine.

Modèle de fixation du peptide SFLLRN sur PAR1

L'étude de la courbe [force - distance] basée sur la microscopie de force atomique permet de quantifier la force de liaison dynamique de RCPG dans la membrane avec le peptide SFLLRN ("Thrombin Receptor-Activating Peptide" - TRAP) et le vorapaxar.

Le peptide (TRAP - figure ci-dessous) se fixe avec une faible affinité, probablement via les boucles 2 et 3 extracellulaires, aussi bien dans le cas de PAR1 que de PAR1 inhibée par le vorapaxar (PDB : 3VW7).

Coagulation complexe proteique hirudin thrombin blood activation recepteur receptor PAR PAR1 vorapaxar Gq biochimej

Source : Alsteens et al. (2015)

  • En présence de vorapaxar (antagoniste), le peptide ne peut pas se fixer sur le site de haute affinité.
  • En absence de vorapaxar, le peptide peut se fixer sur le site de haute affinité, ce qui active PAR1 et induit la fixation de Gq (une classe de protéines G).

 

Liens Internet et références bibliographiques

Vu et al. (1991) "Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation" Cell 64, 1057 - 1068

Coughlin (2000) "Thrombin signalling and protease-activated receptors" Nature 407, 258 - 264

Article

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De Candia ("2012) "Mechanisms of platelet activation by thrombin: A short history" Thromb. Res. 129, 250 - 256

Zhang et al. (2012) "High-resolution crystal structure of human protease-activated receptor 1" Nature 492, 387 - 392

Alsteens et al. (2015) "Imaging G protein–coupled receptors while quantifying their ligand-binding free-energy landscape" Nat. Met. 12, 845 - 851

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